Summary
Burada, hücre süspansiyonunu tohumlamak için otomatik bir pipetleme sistemi kullanarak adipoz türevli stromal/kök hücre (ASC) sferoidlerinin büyük ölçekli üretimini açıklıyoruz, böylece küresel boyut ve şeklin homojenliğini sağlıyoruz. Bu ASC sferoidleri, 3D biyobaskı yaklaşımları için yapı taşları olarak kullanılabilir.
Abstract
Adipoz kaynaklı stromal/kök hücreler (ASC'ler), klasik mezenkimal stromal/kök hücre kaynağı olarak kabul edilen insan deri altı yağ dokusunun stromal vasküler fraksiyonunda bulunan hücrelerin bir alt popülasyonudur. İskele tabanlı doku mühendisliği yaklaşımları için ASC'lerle birçok çalışma yayınlanmıştır, bu da esas olarak bu hücrelerin biyoaktif iskelelerde tohumlandıktan sonraki davranışlarını araştırmıştır. Bununla birlikte, iskele tabanlı yaklaşımların sınırlamalarının üstesinden gelmek için in vitro ve in vivo dokuları mühendislik yapmak için, esas olarak sferoidler kullanarak, iskelesiz yaklaşımlar ortaya çıkmaktadır.
Sferoidler, kendi kendine montaj işlemi ile oluşan 3D mikrodokulardır. Doğal dokuların mimarisini ve mikro ortamını, esas olarak hücreden hücreye ve hücreden hücre dışı matris etkileşimlerinin büyütülmesinden dolayı daha iyi taklit edebilirler. Son zamanlarda, sferoidler esas olarak hastalık modelleri, ilaç tarama çalışmaları ve 3D biyobaskı için yapı taşları olarak araştırılmaktadır. Bununla birlikte, 3D biyobaskı yaklaşımları için, karmaşık doku ve organ modellerini biyofabrikasyon yapmak için boyut ve şekil olarak homojen çok sayıda sferoid gereklidir. Ek olarak, sferoidler otomatik olarak üretildiğinde, mikrobiyolojik kontaminasyon için çok az şans vardır ve bu da yöntemin tekrarlanabilirliğini arttırır.
Büyük ölçekli sferoidlerin üretimi, 3D biyobaskı sürecinde devam eden ve biyoreaktörlerdeki doku yapısının tam olgunlaşmasında biten bir biyofabrikasyon hattı geliştirmek için ilk zorunlu adım olarak kabul edilir. Bununla birlikte, büyük ölçekli ASC sferoid üretimini araştıran çalışmaların sayısı, ASC sferoidlerini 3D biyobaskı için yapı taşları olarak kullanan çalışmaların sayısı ile birlikte hala azdır. Bu nedenle, bu makale, ASC sferoidlerini 3D biyobaskı yaklaşımları için yapı taşları olarak yayan yapışkan olmayan mikrokalıplanmış bir hidrojel tekniği kullanılarak ASC sferoidlerinin büyük ölçekli üretimini göstermeyi amaçlamaktadır.
Introduction
Sferoidler, doku mühendisliğinde iskelesiz bir yaklaşım olarak kabul edilir. ASC'ler, kendi kendine montaj işlemi ile sferoidler oluşturabilir. Küreselin 3D mikromimarisi, çoklu soylarafarklılaşma kapasitesi de dahil olmak üzere ASC'lerin rejeneratif potansiyelini arttırır 1,2,3. Bu araştırma grubu, kıkırdak ve kemik dokusu mühendisliği 4,5,6 için ASC sferoidleri ile çalışmaktadır. Daha da önemlisi, sferoidler, esas olarak füzyon kapasiteleri nedeniyle, doku ve organların biyofabrikasyonunda yapı taşları olarak kabul edilir.
Doku oluşumu için sferoidlerin kullanımı üç ana noktaya bağlıdır: (1) biyofabrikasyonları için standartlaştırılmış ve ölçeklenebilir robotik yöntemlerin geliştirilmesi7, (2) doku sferoidlerinin sistematik fenotiplenmesi8, (3) 3D dokuların montajı için yöntemlerin geliştirilmesi9. Bu sferoidler farklı hücre tipleri ile oluşturulabilir ve asılı damla, yeniden agregasyon, mikroakışkanlar ve mikrokalıplar 8,9,10 dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle elde edilebilir. Bu yöntemlerin her birinin, sferoidlerin boyut ve şeklinin homojenliği, sferoidlerin oluştuktan sonra geri kazanımı, üretilen sferoid sayısı, proses otomasyonu, emek yoğunluğu ve maliyetleri ile ilgili avantaj ve dezavantajları vardır11.
