Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Método de doble tinción para detectar la pectina en la interacción planta-hongo

Published: February 4, 2022 doi: 10.3791/63432
Automatic Translation
1, 2
1Faculty of Animal Science and Food Engineering, Department of Basic Sciences, University of São Paulo, 2Laboratory of Nuclear Instrumentation, Center of Nuclear Energy in Agriculture, University of São Paulo

Summary

Este protocolo describe un método microscópico para detectar la pectina en la interacción café-hongo.

Abstract

Las células vegetales utilizan diferentes mecanismos estructurales, ya sean constitutivos o inducibles, para defenderse de la infección por hongos. La encapsulación es un mecanismo inducible eficiente para aislar los haustorios fúngicos del protoplasto de células vegetales. Por el contrario, la pectina, uno de los componentes poliméricos de la pared celular, es un objetivo de varias enzimas pectolíticas en interacciones necrotróficas. Aquí, se presenta un protocolo para detectar pectina e hifas fúngicas a través de microscopía óptica. Se investiga la encapsulación rica en pectina en las células de las hojas de café infectadas por el hongo de la roya Hemileia vastatrix y la modificación de la pared celular mesófila inducida por Cercospora coffeicola . Las muestras de hojas lesionadas se fijaron con la solución de Karnovsky, se deshidrataron y se incrustaron en metacrilato de glicol durante 2-4 días. Todos los pasos fueron seguidos por el bombeo de vacío para eliminar el aire en los espacios intercelulares y mejorar el proceso de incrustación. Los bloques incrustados se seccionaron en secciones de 5-7 μm de espesor, que se depositaron en un portaobjetos de vidrio cubierto con agua y posteriormente se calentaron a 40 ° C durante 30 min. A continuación, los portaobjetos se tiñeron dos veces con 5% de azul algodón en lactofenol para detectar el hongo y 0,05% de rojo rutenio en agua para detectar pectina (grupos ácidos de ácidos poliurónicos de pectina). Se encontró que los haustorios fúngicos de Hemileia vastatrix estaban encapsulados por pectina. En la cercosporiosis del café, las células mesófilas exhibieron disolución de las paredes celulares, y se observaron hifas y conidióforos intercelulares. El método presentado aquí es efectivo para detectar una respuesta asociada a la pectina en la interacción planta-hongo.

Introduction

Los mecanismos de defensa de la pared celular en las plantas son cruciales para contener la infección por hongos. Los estudios han reportado cambios en el grosor y la composición de la pared celular desde elsiglo 19 1,2. Estos cambios pueden ser inducidos por un patógeno fúngico que estimula la formación de una papila, que impide que los hongos entren en la célula o podría usarse para encapsular las hifas para aislar el protoplasto de la célula huésped de la haustoria fúngica. La producción de una barrera dinámica de la pared celular (es decir, papilas y un haustorio completamente encerrado) es importante para promover la resistencia de la planta3. Los estudios histopatológicos sobre enfermedades relacionadas con hongos han investigado la aparición de estos mecanismos y han descrito los polímeros de la pared celular, la celulosa, la hemicelulosa (arabinoxilanos) y la callosa como mecanismos de resistencia al ataque fúngico 4,5,6,7.

La pared celular es la primera barrera contra el ataque de microorganismos, perjudicando la interacción planta-hongo. Los polisacáridos pécticos componen la pared celular y representan aproximadamente el 30% de la composición de la pared celular en las células primarias de las plantas eudicot en las que los homogalacturonanos son el polímero más abundante (aproximadamente el 60%)8. El Golgi secreta compuestos complejos de pectina que componen las cadenas de ácido galacturónico, que pueden o no estar metilados 8,9. Desde 2012, la literatura ha señalado que el grado de esterificación metilo de pectina es crítico para determinar la compatibilidad durante la infección por enzimas pécticas microbianas 10,11,12. Por lo tanto, se requieren protocolos para verificar la presencia y distribución de compuestos pécticos en los patosistemas planta-fúngico.

