Summary
Her beskriver vi den store produktion af fedtafledte stromale / stamcelle (ASC) sfæroider ved hjælp af et automatiseret pipetteringssystem til at frø cellesuspensionen og dermed sikre homogenitet af sfæroid størrelse og form. Disse ASC-sfæroider kan bruges som byggesten til 3D-bioprinting-tilgange.
Abstract
Fedtafledte stromale / stamceller (ASC'er) er en underpopulation af celler, der findes i den stromale vaskulære fraktion af humant subkutant fedtvæv anerkendt som en klassisk kilde til mesenkymale stromale / stamceller. Mange undersøgelser er blevet offentliggjort med ASC'er for stilladsbaserede vævstekniske tilgange, som hovedsageligt undersøgte disse cellers opførsel efter deres såning på bioaktive stilladser. Imidlertid dukker stilladsfrie tilgange op til at konstruere væv in vitro og in vivo, hovedsageligt ved hjælp af sfæroider, for at overvinde begrænsningerne ved stilladsbaserede tilgange.
Sfæroider er 3D-mikrotissuer dannet af selvmonteringsprocessen. De kan bedre efterligne arkitekturen og mikromiljøet af indfødte væv, hovedsageligt på grund af forstørrelsen af celle-til-celle og celle-til-ekstracellulære matrixinteraktioner. For nylig udforskes sfæroider hovedsageligt som sygdomsmodeller, lægemiddelscreeningsundersøgelser og byggesten til 3D-bioprinting. Til 3D-bioprintmetoder er talrige sfæroider, homogene i størrelse og form, imidlertid nødvendige for at biofabrikere komplekse vævs- og organmodeller. Derudover er der ringe chance for mikrobiologisk kontaminering, når sfæroider produceres automatisk, hvilket øger metodens reproducerbarhed.
Den store produktion af sfæroider betragtes som det første obligatoriske skridt til udvikling af en biofabrikationslinje, som fortsætter i 3D-bioprintprocessen og afsluttes i fuld modning af vævskonstruktionen i bioreaktorer. Antallet af undersøgelser, der udforskede den store ASC-sfæroidproduktion, er dog stadig knappe sammen med antallet af undersøgelser, der brugte ASC-sfæroider som byggesten til 3D-bioprinting. Derfor har denne artikel til formål at vise den store produktion af ASC-sfæroider ved hjælp af en ikke-klæbende mikromolded hydrogelteknik, der spreder ASC-sfæroider som byggesten til 3D-bioprintmetoder.
Introduction
Sfæroider betragtes som en stilladsfri tilgang inden for vævsteknik. ASC'er er i stand til at danne sfæroider ved selvmonteringsprocessen. Sfæroidens 3D-mikroarkitektur øger ASC'ernes regenerative potentiale, herunder differentieringskapaciteten i flere slægter 1,2,3. Denne forskningsgruppe har arbejdet med ASC-sfæroider til brusk- og knoglevævsteknik 4,5,6. Endnu vigtigere betragtes sfæroider som byggesten i biofabrikation af væv og organer, hovedsageligt på grund af deres fusionskapacitet.
Anvendelsen af sfæroider til vævsdannelse afhænger af tre hovedpunkter: (1) udviklingen af standardiserede og skalerbare robotmetoder til deres biofabrikation7, (2) den systematiske fænotypning af vævssfæroider8, (3) udviklingen af metoder til samling af 3D-væv9. Disse sfæroider kan dannes med forskellige celletyper og opnås ved forskellige metoder, herunder hængende dråbe, reaggregation, mikrofluidik og mikromol 8,9,10. Hver af disse metoder har fordele og ulemper relateret til homogeniteten af størrelse og form af sfæroiderne, genopretning af sfæroiderne efter dannelse, antallet af producerede sfæroider, procesautomatisering, arbejdsintensitet og omkostninger11.
I mikromoldmetoden dispenseres cellerne og deponeres i bunden af mikromolden på grund af tyngdekraften. Den ikke-klæbende hydrogel tillader ikke cellerne at klæbe til bunden, og celle-til-celle-interaktioner fører til dannelsen af en enkelt sfæroid pr. Recession 8,12. Denne biofabrikationsmetode genererer sfæroider af homogen og kontrolleret størrelse, kan robotiseres til storskala produktion på en tidseffektiv måde med minimal indsats og har gode omkostningseffektivitetskritiske faktorer i designet af en biofabrikation af vævsferoid 7,8. Denne metode kan anvendes til at danne sfæroider af enhver celleslægt for at forberede en ny vævstype med forudsigelige, optimale og kontrollerbare egenskaber8.