Mikrokalıp yönteminde, hücreler yerçekimi nedeniyle mikro kalıbın dibinde dağıtılır ve biriktirilir. Yapışkan olmayan hidrojel, hücrelerin tabana yapışmasına izin vermez ve hücreden hücreye etkileşimler, durgunluk başına tek bir sferoid oluşumuna yol açar 8,12. Bu biyofabrikasyon yöntemi, homojen ve kontrollü boyutta sferoidler üretir, büyük ölçekli üretim için minimum çabayla zaman verimli bir şekilde robotlaştırılabilir ve doku sferoidinin biyofabrikasyonunun tasarımında iyi maliyet etkinliği-kritik faktörlere sahiptir 7,8. Bu yöntem, öngörülebilir, optimal ve kontrol edilebilir özelliklere sahip yeni bir doku tipi hazırlamak için herhangi bir hücre soyunun sferoidlerini oluşturmak için uygulanabilir8.
Biyofabrikasyon, "biyolojik olarak işlevsel ürünlerin yapısal organizasyonla otomatik olarak üretilmesi" olarak tanımlanmaktadır."13. Bu nedenle, sferoidlerin otomatik üretimi, 3D biyobaskı sürecinde devam eden ve sferoid füzyon ile biyobaskılı dokunun tam olgunlaşmasında biten bir biyofabrikasyon hattı geliştirmek için ilk zorunlu adım olarak kabul edilir. Bu çalışmada, ASC sferoid biyofabrikasyonunun ölçeklenebilirliğini artırmak için, hücre süspansiyonunu tohumlamak için otomatik bir pipetleme sistemi kullanıyoruz, böylece küresel boyut ve şeklin homojenliğini sağlıyoruz. Bu makale, daha karmaşık doku modellerini biyofabrikasyona dönüştürmek için 3D biyobaskı yaklaşımları için gerekli olan çok sayıda (binlerce) sferoid üretmenin mümkün olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan ASC'ler daha önce sağlıklı insan donörlerinden izole edilmiş ve Brezilya Rio de Janeiro Federal Üniversitesi, Clementino Fraga Filho Üniversitesi Hastanesi Araştırma Etik Komitesi'ne göre14'te açıklandığı gibi kriyokorunmuştur (25818719.4.0000.5257). Bu çalışmada kullanılan tüm malzeme ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakınız.
1. Üçüncü pasajda ASC tek katmanının tripsinizasyonu
- ASC'lerin tek katmanını içeren 175cm2 uzunluğundaki doku kültürünü %80 birleşimde açın ve süpernatanı atın.
- 7 mL fosfat tamponlu salin (PBS, 0,01 M) ekleyin ve tek katmanı iki kez yıkayın. Ardından, sıvıyı atın.
- 0.78 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile 5 mL% 0.125 tripsin ekleyin. Daha sonra, 37 ° C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- 175cm2 şişe doku kültürüne %10 fetal sığır serumu (FBS) ile 10 mL düşük glukozlu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM LOW) ekleyin ve hücre süspansiyonunu 10 mL'lik bir sörolojik pipetle iyice karıştırın.
- Hücre süspansiyonunu 10 mL'lik bir serolojik pipetle toplayın ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, ASC'lerin peletini elde etmek için 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj yapın. % 10 FBS içeren DMEM LOW kullanarak hücre peletini yeniden askıya alın.
- Trypan dışlamasıyla hücre sayımı gerçekleştirin.
- Saydıktan sonra, yapışmaz hidrojel ile mikrokalıplanmış 81 durgunluğu tohumlamak için ayrı bir 15 mL santrifüj tüpünde toplam 1 × 106 ASC alın (burada tohumlanan toplam 10.000 hücre / mL). Mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojelin 256 durgunluğunu tohumlamak için, bir santrifüj tüpüne toplam 5 × 105 ASC alın (burada tohumlanan toplam 2.500 hücre / mL).