Se han utilizado diversas técnicas para detectar la encapsulación de papilas o haustorias. Los métodos de referencia utilizados son la microscopía electrónica de transmisión (TEM) de tejido fijo y la microscopía de luz de tejidos vivos y fijos. En cuanto a tem, varios estudios han demostrado el papel estructural de las aposiciones de la pared celular en la resistencia fúngica 13,14,15,16, y que el uso de lectinas y anticuerpos es un método intrincado para localizar polímeros de carbohidratos16. Sin embargo, los estudios muestran que la microscopía de luz es un enfoque importante y que las herramientas histoquímicas e inmunohistoquímicas permiten una mejor comprensión de la composición de las papilas y el revestimiento de haustorio 6,7.

Los hongos patógenos muestran dos tipos principales de estilos de vida: biotróficos y necrotróficos. Los hongos biotróficos dependen de las células vivas para su nutrición, mientras que los hongos necrotróficos matan a las células huésped y luego viven en los tejidos muertos17. En América Latina, la roya de la hoja del café, causada por el hongo Hemileia vastatrix, es una enfermedad importante en los cultivos de café18,19. Hemileia vastatrix presenta un comportamiento biotrófico y, entre los cambios estructurales observados en especies o cultivares de café resistentes, se ha reportado una respuesta de hipersensibilidad, deposición de callosa, celulosa y lignina en las paredes celulares, así como hipertrofia celular14. Según el conocimiento de los autores, la literatura no informa sobre la importancia de la pectina en la resistencia a la roya del café. Por otro lado, los hongos necrotróficos que causan cercosporiosis se dirigen a la pectina a través de un conjunto de enzimas asociadas con la degradación de la pared celular, como las pectinasas y la poligalacturonasa20. La cercosporiosis en el café, causada por el hongo Cercospora coffeicola, también es una amenaza importante para los cultivos de café21,22. Este hongo causa lesiones necróticas tanto en las hojas como en las bayas. Después de la penetración, C. coffeicola coloniza los tejidos vegetales a través de las vías intracelulares e intercelulares 23,24,25.

El presente protocolo investiga la presencia de estructuras fúngicas y pectina en las paredes celulares. Este protocolo es útil para identificar la respuesta de la planta asociada con la pectina (teñida con colorante rojo rutenio, que es específico de los grupos ácidos ácidos poliurónicos de la pectina), inducida por el huésped en una interacción biotrófica con el hongo. También ayuda a verificar el efecto de los hongos necrotróficos en la degradación de las paredes celulares pécticas. Los presentes resultados indican que el método de doble tinción es eficaz para discriminar estructuras y la fase reproductiva de los hongos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparación de la solución tampón y los reactivos

  1. Prepare un tampón de cacodilato de 2 M agregando 4.28 g de cacodilato de sodio a 100 ml de agua destilada y ajuste el pH a 7.25 con 0.2 N HCl.
  2. Preparar 100 mL de la solución fijadora karnovsky mezclando 10 mL de glutaraldehído acuoso al 25%, 10 mL de formaldehído acuoso al 10%, 25 mL de tampón de cacodilato al 25% y 0,5 mL de CaCl2 26 M. Enrasar el volumen hasta 100 mL con agua destilada.
    NOTA: La solución se puede mantener en un refrigerador durante 6 meses.
    PRECAUCIÓN: La solución tampón de cacodilato es tóxica; por lo tanto, manipule la solución fijadora en una campana extractora de humos o en un área abierta. Evite inhalar los vapores de la solución y use guantes mientras manipula.
  3. Preparar la solución nutritiva acuosa de Hoagland mezclando lo siguiente: 3 mM Ca(NO3)2.4H 2O, 2 mM NH4H2PO4, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H 2O, 9.07 mM MnSO4, 0.765 mM ZnSO4.7H 2O, 46.4 mM H3BO3, 0.09 mM Na2MoO4. H2O, 0,01 mM CuSO4 y 36 mM FeSO 4,7H2O como hierro-EDTA (ácido etilendiamina tetraacético)27.

2. Muestras de plantas e inoculación de hongos

NOTA: Para experimentos en hojas afectadas por la roya del café, cinco plántulas de 2 meses de coffee arabica cv. Los catuaíes fueron cultivados y mantenidos en un invernadero en el Centro de Energía Nuclear en la Agricultura (CENA) de la Universidad de São Paulo, Piracicaba, Estado de São Paulo, Brasil.