Biofabrikation defineres som "den automatiserede generering af biologisk funktionelle produkter med strukturel organisation ..."13. Derfor betragtes den automatiserede produktion af sfæroider som det første obligatoriske skridt til udvikling af en biofabrikationslinje, som fortsætter i 3D-bioprintprocessen og afsluttes i fuld modning af det bioprintede væv ved sfæroid fusion. I denne undersøgelse bruger vi et automatiseret pipetteringssystem til at frø cellesuspensionen for at forbedre skalerbarheden af ASC-sfæroid biofabrikation og dermed sikre homogeniteten af sfæroid størrelse og form. Dette papir viser, at det var muligt at producere et stort antal (tusinder) sfæroider, der var nødvendige for 3D-bioprintmetoder til biofabrikat af mere komplekse vævsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De ASC'er, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev tidligere isoleret fra raske humane donorer og kryopræserveret som beskrevet14 ifølge den forskningsetiske komité for Clementino Fraga Filho University Hospital, Federal University of Rio de Janeiro, Brasilien (25818719.4.0000.5257). Se materialetabel for detaljer om alle materialer og udstyr, der anvendes i denne undersøgelse.
1. Trypsinisering af ASC-monolag ved passage tre
- Vævskulturen 175 cm2 kolbe indeholdende monolaget af ASC'er åbnes ved 80% sammenløb, og supernatanten kasseres.
- Der tilsættes 7 ml fosfatbufferet saltvand (PBS, 0,01 M), og monolaget vaskes to gange. Kassér derefter væsken.
- Der tilsættes 5 ml 0,125% trypsin med 0,78 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Derefter inkuberes i 5 minutter ved 37 °C.
- Der tilsættes 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) med 10 % føtalt bovint serum (FBS) til vævskulturens 175 cm2 kolbe, og cellesuspensionen blandes godt med en 10 ml sorologisk pipette.
- Cellesuspensionen høstes med en 10 ml serologisk pipette, og den overføres til et 50 ml centrifugerør. Centrifuger derefter ved 400 × g i 5 minutter for at opnå pelleten af ASC'er. Resuspender cellepillen ved hjælp af DMEM LOW indeholdende 10% FBS.
- Udfør et celleantal ved trypan-udelukkelse.
- Efter tælling skal du tage i alt 1 × 106 ASC'er i et separat 15 ml centrifugerør for at så de 81 recessioner mikromolet med ikke-klæbende hydrogel (i alt 10.000 celler / ml podet her). For at så 256 recessioner af mikromolded ikke-klæbende hydrogel skal du tage i alt 5 × 105 ASC'er i et centrifugerør (i alt 2.500 celler / ml podet her).
2. Mikromolded ikke-klæbende agarosehydrogelfabrikation
- Forbered 50 ml steril opløsning af 2% ultrarent agarose i 0,9% NaCl i ultrarent vand. Autoklave opløsningen i 30 minutter ved 121 °C.
- Tilsæt 500 μL steril 2% ultraren agaroseopløsning i midten af en silikoneform indeholdende 81 eller 256 cirkulære fordybninger.
- Efter 40 minutter udformes den ultrarene agarose fra silikoneformen og placeres i en brønd på en 12-brønd plastplade.
- Der tilsættes 2 ml DMEM LOW i brønden med mikromolded agarose og inkuberes i en inkubator ved 37 °C i en 5 % CO2 -atmosfære i mindst 12 timer, før ASC'erne sås.
3. Biofabrikation af ASC-sfæroider ved hjælp af det automatiserede pipetteringssystem
- Tjek følgende:
- Kontroller, om laminær strømning er tændt, og kabinets luftstrøm fungerer korrekt.
- Kontroller, om udstyret er tilsluttet den korrekte spænding.
- Kontroller, om tabletten er tilsluttet udstyret.
- Kontroller, om højden på kabinetbeskyttelsesglasset er i samme højde som udstyrets sensormærkning.
- Tryk på tænd / sluk-knappen i venstre side af udstyret, og vent på, at tabletten og udstyret starter.
- Placer tipboksene, stativet til centrifugerør og pladen, der indeholder den mikromolede agarosehydrogel, i udstyrets arbejdsområde.
- På tabletten med softwaren åben skal du først klikke på Labware Editor.
