Summary
ここでは、自動ピペッティングシステムを使用して細胞懸濁液を播種し、スフェロイドのサイズと形状の均質性を確保する脂肪由来間質/幹細胞(ASC)スフェロイドの大規模生産について説明します。これらのASCスフェロイドは、3Dバイオプリンティングアプローチのビルディングブロックとして使用できます。
Abstract
脂肪由来間質/幹細胞(ASC)は、間葉系間質/幹細胞の古典的な供給源として認識されているヒト皮下脂肪組織の間質血管画分に見られる細胞の亜集団である。足場ベースの組織工学的アプローチのためのASCを用いた多くの研究が発表されており、主に生理活性足場に播種した後のこれらの細胞の挙動を調査した。しかし、足場ベースのアプローチの限界を克服するために、主にスフェロイドを使用して、イン ビトロ および インビボで組織を設計するための足場フリーアプローチが出現しています。
回転楕円体は、自己組織化プロセスによって形成される3Dマイクロ組織である。それらは、主に細胞間および細胞対細胞間マトリックス相互作用の倍率のために、天然組織のアーキテクチャおよび微小環境をよりよく模倣することができる。最近、スフェロイドは主に疾患モデル、薬物スクリーニング研究、および3Dバイオプリンティングのビルディングブロックとして探求されています。しかし、3Dバイオプリンティングアプローチでは、複雑な組織および臓器モデルをバイオファブリケーションするために、サイズと形状が均質な多数の回転楕円体が必要です。さらに、スフェロイドが自動的に生成される場合、微生物学的汚染の可能性はほとんどなく、方法の再現性が向上します。
スフェロイドの大規模生産は、3Dバイオプリンティングプロセスで継続し、バイオリアクター内の組織構築物の完全な成熟で完了するバイオファブリケーションラインを開発するための最初の必須ステップと考えられています。しかし、ASCスフェロイドの大規模な生産を調査した研究の数は、ASCスフェロイドを3Dバイオプリンティングのビルディングブロックとして使用した研究の数とともに、まだ少ないです。したがって、本稿は、ASCスフェロイドを3Dバイオプリンティングアプローチのビルディングブロックとして広げる非接着マイクロモールドヒドロゲル技術を用いたASCスフェロイドの大規模生産を示すことを目的とする。
Introduction
回転楕円体は、組織工学における足場のないアプローチと考えられている。ASCは、自己組織化プロセスによって回転楕円体を形成することができる。回転楕円体の3Dマイクロアーキテクチャは、複数の系統への分化能力を含むASCの再生可能性を高めます1,2,3。この研究グループは、軟骨および骨組織工学のためのASCスフェロイド4,5,6に取り組んできました。さらに重要なことに、スフェロイドは、主にその融合能力のために、組織および器官のバイオファブリケーションにおけるビルディングブロックと考えられている。
組織形成のためのスフェロイドの使用は、(1)それらのバイオファブリケーションのための標準化されたスケーラブルなロボット法の開発7、(2)組織スフェロイド8の系統的表現型決定、(3)3D組織の組み立てのための方法の開発9の3つの主要なポイントに依存する。これらのスフェロイドは、異なる細胞型で形成することができ、吊り下げドロップ、再凝集、マイクロ流体、およびマイクロモールド8、9、10を含む様々な方法を介して得ることができる。これらの方法の各々は、スフェロイドのサイズおよび形状の均質性、形成後のスフェロイドの回収、生成されるスフェロイドの数、プロセスの自動化、労働強度、およびコスト11に関連する長所および短所を有する。
マイクロモールド法では、細胞は重力のためにマイクロモールドの底部に分配され、堆積される。非接着性ヒドロゲルは、細胞が底部に接着することを許さず、細胞間相互作用は、後退8,12当たりの単一のスフェロイドの形成をもたらす。このバイオファブリケーション方法は、均質で制御されたサイズのスフェロイドを生成し、最小限の労力で時間効率の高い方法で大規模生産のためにロボット化することができ、組織スフェロイドのバイオファブリケーションの設計において優れた費用対効果 - 重要な要素を有する7,8。この方法は、任意の細胞系譜のスフェロイドの形成に適用して、予測可能、最適、および制御可能な特性を有する新しい組織型を調製することができる8。