  1. Cultive plantas de café en macetas de plástico de 500 ml llenas de solución nutritiva acuosa de Hoagland (pH de ~ 5.5) durante 4 meses en una cámara de crecimiento mantenida a 27 ± 3 ° C con un fotoperíodo de 12 h creado por lámparas LED en el flujo de fotones de 250 μmol de fotones s-1 m-2. Reemplace la solución nutritiva de Hoagland cada semana durante 4 meses.
  2. Inocular cuatro hojas expandidas de cinco plantas en sus superficies abaxiales con 1 x 103 H. vastatrix uredosporas siguiendo el método descrito en la referencia28. Después de la inoculación, mantenga las plantas durante 48 h en la oscuridad cubriéndolas con una bolsa de plástico negra. Cosechar las lesiones 30 días después de la inoculación.
  3. Cosecha lesiones características causadas por Cercospora coffeicola de Coffea arabica cv. Plantas de Obatã ubicadas (coordenadas: -22.906506126269942, -47.015075902025266) en el Instituto Biológico, Campinas, Estado de São Paulo, Brasil. Antes de procesar la muestra, analizar las lesiones en un estereomicroscopio para verificar la presencia de café C. coffeicola conidia. Luego, monte algunas diapositivas con los conidios para confirmar la etiología de la enfermedad22.

3. Recolección de muestras, fijación y deshidratación

  1. Usando un bisturí y una pinza, recolecte una muestra de hoja de ~ 10 mm2 en la región media de la lesión (manchas amarillas; Figura 1) y sumergirlo en 30 ml de solución fijadora de Karnovsky (Figura 1 y Figura 2A). El paso de fijación puede tener lugar en un refrigerador durante 48 h.
  2. Durante al menos cuatro veces, someta la muestra de hoja a un vacío bajo (500-600 mBar) utilizando una bomba de aceite durante 15 minutos cada una para aumentar la permeabilidad de la solución fijadora en el tejido de la hoja. Realice este paso con la rotación de muestra (Figura 1).
  3. Después de la fijación, lave la muestra de la hoja tres veces en tampón de cacodilato de 0,5 M (pH 7,2) diluido en agua destilada durante 5 minutos cada una y luego transfiérala a una serie etanólica graduada (30%, 50%, 70%, 90% (2x) y 100% (2x)) durante 15 min en cada concentración de etanol (Figura 1 y Figura 2B).

4. Procedimiento de incrustación de Historesin

  1. Transfiera gradualmente las muestras a metacrilato de glicol (GMA) en tres pasos, siguiendo las instrucciones del fabricante. Primero, haga la Solución A mezclando el polvo de GMA (1 g) con 100 ml de resina básica (kit de historesina; Tabla de Materiales) bajo agitación magnética, y luego siga los pasos a continuación.
    1. Sumergir las muestras en Solución 1:2 A: 100% etanol durante 3 h.
    2. Sumergir las muestras en Solución 1:1 A: 100% etanol durante 3 h.
    3. Sumergir las muestras en una resina básica pura durante 2-4 días. Durante este paso, someta las muestras a un vacío bajo al menos cuatro veces al día durante 15 minutos seguido de rotación.

5. Polimerización

NOTA: El proceso de polimerización requiere moldes de plástico de 1,2 ml, resina básica y endurecedor (consulte la Tabla de materiales para los detalles del kit comercial).

  1. Mezclar 15 ml de la solución A (paso 4.1) con 1 ml del endurecedor en un vaso de precipitados con rotación durante 2 minutos para producir la solución de polimerización (solución B).
  2. Coloque 1,2 ml de la solución de polimerización (Solución B) en moldes de plástico. Usando una púa de madera, transfiera las muestras de hojas lesionadas de resina básica pura a la Solución B (Figura 2C). Evite el uso de pinzas, ya que pueden causar aplastamiento del tejido.
  3. Asegúrese de orientar rápidamente las muestras de hojas perpendiculares a los moldes de plástico, ya que la solución B se vuelve viscosa rápidamente en 5 minutos. Se puede colocar más de una muestra de hoja lesionada en un solo molde.
    NOTA: Se recomienda practicar el paso anterior varias veces antes de solicitar muchas muestras. Cuando hay muchas muestras, el tiempo de polimerización es diferente entre los moldes y la orientación perpendicular de las muestras de hojas puede ser difícil de lograr.
  4. Cuando se logre la orientación perpendicular de las muestras de hojas, espere 30 minutos y luego transfiera el molde de plástico a una cámara de plástico o vidrio que contenga gel de sílice para evitar la humedad. Espere 2-3 h para la polimerización.
  5. Una vez que la resina y la muestra de la hoja se polimericen después del período de 2-3 h, separe el bloque resultante del molde de plástico lijando la base del bloque con una lima de lijado. Luego, pegue el bloque a un trozo de madera (Figura 2D).