2. Mikrokalıplanmış yapışkan olmayan agaroz hidrojel imalatı
- Ultra saf suda% 0.9 NaCl'de% 2 ultrasaf agarozun 50 mL'lik steril bir çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi 121 °C'de 30 dakika otoklav yapın.
- 81 veya 256 dairesel girinti içeren bir silikon kalıbın ortasına 500 μL steril% 2 ultrasaf agaroz çözeltisi ekleyin.
- 40 dakika sonra, ultra saf agarozu silikon kalıptan çıkarın ve 12 delikli plastik plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin.
- Mikromolde agaroz ile kuyuya 2 mL DMEM LOW ekleyin ve ASC'leri tohumlamadan önce en az12 saat boyunca% 5 CO 2 atmosferinde 37 ° C'de bir inkübatörde inkübe edin.
3. Otomatik pipetleme sistemi kullanılarak ASC sferoidlerinin biyofabrikasyonu
- Aşağıdakileri kontrol edin:
- Laminer akışın açık olup olmadığını ve kabinin hava akışının düzgün çalışıp çalışmadığını kontrol edin.
- Ekipmanın doğru voltaja bağlı olup olmadığını kontrol edin.
- Tabletin ekipmana bağlı olup olmadığını kontrol edin.
- Kabin koruma camının yüksekliğinin, ekipmanın sensör işaretiyle aynı yükseklikte olup olmadığını kontrol edin.
- Ekipmanın sol tarafındaki Açma/Kapama düğmesine basın ve tabletin ve ekipmanın başlamasını bekleyin.
- Uç kutularını, santrifüj tüpleri için rafı ve mikrokalıplanmış agaroz hidrojelini içeren plakayı ekipmanın çalışma alanına yerleştirin.
- Yazılımın açık olduğu tablette, önce Labware Editor'a tıklayın.
- Sanal bir çalışma masası kurun ve pipetlerin, uç kutularının, plastik tüplerin rafının ve plakaların konumlarını seçin.
NOT: Sanal çalışma masası, ekipmandaki aksesuarların fiziksel konumlarını temsil etmelidir. - Ekipmanın deney boyunca gerçekleştireceği parametreleri (bkz. adım 3.10) ve komutları dahil etmek için Üretime Geç'e tıklayın düğmesine tıklayın. Yazılımda bir araç çubuğunun ve bir Üretim Listesinin açılmasını bekleyin.
- Başlangıçta, komutları belirtmek için, pipetlenecek örneklerin sayısını ekleyin ve Üretme Listesi'ne sürükleyin.
NOT: Numune sayısı, mikro kalıpların ortasına tohumlanacak ASC süspansiyonunu içeren plastik santrifüj tüplerinin sayısıdır. - Numune sayısını girdikten sonra, ASC süspansiyonunu mikro kalıpları içeren 12 delikli plakanın kuyularına aktarmak için yazılımdaki Numune Aktarımı komut düğmesine tıklayın ve Ürün Listesi'ne sürükleyin.
- Ekipmanın numuneyi aktarması için başlangıç ve bitiş konumlarını ayarlamak üzere Özellikler'e tıklayın.
- Yazılımın Çalışma Masası sayfasına dönmesini bekleyin. ASC'lerin otomatik tohumlama parametrelerini ayarlamak için Seçenekler düğmesine tıklayın: i) 15.4 s-1 Aspirasyon Hızı; ii) 1 s-1 Dağıtım Hızı; iii) 0 ms'lik Darbe Gecikmesi; iv) 15.4 s-1 Üfleme Hızı; v) %100 İlk İnme. Standart Sıvı Türü olarak Su'yu seçin.
- Homojen bir süspansiyon elde etmek için ASC'leri karıştırmak üzere parametreleri ayarlayın: i) 5'lik Döngü Sayısı; ii) 6,5 s-1 hızı; iii) 300 μL'lik hacim.
- Parametreleri ayarladıktan sonra, Üretim Listesi'ne 40 dakikalık Süre ekleyin.
NOT: Bu süre, ASC süspansiyonunun mikro kalıbın dibinde sönmesini beklemek için gereklidir. - Ürün Listesi'nde, küresel kültür ortamını plakanın karşılık gelen kuyucuklarına aktarmak için Reaktif Transferi seçeneğini ekleyin.