バイオファブリケーションは、「構造組織を有する生物学的に機能的な製品の自動生成...」13と定義されています。したがって、スフェロイドの自動生産は、3Dバイオプリンティングプロセスを継続し、スフェロイド融合によるバイオプリント組織の完全な成熟で終了するバイオファブリケーションラインを開発するための最初の必須ステップと考えられています。この研究では、ASCスフェロイドバイオファブリケーションのスケーラビリティを向上させるために、自動ピペッティングシステムを使用して細胞懸濁液を播種し、スフェロイドのサイズと形状の均質性を確保します。この論文は、より複雑な組織モデルをバイオファブリケーションするための3Dバイオプリンティングアプローチに必要な多数の(数千)スフェロイドを生成することが可能であったことを示している。
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Protocol
この研究で使用されたASCは、ブラジルのリオデジャネイロ連邦大学クレメンティーノ・フラガ・フィーリョ大学病院の研究倫理委員会(25818719.4.0000.5257)によると、健康なヒトドナーから以前に単離され、凍結保存されていた14。この研究で使用されたすべての材料と機器の詳細については、材料の表を参照してください。
1. 通路3におけるASC単層のトリプシン処理
- ASCsの単層を80%コンフルエントで入れたフラスコに組織培養175cm2を開き、上清を捨てた。
- 7 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、0.01 M)を加え、単層を2回洗浄する。次に、液体を捨てる。
- 5 mL の 0.125% トリプシンを 0.78 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) と共に加えます。次に、37°Cで5分間インキュベートする。
- 組織培養175cm2フラスコに10%ウシ胎児血清(FBS)を含む10mLの低グルコースダルベッコ改変イーグル培地(DMEM LOW)を加え、細胞懸濁液を10mLの血清学的ピペットでよく混合する。
- 10 mLの血清学的ピペットで細胞懸濁液を回収し、50 mLの遠沈管に移します。次に、400× g で5分間遠心分離し、ASCsのペレットを得た。細胞ペレットを10%FBSを含むDMEM LOW を用いて再懸濁する。
- トリパン排除による細胞カウントを行う。
- カウント後、別の15 mL遠沈管に合計1 ×106 ASCを採取し、非付着性ヒドロゲルでマイクロ成形された81の凹みに播種します(ここでは合計10,000細胞/mLを播種します)。マイクロモールド非付着性ヒドロゲルを256回播種するには、合計5×105ASC を遠沈管に入れます(ここでは合計2,500細胞/ mLを播種します)。
2. マイクロモールド非付着性アガロースヒドロゲル作製
- 超純水中の0.9%NaCl中の2%超高純度アガロースの滅菌溶液50mLを調製する。この溶液をオートクレーブで121°Cで30分間処理する。
- 81または256個の円形凹部を含むシリコーンモールドの中央に、滅菌2%超高純度アガロース溶液500μLを加える。
- 40分後、シリコーン型から超高純度アガロースを型外し、12穴プラスチックプレートのウェルに入れます。
- マイクロモールドアガロースと共にウェルに2mLのDMEM LOW を加え、ASCを播種する前に、5%CO2雰囲気中で37°Cのインキュベーター内で少なくとも12 時間インキュベートする。
3. 自動ピペッティングシステムを用いたASCスフェロイドのバイオファブリケーション
- 次の点を確認してください。
- 層流がオンになっているかどうか、およびキャビネットのエアフローが正しく機能しているかどうかを確認します。
- 機器が正しい電圧に接続されているかどうかを確認します。
- タブレットが機器に接続されているかどうかを確認します。
- キャビネット保護ガラスの高さが、機器のセンサーマーキングと同じ高さにあるかどうかを確認します。
- 機器の左側にある オン/オフ ボタンを押し、タブレットと機器が起動するのを待ちます。
- チップボックス、遠沈管用ラック、およびマイクロモールドアガロースヒドロゲルを含むプレートを装置のワークスペースに配置します。
- ソフトウェアを開いたタブレットで、まず Labwareエディタをクリックします。