- Opret et virtuelt arbejdsbord, og vælg placeringen af pipetterne, tipboksene, stativet til plastrørene og pladerne.
BEMÆRK: Det virtuelle arbejdsbord skal repræsentere tilbehørets fysiske positioner i udstyret. - Klik på knappen Skift til produktion for at inkludere parametrene (se trin 3.10) og kommandoer, som udstyret skal udføre under hele eksperimentet. Vent på, at en værktøjslinje og en produktionsliste åbnes i softwaren.
- For at angive kommandoerne skal du først medtage antallet af prøver, der skal pipetteres, og trække det til produktionslisten.
BEMÆRK: Antallet af prøver er antallet af plastcentrifugerør indeholdende ASC-suspensionen, der skal podes i midten af mikromolene. - Når du har indtastet antallet af prøver, skal du klikke på kommandoknappen Sample Transfer på softwaren for at overføre ASC-suspensionen til brøndene på 12-brøndpladen, der indeholder mikromolene, og trække den til produce list.
- Klik på Egenskaber for at indstille start- og slutpositionerne for udstyret til at overføre prøven.
- Vent på, at softwaren vender tilbage til siden Arbejdstabel . Klik på knappen Indstillinger for at indstille parametrene til automatiseret såning af ASC'erne: i) Aspirationshastighed på 15,4 s-1; ii) Dispenseringshastighed på 1 s-1; iii) Blæseforsinkelse på 0 ms; iv) Blæsehastighed på 15,4 s-1; v) Indledende slag på 100%. Vælg Vand som standardvæsketype.
- Indstil parametrene til at blande ASC'erne for at opnå en homogen suspension: i) Antal cyklusser på 5; ii) Hastighed på 6,5 s-1; iii) Volumen på 300 μL.
- Når du har konfigureret parametrene, skal du tilføje tiden på 40 minutter til produktionslisten.
BEMÆRK: Denne gang er nødvendig for at vente på, at ASC-suspensionen dekanteres i bunden af mikromolden. - I produktionslisten skal du inkludere reagensoverførselsindstillingen for at overføre det sfæroide kulturmedium til de tilsvarende brønde på pladen.
- Gentag trin 3.9-3.11 for at indstille positionen og parameterkonfigurationerne for at overføre det sfæroide kulturmedium.
- Klik på knappen med et fluesymbol på softwarens øverste bjælke for at sikre, at der ikke er nogen programmeringsfejl.
- Klik på knappen Afspil (med et trekantsymbol) på den øverste bjælke i softwaren for at starte programmet.
- Lad udstyret starte som programmeret, og vent på, at det giver en lyd, hvilket indikerer, at det er færdigt.
- Pladen med 12 brønde opsamles, og den inkuberes i en inkubator ved 37 °C, 5 % CO2 i mindst 18 timer, så kuglerne kan dannes fuldstændigt og komprimeres.
- Høst sfæroider manuelt efter 1, 3 og 7 dages kultur til analyse. Skyl mediet manuelt med en mikropipette for at frigøre sfæroiderne fra den mikromolderede ikke-klæbende agarosehydrogel.
- Efter 5 minutter skal du kontrollere under mikroskopet for at afgøre, om sfæroiderne er fuldstændigt frigivet fra den mikromolderede ikke-klæbende agarosehydrogel.
- Saml sfæroiderne manuelt ved hjælp af en mikropipette og overfør dem til et 15 ml centrifugerør.
- Sfæroiderne vaskes mindst to gange med 0,01 M PBS. Vurder levedygtigheden og udfør biomekaniske analyser på de friske sfæroidprøver. Til morfologianalyse (histologi) inkuberes sfæroidprøverne i 4% paraformaldehyd i PBS i mindst 18 timer ved 2-8 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det automatiske pipettesystem kan så ASC-cellesuspensionen i 12 brønde med en 12-brøndplade på 15 minutter. Brug af 81 mikromolded non-adherent hydrogel vil producere 972 sfæroider i slutningen af protokollen. Brug af den 256 mikromolded ikke-klæbende hydrogel vil producere 3.072 sfæroider i slutningen af protokollen. ASC-sfæroider blev analyseret for homogeniteten af deres størrelse og form. ASC-sfæroider fra mikromol med 81 recessioner viste homogen diameter i kulturperioden i modsætning til ASC-sfæroider fra mikromol med 256 recessioner (figur 1C, D). Forholdet mellem de mindste og største diametre (sfæricitet) var tæt på 1 i ASC-sfæroider fra mikromol med 81 og 256 recessioner (figur 1E, F). Resultaterne fra analyser af levedygtighed, morfologi og kraft (figur 2) giver bevis for en vellykket, storstilet produktion af ASC-sfæroider.