6. Seccionamiento

  1. Utilizando un microtomo rotativo equipado con cuchillas de acero de 8 cm (Figura 2E), corte el bloque en secciones de 5 μm de espesor. Coloque las secciones en toboganes de vidrio cubiertos con agua destilada. Transfiera los portaobjetos con las secciones flotando sobre el agua a una placa caliente a 40 °C para que se sequen y promuevan la adhesión de las secciones a los portaobjetos de vidrio.
  2. Después del secado (Figura 2F), etiquete las diapositivas de vidrio con el nombre de referencia del bloque y el número de diapositiva.

7. Proceso de doble tinción

  1. Cubra las secciones con 2 ml de azul de algodón al 5% en lactofenol (40% de glicerol, 20% de fenol y 20% de ácido láctico en agua) y caliéntelas en una placa caliente a 45 ° C durante 5 min (Figura 3A).
  2. Retire el exceso de tinte lavando la diapositiva tres veces en un vaso de precipitados lleno de agua destilada (Figura 3B-D).
  3. Tinción con 2 mL de rojo rutenio al 0,01% en agua durante 1 min (Figura 3E).
  4. Retire el exceso de tinte lavando la diapositiva tres veces en un vaso de precipitados lleno de agua destilada (Figura 3F, G).
  5. Coloque una gota de agua destilada sobre las secciones y cubra las secciones con un estuche de 24 mm x 60 mm para realizar análisis de microscopía de luz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La tinción de lactofenol azul algodón en la sección incrustada en GMA reveló la presencia de varias estructuras fúngicas entre y dentro de las células mesófilas del café en las interacciones fúngicas biotróficas y necrotróficas.

En el patosistema biotrófico, cuando se tiñe utilizando el método de doble tinción, las hifas de Hemileia vastatrix que contienen paredes celulares y el contenido denso de protoplastos aparecen en azul oscuro tanto en el parénquima esponjoso como en el de empalizada (Figura 4A, B). La célula madre del haustorio (Hmc) y la haustoria también exhiben un fuerte color azul oscuro (Figura 4C). Cuando se contrateñi se contrateñe con rojo rutenio, la distribución fúngica en los espacios intercelulares está claramente definida (Figura 4D). La presencia de una Hmc azul oscuro ayuda a detectar la zona de infección. Durante la interacción, H. vastatrix Hmc rompió la pared celular huésped y desarrolló un cuello haustorial que podría estar rodeado de compuestos pécticos (Figura 4E, F). Sin embargo, la encapsulación rica en pectina (color rosa-rojo) del cuello haustorial no es capaz de prevenir la formación haustorial (Figura 4E,F). En algunos casos, la encapsulación rica en pectina encerró el haustorio de forma incompleta (Figura 4G) y en algunos casos, el haustorio está completamente encapsulado (Figura 4H).

En la interacción necrotrófica, el protocolo de doble tinción también fue útil para verificar la interacción de Cercospora coffeicola con tejidos mesófilos de café. En el borde de la lesión, donde el hongo no está presente, la pared celular rica en pectina mantuvo su integridad (Figura 5A). El método de doble tinción demostró la presencia de hifas intercelulares (Figura 5B,C). En las zonas de interacción, las paredes celulares de pectina parecían perder su integridad debido a la disolución (Figura 5B,C). Las estructuras reproductivas, como el conidióforo, se encontraron en la epidermis adaxial (Figura 5D). En la cámara subestomática, se encontraron hifas de C. coffeicola como estructuras de rizo. El parénquima de empalizada en la región lesionada parece sufrir lisis de la pared celular (Figura 5E).