- 仮想作業台をセットアップし、ピペット、チップボックス、プラスチックチューブ用ラック、プレートの位置を選択します。
メモ: 仮想作業台は、機器内のアクセサリの物理的な位置を表す必要があります。 - [生成に切り替え] ボタンをクリックして、実験中に機器が実行するパラメーター (ステップ 3.10 を参照) とコマンドを含めます。ツールバーとプロデュースリストがソフトウェアで開くのを待ちます。
- 最初に、コマンドを示すために、ピペット化するサンプルの数を含め、それを 「生成リスト」にドラッグします。
注:サンプル数は、マイクロモールドの中央に播種されるASC懸濁液を含むプラスチック遠心分離管の数です。 - サンプル数を入力したら、ソフトウェアの サンプル転送 コマンドボタンをクリックして、ASC懸濁液をマイクロモールドを含む12ウェルプレートのウェルに移し、 生産リストにドラッグします。
- [プロパティ]をクリックして、サンプルを移送する装置の開始位置と終了位置を設定します。
- ソフトウェアが[作業テーブル]ページに戻るのを待ちます。[オプション]ボタンをクリックして、ASCの自動シードのためのパラメータを設定します:i)15.4 s-1の吸引速度。ii)1 s-1の分配速度;iii)0ミリ秒のブロー遅延。iv)15.4 s-1のブロー速度。v)100%の初期ストローク。標準液体タイプとして水を選択します。
- ASCを混合して均質な懸濁液を得るためのパラメータを設定する:i)サイクル数5;ii)6.5 s-1の速度;iii)300μLの容量。
- パラメーターを設定した後、生産リストに 40 分の時間を追加します。
メモ:この時間は、ASCサスペンションがマイクロモールドの底部でデカントするのを待つために必要です。 - 生産リストには、スフェロイド培養培地をプレートの対応するウェルに移すための試薬移送オプションを含めます。
- 手順 3.9 ~ 3.11 を繰り返して、スフェロイド培養培地を移すための位置とパラメータの設定を設定します。
- ソフトウェアのトップバーにチェックマークが付いたボタンをクリックして、プログラミングエラーがないことを確認します。
- ソフトウェアのトップバーにある [再生 ]ボタン(三角形の記号付き)をクリックして、プログラムを起動します。
- プログラムどおりに機器を起動し、終了したことを示す音が鳴るのを待ちます。
- 12ウェルプレートを集め、スフェロイドが完全に形成されコンパクトになるように、37°C、5%CO2 のインキュベーター内で少なくとも18時間インキュベートします。
- 分析のために培養の1、3、および7日後にスフェロイドを手動で収穫する。マイクロピペットで培地を手動で洗い流し、マイクロモールド非付着性アガロースヒドロゲルからスフェロイドを遊離させる。
- 5分後、顕微鏡下でスフェロイドがマイクロモールド非付着性アガロースヒドロゲルから完全に放出されるかどうかを決定する。
- マイクロピペットを使用して手動でスフェロイドを収集し、15mLの遠沈管に移します。
- 回転楕円体を0.01M PBSで少なくとも2回洗浄する。生存率を評価し、新鮮な回転楕円体サンプルに対して生体力学的分析を実行します。形態解析(組織学)のために、スフェロイドサンプルをPBS中の4%パラホルムアルデヒド中で2〜8°Cで少なくとも18時間インキュベートする。
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Representative Results
自動ピペットシステムは、ASC細胞懸濁液を1つの12ウェルプレートの12ウェルに15分で播種することができる。81マイクロモールド非接着ヒドロゲルを使用すると、プロトコルの最後に972個のスフェロイドが生成されます。256マイクロモールド非接着ヒドロゲルを使用すると、プロトコルの最後に3,072個のスフェロイドが生成されます。ASCスフェロイドを、そのサイズおよび形状の均質性について分析した。81回の後退を伴うマイクロモールドからのASCスフェロイドは、256回の後退を有するマイクロモールドのASCスフェロイドとは対照的に、培養期間中に均質な直径を示した(図1C,D)。最小直径と最大直径の比(真球度)は、81および256の不況を有するマイクロモールドのASC回転楕円体において1に近かった(図1E、F)。生存率、形態、および力(図2)解析の結果は、ASC回転楕円体の成功した大規模生産の証拠を提供する。