Figur 1: ASC-sfæroider viste reproducerbarhed med høj diameter. Repræsentative optiske mikrografer af ASC-sfæroider fra mikromolderede ikke-klæbende hydrogeler med (A) 81 cirkulære recessioner og (B) 256 cirkulære recessioner. (C,D) Sfæroid diameter ved 1, 3 og 7 dage fra fem mikromolderede ikke-klæbende hydrogeler med henholdsvis 81 og 256 cirkulære recessioner. (E,F) Forholdet mellem de mindste og største diametre fra mikromolderede ikke-klæbende hydrogeler med henholdsvis 81 og 256 cirkulære recessioner. For at måle de mindste og største diametre af sfæroiderne blev der erhvervet billeder ugentligt ved hjælp af et optisk mikroskop udstyret med et digitalt kamera. Bredde og længde blev målt ved hjælp af ImageJ-software. Et diameterforhold mellem hver sfæroid blev opnået ved at dividere bredden med længden (sfæroid sfæricitet). I alt 85 sfæroider blev målt fra mikromolderede, ikke-klæbende hydrogeler med 81 cirkulære recessioner, og i alt 160 sfæroider blev målt fra mikromolded, ikke-klæbende hydrogeler med 256 cirkulære recessioner. Dataene udtrykkes som middelværdi ± standardafvigelse. Stjernerne angiver værdier af P opnået ved ANOVA ikke-parametrisk og uparret efterfulgt af flere sammenligninger (**P < 0,001; ****P < 0,0001). Skalastænger = 100 μm. Forkortelse: ASC = fedtvævsstamme/stromale celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: ASC-sfæroider viste høj cellelevedygtighed. (A) Fluorescensmikrografer af levedygtighedsassay af ASC-sfæroider på dag 7 fra mikromolderede, ikke-klæbende hydrogeler med 256 cirkulære recessioner. Levende og døde celler observeres i henholdsvis grøn og rød. Dødskontrol vises i indsatsen. (B) Sektion af en ASC-sfæroid farvet af hæmatoxylin og eosin fra mikromolded, ikke-klæbende hydrogeler med 81 cirkulære recessioner. De faste sfæroidprøver blev indlejret i paraffin, og prøver blev skåret i 5 μm tykkelsessektioner ved hjælp af et mikrotom. (C) Trykmodstandskraft målt i μN af ASC-sfæroider på dag 7. Dataene blev indsamlet fra fem sfæroider og udtrykt som middel ± standardafvigelse i henhold til tidligere beskrevet metode5. Stjernerne angiver værdien af P opnået ved tovejs ANOVA, ikke-parametrisk og uparret, efterfulgt af flere sammenligninger. Skalastænger = 50 μm. Forkortelse: ASC = fedtvævsstamme/stromale celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir præsenterer den store produktion af ASC-sfæroider ved hjælp af et automatiseret pipettesystem. Det kritiske trin i protokollen er at konfigurere softwaren nøjagtigt for at sikre det korrekte volumen af celleophæng, hastighed og afstand til pipettering. Parametrene beskrevet i protokollen blev bestemt efter en række forsøg for at optimere dispenseringen af ASC-cellesuspensionen i brøndene på 12-brøndplader indeholdende de mikromolderede, ikke-klæbende hydrogeler. Optimeringen blev evalueret ved at måle diameteren og sfæriciteten af sfæroider. Arealet og højden af de mikromolderede ikke-klæbende hydrogeler blev brugt til at beregne den ideelle hastighed til dispensering af cellesuspensionen. Hvis cellesuspensionen podes af udstyret med en anden dispenseringshastighed, vil dette direkte påvirke dannelsen af sfæroiderne. Derfor er disse afgørende parametre, der skal optimeres efter forsøg med udstyret. Denne protokol har nogle begrænsninger. Kun såning af ASC'erne i den ikke-klæbende hydrogel i mikromolden kan automatiseres efterfulgt af tilsætning af cellekulturmedium. Systemets funktioner er begrænset af versionen af udstyret og softwaren. Den største fordel ved denne reproducerbare tilgang er imidlertid at producere op til 3.072 ASC-sfæroider - homogene i størrelse og form og levedygtige - med mindre risiko for menneskelige fejl eller forurening. Det store antal biofabrikerede ASC-sfæroider kan indlæses direkte i en 3D-bioprinter for at producere mere komplekse vævsmodeller.