- Küresel kültür ortamını aktarmak üzere konum ve parametre yapılandırmalarını ayarlamak için 3.9-3.11 arasındaki adımları yineleyin.
- Programlama hatası olmadığından emin olmak için yazılımın üst çubuğunda bir kontrol sembolü bulunan düğmeye tıklayın.
- Programı başlatmak için yazılımın üst çubuğundaki Oynat düğmesine (üçgen sembolü ile) tıklayın.
- Ekipmanın programlandığı gibi başlamasına izin verin ve bittiğini belirten bir ses çıkarmasını bekleyin.
- 12 delikli plakayı toplayın ve sferoidlerin tamamen oluşması ve kompakt olması için 37 ° C'de,% 5 CO2'de en az 18 saat boyunca bir inkübatörde inkübe edin.
- Analiz için 1, 3 ve 7 günlük kültürden sonra sferoidleri manuel olarak hasat edin. Sferoidleri mikrokalıplanmış yapışkan olmayan agaroz hidrojelinden kurtarmak için ortamı bir mikropipetle manuel olarak yıkayın.
- 5 dakika sonra, sferoidlerin mikrokalıplanmış yapışkan olmayan agaroz hidrojelinden tamamen salınıp salınmadığını belirlemek için mikroskop altında kontrol edin.
- Bir mikropipet kullanarak sferoidleri manuel olarak toplayın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Sferoidleri 0.01 M PBS ile en az iki kez yıkayın. Canlılığı değerlendirin ve taze küresel numuneler üzerinde biyomekanik analizler gerçekleştirin. Morfoloji analizi (histoloji) için, küresel numuneleri PBS'de% 4 paraformaldehit içinde 2-8 ° C'de en az 18 saat boyunca inkübe edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Otomatik pipet sistemi, ASC hücre süspansiyonunu 15 dakika içinde 12 delikli bir plakanın 12 kuyucuğuna tohumlayabilir. 81 mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojelin kullanılması, protokolün sonunda 972 sferoid üretecektir. 256 mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojelin kullanılması, protokolün sonunda 3.072 sferoid üretecektir. ASC sferoidleri, boyutlarının ve şekillerinin homojenliği açısından analiz edildi. 81 resesyonlu mikromoldlardan elde edilen ASC sferoidleri, 256 resesyon ile mikromoldlardan ASC sferoidlerinin aksine, kültür döneminde homojen çap göstermiştir (Şekil 1C,D). En küçük ve en büyük çapların (sferisite) oranı, 81 ve 256 resesyon ile mikromoldlardan ASC sferoidlerinde 1'e yakındı (Şekil 1E, F). Canlılık, morfoloji ve kuvvet (Şekil 2) analizlerinden elde edilen sonuçlar, ASC sferoidlerinin başarılı, büyük ölçekli üretimi için kanıt sağlamaktadır.
Şekil 1: ASC sferoidleri yüksek çaplı tekrarlanabilirlik gösterdi. (A) 81 dairesel durgunluk ve (B) 256 dairesel durgunluk ile mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojellerden ASC sferoidlerinin temsili optik mikrografları. (C,D) Sırasıyla 81 ve 256 dairesel durgunluğa sahip beş mikro kalıplanmış yapışkan olmayan hidrojelden 1, 3 ve 7 günde küresel çap. (E,F) Mikrokalıplanmış yapışkan olmayan hidrojellerden sırasıyla 81 ve 256 dairesel durgunluk ile en küçük ve en büyük çapların oranı. Sferoidlerin en küçük ve en büyük çaplarını ölçmek için, dijital kamera ile donatılmış bir optik mikroskop kullanılarak haftalık görüntüler elde edildi. Genişlik ve uzunluk ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü. Her bir sferoidin çap oranı, genişliğin uzunluğa bölünmesiyle elde edildi (küresel sferiklik). 81 dairesel durgunluğa sahip mikrokalıplanmış, yapışkan olmayan hidrojellerden toplam 85 sferoid ölçüldü ve 256 dairesel durgunluğa sahip mikrokalıplanmış, yapışkan olmayan hidrojellerden toplam 160 sferoid ölçüldü. Veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir. Yıldız işaretleri, ANOVA tarafından parametrik olmayan ve eşlenmemiş olarak elde edilen P değerlerini ve ardından çoklu karşılaştırmaları gösterir (**P < 0.001; ****P < 0.0001). Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltma: ASC = yağ dokusu kök / stromal hücreleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: ASC sferoidleri yüksek hücre canlılığı gösterdi. (A) 256 dairesel durgunluğa sahip mikrokalıplanmış, yapışkan olmayan hidrojellerden 7. günde ASC sferoidlerinin canlılık testinin floresan mikrografları. Canlı ve ölü hücreler sırasıyla yeşil ve kırmızı renkte gözlenir. Ölüm kontrolü girişte gösterilir. (B) 81 dairesel durgunluğa sahip mikrokalıplanmış, yapışkan olmayan hidrojellerden hematoksilin ve eozin ile boyanmış bir ASC sferoidinin kesiti. Sabit sferoid örnekleri parafin içine gömüldü ve örnekler bir mikrotom kullanılarak 5 μm kalınlığında kesitlere kesildi. (C) 7. günde ASC sferoidlerinin μN cinsinden ölçülen basınç direnci kuvveti. Veriler beş sferoidden toplandı ve daha önce tarif edilen metodoloji5'e göre ortalama ± standart sapma olarak ifade edildi. Yıldız işaretleri, parametrik olmayan ve eşleşmemiş iki yönlü ANOVA tarafından elde edilen P değerini gösterir ve bunu çoklu karşılaştırmalar izler. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltma: ASC = yağ dokusu kök / stromal hücreleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, otomatik pipet sistemi kullanılarak ASC sferoidlerinin büyük ölçekli üretimi sunulmaktadır. Protokolün kritik adımı, pipetleme için doğru hücre süspansiyonu, hızı ve mesafe hacmini sağlamak için yazılımı hassas bir şekilde ayarlamaktır. Protokolde açıklanan parametreler, ASC hücre süspansiyonunun mikrokalıplanmış, yapışkan olmayan hidrojelleri içeren 12 kuyucuklu plakaların kuyucuklarına dağıtılmasını optimize etmek için bir dizi denemeden sonra belirlenmiştir. Optimizasyon, sferoidlerin çapı ve sferikliği ölçülerek değerlendirildi. Mikro kalıplanmış yapışkan olmayan hidrojellerin alanı ve yüksekliği, hücre süspansiyonunu dağıtmak için ideal hızı hesaplamak için kullanıldı. Hücre süspansiyonu ekipman tarafından farklı bir dağıtım hızında tohumlanırsa, bu sferoidlerin oluşumunu doğrudan etkileyecektir. Bu nedenle, bunlar ekipmanla yapılan denemelerden sonra optimize edilmesi gereken çok önemli parametrelerdir. Bu protokolün bazı sınırlamaları vardır. Sadece mikrokalıptaki yapışkan olmayan hidrojeldeki ASC'lerin tohumlanması otomatikleştirilebilir, ardından hücre kültürü ortamının eklenmesi sağlanabilir. Sistemin özellikleri, ekipmanın ve yazılımın sürümü ile sınırlıdır. Bununla birlikte, bu tekrarlanabilir yaklaşımın temel avantajı, boyut ve şekil olarak homojen ve uygulanabilir 3.072 adede kadar ASC sferoidinin üretilmesidir - insan hataları veya kontaminasyon riskleri küçüktür. Çok sayıda biyofabrikasyon ASC sferoid, daha karmaşık doku modelleri üretmek için doğrudan bir 3D biyoyazıcıya yüklenebilir.
Genel olarak, doğru ve otomatik pipetlemenin hücre kültürünün otomasyonunda merkezi bir rol oynadığı yaygın olarak bilinmektedir. Otomatik hücre kültürü sistemleri büyük ölçekli üretime olanak tanır ve teknik doğruluğu, tekrarlanabilirliği ve proses verimliliğini artırır15. Bu nedenle, otomatik sistemler, endüstriyel ortamlar için yaygın ve faydalı olan büyük ölçekli üretimi kolaylaştırabilir16,17. Bununla birlikte, 3D hücre kültürü sistemlerini otomatikleştirmek için protokollerin geliştirilmesini açıklayan az sayıda çalışma vardır 7,18,19,20,21.