図1:ASCスフェロイドは高い直径再現性を示した。 (A)81の円形後退および(B)256の円形後退を有するマイクロモールド非接着ヒドロゲルからのASCスフェロイドの代表的な光学顕微鏡写真。(C,D)5つのマイクロモールド非接着ヒドロゲルからそれぞれ81および256の円形後退を有する1、3、および7日目におけるスフェロイド直径。(E,F)マイクロモールド非接着ヒドロゲルからの最小および最大の直径の比は、それぞれ81および256の円形後退を有する。回転楕円体の最小および最大の直径を測定するために、デジタルカメラを搭載した光学顕微鏡を用いて毎週画像を取得しました。幅及び長さは、ImageJソフトウェアを用いて測定した。各スフェロイドの直径比は、幅を長さで割ることによって得られた(スフェロイド真球度)。合計85個のスフェロイドが、81個の円形後退を有するマイクロモールドの非接着性ヒドロゲルから測定され、合計160個のスフェロイドが、256個の円形後退を有するマイクロモールドの非接着性ヒドロゲルから測定された。データは平均±標準偏差で表されます。アスタリスクは、ANOVA ノンパラメトリックで得られた P の値を示し、その後に多重比較が続く非ペア (**P < 0.001; ****P < 0.0001)。スケールバー = 100 μm。略語: ASC = 脂肪組織幹/間質細胞。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ASCスフェロイドは高い細胞生存率を示した 。 (A)256回の円後退を有する微細成形された非接着性ヒドロゲルからの7日目のASCスフェロイドの生存率アッセイの蛍光顕微鏡写真。生細胞および死細胞は、それぞれ緑色および赤色で観察される。デスコントロールはインセットに表示されます。(B)81の円形後退を有するマイクロモールドされた非接着性ヒドロゲルからのヘマトキシリンおよびエオジンによって染色されたASCスフェロイドの切片。固定されたスフェロイドサンプルをパラフィンに包埋し、サンプルをミクロトームを用いて5μm厚の切片に切断した。(C)7日目にASCスフェロイドのμNで測定した圧縮抵抗力。データは5つのスフェロイドから収集され、前述の方法論5に従って、平均±標準偏差として表された。アスタリスクは、ノンパラメトリックおよびペアなしの二元配置分散分析によって得られた P の値を示し、その後に多重比較が続きます。スケールバー = 50 μm。略語: ASC = 脂肪組織幹/間質細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この論文では、自動ピペットシステムを使用したASCスフェロイドの大規模生成について説明します。このプロトコルの重要なステップは、ピペッティングのための細胞懸濁液の正しい量、速度、および距離を保証するためにソフトウェアを正確にセットアップすることです。プロトコールに記載されたパラメータは、マイクロモールドされた非付着性ヒドロゲルを含む12ウェルプレートのウェルへのASC細胞懸濁液の分配を最適化するための多数の試行の後に決定された。最適化は、スフェロイドの直径および真球度を測定することによって評価した。マイクロモールド非接着ヒドロゲルの面積および高さを用いて、細胞懸濁液を分配する理想的な速度を計算した。細胞懸濁液が異なる分配速度で装置によって播種される場合、これはスフェロイドの形成に直接影響する。したがって、これらは機器での試行後に最適化されるべき重要なパラメータです。このプロトコルにはいくつかの制限があります。マイクロモールド内の非付着性ヒドロゲル中のASCsの播種のみを自動化することができ、続いて細胞培養培地を添加することができる。システムの機能は、機器とソフトウェアのバージョンによって制限されます。しかし、この再現可能なアプローチの主な利点は、最大3,072個のASCスフェロイド(サイズと形状が均質で実行可能)を、人為的ミスや汚染のリスクが軽微に抑えて製造できることです。多数のバイオハブASCスフェロイドを3Dバイオプリンターに直接ロードして、より複雑な組織モデルを生成することができます。
一般に、正確で自動化されたピペッティングが細胞培養の自動化において中心的な役割を果たすことは広く知られている。自動細胞培養システムは、大規模な生産を可能にし、技術的精度、再現性、およびプロセス効率を向上させます15。したがって、自動化されたシステムは、産業環境にとって一般的で有益な大規模生産を促進することができる16,17。しかしながら、3D細胞培養システムを自動化するプロトコルの開発を記載した研究はほとんどない7、18、19、20、21。