Generelt er det almindeligt kendt, at nøjagtig og automatiseret pipettering spiller en central rolle i automatiseringen af cellekultur. Automatiserede cellekultursystemer muliggør produktion i stor skala og øger teknisk nøjagtighed, reproducerbarhed og proceseffektivitet15. Derfor kan automatiserede systemer lette produktion i stor skala, hvilket er almindeligt og gavnligt for industrielle miljøer16,17. Der er dog få undersøgelser, der beskriver udviklingen af protokoller til automatisering af 3D-cellekultursystemer 7,18,19,20,21.
Mehesz og samarbejdspartnere7 og Meseguer-Ripolles og kolleger21 brugte en lignende protokol til biofabrikation af ASC-sfæroider. I undersøgelsen af Mehesz et al.7 brugte forfatterne det samme automatiserede pipetteringssystem. Imidlertid producerede deres protokol kun 96 sfæroider, mens protokollen udviklet i det nuværende arbejde var i stand til at producere op til 3.072 ASC-sfæroider på én gang, homogene i størrelse og form. Meseguer-Ripolles et al.21 brugte også et automatiseret pipetteringssystem til at producere op til 73 leversfæroider. En anden tilgang, der diskuteres for at fremstille sfæroider i stor skala i dag, er via mikrofluidiske enheder. Imidlertid har de artikler, der er offentliggjort indtil videre, udforsket teknologien til at udvikle bedre enheder, der kan producere sfæroiderne i stedet for at øge skalaen for sfæroidfremstilling 7,20.
En anden metode, der kan bruges til at fremstille et stort antal sfæroider, er ved hjælp af spinnerkolber. Et hovedproblem vedrørende denne teknik er imidlertid vanskeligheden ved at kontrollere størrelsen og formen af sfæroiderne22,23. Derudover blev 3D-bioprinting også allerede anvendt på biofabricate sfæroider i stor skala. I undersøgelsen af Daly og Kelly19 brugte forfatterne en inkjet-teknik til at producere et stort antal sfæroider i polycaprolactonmikrokamre. Sfæroiderne var levedygtige og homogene i størrelse og form.
Hovedanvendelsen af protokollen beskrevet i dette arbejde er at biofabrikere ASC-sfæroider i stor skala, der er nødvendig til 3D-bioprint. Som diskuteret af Mironov og samarbejdspartnere24 vil tusindvis af sfæroider være nødvendige for at biofabrikere komplekse væv og organmodeller. Den automatiserede metode, der er beskrevet i denne protokol, giver mulighed for fremstilling af et stort antal ASC-sfæroider, der kan indlæses direkte i 3D-bioprinteren. Det er også muligt at differentiere disse sfæroider til en ønsket mesodermal vej til at konstruere muskuloskeletale væv. De Moor og samarbejdspartnere25 udviklede en metode med høj kapacitet til fremstilling af et stort antal vaskulariserede sfæroider til fremtidige 3D-bioprintapplikationer.
Udstyret kan ændres for at forbedre protokollen. Nyere versioner af udstyret tillader brugen af et større antal plader, hvilket kan øge antallet af producerede ASC-sfæroider. Den samme nylige version tillader nøjagtig stabling af pladerne, og dette ville også give en bedre effektivitet af protokollen. Afslutningsvis viste vi med succes en protokol, der tillader biofabrikation op til 3.072 ASC-sfæroider homogene i størrelse og form på 15 minutter, og at dette betragtes som det første skridt til at opbygge en biofabrikationslinje til tissue engineering applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO, RJ, Brasilien) for brugen af deres faciliteter. Denne undersøgelse blev delvist støttet af Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support of the State of Rio de Janeiro (Faperj) (finanskode: E26/202.682/2018 og E-26/010.001771/2019, National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) (finanskode: 307460/2019-3) og Office of Naval Research (ONR) (finanskode: N62909-21-1-2091). Dette arbejde blev delvist støttet af National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
References
- Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
- Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
- Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
- Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
- Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
- Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
- Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).
- Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).
- Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
- Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).
- Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
- Doulgkeroglou, M. -K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
- Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).
- Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
- Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).
- Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).
- Lee, G. -H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).
- Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
- De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