Figure 1
Figura 1: Detalles de los pasos individuales en el protocolo para cosechar tejidos lesionados. Cosecha el trozo de la lesión con un bisturí y una pinza. Sumerja las muestras de hojas en la solución fijadora. Someta las muestras a bombeo y rotación de vacío. Siga el protocolo para los procesos de deshidratación e incrustación. La muestra polimerizada se secciona en un microtomo rotativo. Los portaobjetos con secciones de lesiones se montan y tiñen para verificar las hifas fúngicas y las paredes celulares ricas en pectina utilizando el método de doble tinción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Detalles de los pasos individuales de la sección de muestra antes de la doble tinción. (A) Etapa de fijación. (B) Deshidratación en series de etanol graduado; el tejido de la hoja se incuba en etanol durante 15 minutos en cada concentración. (C) Polimerización dentro del molde de plástico. (D) Bloque de muestra polimerizada pegada a un trozo de madera. (E) Bloque encolado en madera colocado en el microtomo para el proceso de seccionamiento. (F) Secciones de tejido en la diapositiva (denotadas por flechas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Detalles de los pasos individuales del protocolo de doble tinción. (A) Cubra las secciones con gotas de lactofenol azul algodón y caliente los portaobjetos en una placa caliente a 45 ° C. (B-C) Retire el exceso de tinte lavando en agua destilada. (D) Secciones en los portaobjetos de vidrio después del lavado (denotadas por flechas). (E) Cubra las secciones con gotas de rojo rutenio. (F-G) Retire el exceso de tinte lavando en agua destilada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Protocolo histoquímico de doble tinción para estructuras de pectina y hongos en la lesión de la roya del café. (A-C) Secciones teñidas solo con lactofenol azul algodón. Las hifas fúngicas están teñidas de azul oscuro (flechas). La célula madre de haustorium (Hmc) y haustorium (Ha) tienen un color azul oscuro. (D-H) Doble tinción con lactofenol azul algodón y rojo rutenio. (D) Descripción general de la pústula (Pu) en una hoja. (E-F) Cuello haustorial (flechas) con pectina (color rosa-rojo). (G) Las flechas indican el comienzo de la encapsulación rica en pectina del haustorio. (H) Encapsulación completa de haustorio por pectina (flechas). Epi Aba - Epidermis abaxial; Epi Ada - Epidermis adaxial; Sp - Parénquima esponjoso; Pp - parénquima de empalizada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Protocolo histoquímico de doble tinción para estructuras de pectina y hongos en lesiones de cercosporiosis en tejidos mesófilos de café. (A) Borde de lesión sin hongos. (B-F) Secciones transversales de la hoja lesionada. (A) La integridad de las paredes celulares ricas en pectina del parénquima esponjoso. (B-D,F) En los tejidos infectados, las hifas de Cercospora coffeicola eran evidentes (flechas) y causaban daños en las paredes celulares pécticas. Fue posible verificar el conidióforo debajo de la cutícula (TC) (D). Epi Aba - Epidermis abaxial; Epi Ada - Epidermis adaxial; Sp - Parénquima esponjoso; Pp - Parénquima de empalizada; St - Estomas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El presente trabajo introduce una prueba histoquímica alternativa de doble tinción para investigar la composición de pectina de las paredes celulares que encapsula la haustoria en un patológico biotrófico. El objetivo también es demostrar la eficacia del método para detectar hongos necrotróficos y cambios en la pared celular inducidos por él. Aquí, la pectina de las paredes celulares del parénquima del café puede encapsular tanto el cuello como el haustorio del hongo de la roya Hemileia vastatrix. Silva et al. también han descrito la encapsulación por celulosa y callosa en el patosistema coffee-H. vastatrix 14,29. Entre los polímeros de pared celular asociados con mecanismos de defensa, la pectina juega un papel importante en el sistema planta-patógeno 10,11,12. Por lo tanto, el conocimiento de las funciones de la pectina es de gran valor histopatológico.

La cercosporiosis en el café, causada por Cercospora coffeicola, daña los tejidos de las hojas y, finalmente, conduce a la muerte celular. Estos síntomas son causados principalmente por la actividad de la cercosporina y las enzimas degradadoras de la pared celular20. Los estudios que utilizaron rojo rutenio demostraron una pérdida de integridad de la pared celular, similar a un estudio previo sobre hojas de caqui infectadas por Pseudocercospora kaki30. El análisis histopatológico utilizando el método de doble tinción demostró la presencia de las hifas fúngicas y este análisis es efectivo para detectar hifas fúngicas en los espacios intercelulares. Alternativamente, la microscopía electrónica de barrido (SEM) ha demostrado eficacia para observar las hifas de C. coffeicola 25; sin embargo, la disponibilidad de equipos tan sofisticados, junto con el laborioso trabajo de preparación de muestras, es un factor limitante. Además, el análisis SEM no permite el reconocimiento químico de la pectina en las paredes celulares. Por el contrario, la doble tinción es un método importante para detectar cambios en la pectina. Sin embargo, el método descrito aquí tiene una limitación con respecto a la resolución de la microscopía de luz que no permite un aumento en los detalles de la ultraestructura de la interacción planta-hongo. Además, el método de doble tinción presentado aquí no es específico para detectar especies de hongos y, por lo tanto, se deben realizar ensayos moleculares adicionales.