Meheszと共同研究者7およびMeseguer-Ripollesら21は、ASC回転楕円体をバイオファブリケーションするために同様のプロトコルを使用した。Meheszら7による研究では、著者らは同じ自動ピペッティングシステムを使用した。しかし、彼らのプロトコルは96個のスフェロイドしか生成しなかったのに対し、本研究で開発されたプロトコルは、サイズと形状が均質な最大3,072個のASCスフェロイドを一度に生成することができた。Meseguer-Ripolles et al.21はまた、自動ピペッティングシステムを使用して最大73個の肝臓回転楕円体を生成した。今日、スフェロイドを大規模に製造するために議論されている別のアプローチは、マイクロ流体デバイスを介している。しかし、これまでに発表された論文は、回転楕円体製造の規模を増やすのではなく、回転楕円体を産生できるより良いデバイスを開発する技術を探求してきました7,20。
多数のスフェロイドを作製するために使用できる別の方法は、スピナーフラスコを使用することである。しかしながら、この技術に関する1つの主な問題は、回転楕円体22,23のサイズおよび形状を制御することの難しさである。さらに、3Dバイオプリンティングは、すでに大規模にバイオファブリケーションスフェロイドにも適用されていた。Daly and Kelly19による研究では、著者らはインクジェット技術を使用して、ポリカプロラクトンマイクロチャンバー内で多数のスフェロイドを作製した。回転楕円体は生存可能で、サイズと形状が均質であった。
この研究で説明したプロトコルの主な用途は、3Dバイオプリンティングに必要なASCスフェロイドを大規模にバイオファブリケーションすることです。Mironovと共同研究者24が議論したように、複雑な組織や臓器モデルをバイオファブリケーションするには、何千もの回転楕円体が必要になるでしょう。このプロトコルで説明されている自動化された方法は、3Dバイオプリンタに直接ロードすることができる多数のASCスフェロイドの製造を可能にする。これらのスフェロイドを所望の中胚葉経路に分化させて筋骨格組織を設計することもできる。De Moorと共同研究者25 は、将来の3Dバイオプリンティングアプリケーション向けに多数の血管化スフェロイドを製造するためのハイスループット法を開発しました。
装置はプロトコルを改善するために変更することができる。装置のより最近のバージョンでは、より多くのプレートの使用が可能になり、生成されるASCスフェロイドの数を増やすことができます。この同じ最新バージョンでは、プレートの正確な積み重ねが可能になり、プロトコルの効率も向上します。結論として、我々は、最大3,072個のASCスフェロイドのサイズと形状が均質な15分でバイオファブリケーションを可能にするプロトコルを示すことに成功し、これがティッシュエンジニアリングアプリケーション用のバイオファブリケーションラインを構築するための最初のステップと考えられることを示した。
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Disclosures
著者は利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
我々は、国立計量・品質・技術研究所(INMETRO、RJ、ブラジル)の施設の使用に感謝する。この研究は、リオデジャネイロ州研究支援のためのカルロス・シャガス・フィーリョ財団(Faperj)(財務コード:E26/202.682/2018およびE-26/010.001771/2019)、国立科学技術開発評議会(CNPq)(財務コード:307460/2019-3)、および海軍研究局(ONR)(財務コード:N62909-21-1-2091)によって部分的に支援されました。この研究は、国立再生医療科学技術センター-INCTリジェネラ(http://www.inctregenera.org.br/)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
References
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