Mehesz ve işbirlikçileri7 ve Meseguer-Ripolles ve meslektaşları21, ASC sferoidlerini biyofabrikasyon etmek için benzer bir protokol kullandılar. Mehesz ve ark.7 tarafından yapılan çalışmada, yazarlar aynı otomatik pipetleme sistemini kullandılar. Bununla birlikte, protokolleri sadece 96 sferoid üretirken, bu çalışmada geliştirilen protokol, boyut ve şekil olarak homojen bir şekilde aynı anda 3.072 ASC sferoid üretebildi. Meseguer-Ripolles ve ark.21 ayrıca 73 adede kadar karaciğer sferoidi üretmek için otomatik bir pipetleme sistemi kullandılar. Günümüzde sferoidleri büyük ölçekte üretmek için tartışılan bir başka yaklaşım da mikroakışkan cihazlardır. Bununla birlikte, şimdiye kadar yayınlanan makaleler, küresel üretimölçeğini artırmak yerine sferoidleri üretebilecek daha iyi cihazlar geliştirmek için teknolojiyi araştırdı 7,20.
Çok sayıda sferoid üretmek için kullanılabilecek bir başka yöntem de iplikçi şişeleri kullanmaktır. Bununla birlikte, bu teknikle ilgili ana konulardan biri,22,23 sferoidlerin boyut ve şeklini kontrol etmedeki zorluktur. Ek olarak, 3D biyobaskı, biyofabrik sferoidlere büyük ölçekte zaten uygulanmıştır. Daly ve Kelly19 tarafından yapılan çalışmada, yazarlar polikaprolakton mikro odalarında çok sayıda sferoid üretmek için bir mürekkep püskürtmeli teknik kullandılar. Sferoidler boyut ve şekil olarak canlı ve homojendi.
Bu çalışmada açıklanan protokolün ana uygulaması, ASC sferoidlerini 3D biyobaskı için gerekli olan büyük ölçekte biyofabrikasyona tabi tutmaktır. Mironov ve işbirlikçileri24 tarafından tartışıldığı gibi, karmaşık dokuları ve organ modellerini biyofabrikasyon yapmak için binlerce sferoid gerekli olacaktır. Bu protokolde açıklanan otomatik yöntem, doğrudan 3D biyoyazıcıya yüklenebilen çok sayıda ASC sferoidinin üretilmesine izin verecektir. Bu sferoidleri, kas-iskelet sistemi dokularını mühendislik yapmak için istenen bir mezodermal yola ayırt etmek de mümkündür. De Moor ve işbirlikçileri25 , gelecekteki 3D biyobaskı uygulamaları için çok sayıda vaskülarize sferoid üretmek için yüksek verimli bir yöntem geliştirdi.
Ekipman, protokolü geliştirmek için değiştirilebilir. Ekipmanın daha yeni versiyonları, üretilen ASC sferoidlerinin sayısını artırabilecek daha fazla sayıda plakanın kullanılmasına izin verir. Aynı son sürüm, plakaların doğru istiflenmesine izin verir ve bu aynı zamanda protokolün daha iyi bir verimliliğini sağlayacaktır. Sonuç olarak, 15 dakika içinde boyut ve şekil olarak homojen 3.072 ASC sferoidine kadar biyofabrikasyona izin veren bir protokolü başarıyla gösterdik ve bunun Doku Mühendisliği uygulamaları için bir biyofabrikasyon hattı inşa etmenin ilk adımı olarak kabul edildiğini gördük.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Ulusal Metroloji, Kalite ve Teknoloji Enstitüsü'ne (INMETRO, RJ, Brezilya) tesislerinin kullanımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Carlos Chagas Filho Rio de Janeiro Eyaleti Araştırma Destek Vakfı (Faperj) (finans Kodu: E26/202.682/2018 ve E-26/010.001771/2019), Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Kalkınma Konseyi (CNPq) (finans kodu: 307460/2019-3) ve Deniz Araştırmaları Ofisi (ONR) (finans kodu: N62909-21-1-2091) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen Rejeneratif Tıp Ulusal Bilim ve Teknoloji Merkezi-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
References
- Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
- Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
- Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
- Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
- Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
- Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
- Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).
- Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).
- Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
- Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).
- Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
- Doulgkeroglou, M. -K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
- Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).
- Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
- Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).
- Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).
- Lee, G. -H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).
- Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
- De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