La preparación de la muestra sigue protocolos de rutina en anatomía vegetal; sin embargo, algunos puntos requieren una atención especial. Por ejemplo, la fijación es un paso crítico. El tamaño de las muestras y el cuidado en la recolección de las mismas son esenciales para una buena fijación. El tiempo, la temperatura, el pH y la osmolaridad son cruciales para los tejidos vegetales31. Los tejidos foliares lesionados son órganos aéreos y deben ser sometidos a un vacío suave para mejorar la fijación. El uso de metacrilato de glicol (GMA) requiere etanol como disolvente de deshidratación; los tejidos que no están adecuadamente deshidratados pueden presentar dificultades durante el proceso de incrustación. Esta condición empeora cuando los tejidos vegetales tienen muchos compuestos fenólicos, como en el caso de las hojas de café. Además, tratar con pequeñas partes de tejidos es importante; de lo contrario, se requieren métodos alternativos de incrustación32.

La técnica de doble tinción que aquí se presenta es una adaptación del protocolo reportado por Marques et al.33. En ese protocolo, los autores utilizaron azul algodón (5%) y safranina al 1% para distinguir las estructuras fúngicas y las paredes celulares de las plantas. La técnica fue útil para detectar la presencia de hongos en diferentes patosistemas, como Colletotrichum acutatum-citrus petals y Guignardia citricarpa-citrus fruit33Plasmodiophora brassicae en Arabidopsis thaliana34, Elsinoë ampelina en Vitis labrusca35, y otros. Recientemente, Marques y Soares36compilaron una serie de técnicas microscópicas, incluidos los métodos de luz y fluorescencia, para distinguir las características de la planta y los hongos37. Sin embargo, en algunas regiones o países, como Brasil, los microscopios de fluorescencia y SEM pueden no estar disponibles; por lo tanto, el uso de microscopios de luz es una alternativa importante y más barata para la investigación e incluso los métodos didácticos empleados en universidades y escuelas secundarias. Las hifas fúngicas se han detectado microscópicamente en tejidos vegetales y animales mediante el tinte azul algodón 36,38,39,40. Esto está relacionado con la reacción positiva del tinte con la pared fúngica rica en quitina40. La fórmula azul algodón incluye lactofenol, que es una solución que actúa como un mordiente para el tejido41, preservando así la estructura fúngica cuando se mezcla con el azul de algodón. 

Aquí, se utilizó rojo rutenio al 0,05% para reemplazar la safranina. El aspecto positivo presentado en este estudio es que la pectina, un polímero específico de la pared celular, se tiñó para proporcionar datos cualitativos importantes. El rojo rutenio es un reactivo utilizado para detectar grupos ácidos de ácidos poliurónicos de pectina 42,43,44. Es específico de la pectina y no tiñe otros componentes de carbohidratos de la pared celular (es decir, celulosa o callosa). Cadenas de ácidos galacturónicos dispuestos en diferentes columnas vertebrales estructurales y bioquímicas componen la pectina 8,9,45. La reactividad del rojo rutenio a la pared celular depende del grado de esterificación metélica11. El grado de esterificación de metilo depende de la actividad de las pectinas metil esterasas (PME), por lo que el rojo rutenio también se utilizó como herramienta para discriminar la actividad de PME11.

Por lo tanto, el método de doble tinción descrito aquí es una herramienta útil para verificar las modificaciones de la pectina en las interacciones planta-hongo. Según el mejor conocimiento de los autores, este es el primer informe de pectina en la encapsulación haustorial de hongos de la roya del café. Curiosamente, el método de doble tinción también fue importante para observar las estructuras fúngicas, describir el daño causado a la pared celular rica en pectina y verificar las estructuras reproductivas fúngicas. Se deben realizar estudios histopatológicos adicionales sobre royas, antracnosis, cercosporiosis, smuts y otras interacciones planta-hongo biotróficas, hemibiotróficas y necrotróficas para investigar el uso potencial de esta técnica en diferentes patosistemas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer al Dr. Hudson W. P. de Carvalho por el apoyo para desarrollar este trabajo. Los autores también están agradecidos al Laboratorio de Microscopía Electrónica ''Prof. Elliot Watanabe Kitajima'' por proporcionar la instalación de microscopía de luz. Los autores agradecen a la Dra. Flávia Rodrigues Alves Patrício por suministrar lesiones al material vegetal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blades DB80 HS Leica 14035838383 Sectioning
Cacodylate buffer EMS # 11652 Fixation
Cotton Blue Lactophenol Metaquímica 70SOLSIG024629 Staining
Formaldehyde EMS #15712 Fixation
Glutaraldehyde EMS #16216 Fixation
Historesin Kit Technovit /EMS #14653 Historesin for embedding
Hot plate Dubesser SSCD25X30-110V Staining
Microscopy Zeiss #490040-0030-000 Image capture
Microtome (Leica RM 2540) Leica 149BIO000C1 14050238005 Sectioning
Plastic molding cup tray EMS 10176-30 Staining
Ruthenium red LABHouse #006004 Staining
Software Axion Vision Zeiss #410130-0909-000 Image capture
Vaccum pump Prismatec 131 TIPO 2 V.C. Fixation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5 (1863).
  2. Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).
  3. Underwood, W. The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion. Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).
  4. Hückelhoven, R. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility. Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).
  5. Voigt, C. A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).
  6. Chowdhury, J., et al. Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei. New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).
  7. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).
  8. Caffall, K. H., Mohnen, D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).
  9. Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. , Wiley Blackwell. New York. 45 (2015).
  10. Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases. Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).
  11. Lionetti, V. Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses. Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).
  12. Lionetti, V., et al. Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis. Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).
  13. Heath, M. C. Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection. Phytopathology. 61, 383-388 (1971).
  14. Silva, M. C., et al. Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).
  15. An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress. Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).
  16. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus. Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).
  17. Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits. Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).
  18. Avelino, J., et al. The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions. Food Security. 7, 303-321 (2015).
  19. Zambolim, L. Current status and management of coffee leaf rust in Brazil. Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).
  20. Swiderska-Burek, U., et al. Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555 (2020).
  21. Andrade, C. C. L., et al. Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves. Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).
  22. Zambolim, L. Coffee tree diseases. Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , Agronômica Ceres Santana (in Portuguese). São Paulo. 810 (2016).
  23. Castaño, A. J. J. Coffee rust. Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).
  24. Echandi, E. Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola. Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).
  25. Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf. Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).
  26. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  27. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , University of California. Berkeley, California. 347 (1950).
  28. Eskes, A. B. Resistance. Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, Boca Raton. 171 (1989).
  29. Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III). International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).
  30. Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves. Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).
  31. Hayat, M. A. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. , International Publishing. Berkeley Heights. 564 (1981).
  32. Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T. Large plant samples: how to process for GMA embedding. Light microscopy: methods and protocols. Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. 689, Humana Press. 37-49 (2011).
  33. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. New staining technique for fungal-infected plant tissues. Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).
  34. Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
  35. Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate. Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517 (2020).
  36. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. Piracicaba, F. E. A. L. Q. , Santana. in Portuguese 140 (2021).
  37. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).
  38. Chesters, C. G. C. Three methods of using cotton blue as a mycological stain. Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).
  39. Macedo, N. A. Manual of Techniques in Plant Histology. Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , in Portuguese 68 (1997).
  40. Lecker, A. Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health Journal. 12 (30), 24 (1999).
  41. Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. Lactic acid in wool dyeing. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103 (1895).
  42. Chamberlain, C. J. Methods in Plant Histology. , The University of Chicago Press. Chicago. 349 (1932).
  43. Sterling, C. Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain. American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).
  44. Luft, J. H. Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action. The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).
  45. Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A. Cell Wall. Plant Physiology. Kerbauy, G. B. , Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. in Portuguese 165-181 (2013).

Tags

Biología Número 180 Café hongos haustorio histoquímica pectina microscopía
Método de doble tinción para detectar la pectina en la interacción planta-hongo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G.… More

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G. Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction. J. Vis. Exp. (180), e63432, doi:10.3791/63432 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter