Summary
该协议描述了一种检测咖啡 - 真菌相互作用中的果胶的显微镜方法。
Abstract
植物细胞使用不同的结构机制，无论是组成性的还是诱导性的，来保护自己免受真菌感染。包封是一种有效的诱导机制，用于从植物细胞原生质体中分离出真菌。相反，果胶是细胞壁的聚合组分之一，是坏死性相互作用中几种果胶溶解酶的靶标。在这里，提出了通过光学显微镜检测果胶和真菌菌丝的方案。研究了锈菌 Hemileia vastatrix 感染的咖啡叶细胞中富含果胶的包封和 由Cercospora coffeicola 诱导的叶肉细胞壁修饰。用Karnovsky溶液固定病变的叶样品，脱水，并嵌入乙二醇甲基丙烯酸酯中2-4天。所有步骤之后进行真空泵送，以去除细胞间空间中的空气并改善包埋过程。将嵌入的块切成5-7μm厚的部分，将其沉积在覆盖有水的载玻片上，随后在40°C下加热30分钟。接下来，将载玻片在乳酚中用5%棉蓝色双染色以检测真菌，并在水中用0.05%钌红检测果胶（果胶的多尿酸性基团）。 发现Hemileia vastatrix 的真菌haustoria被果胶封装。在咖啡脑孢子虫病中，叶肉细胞表现出细胞壁的溶解，并观察到细胞间菌丝和分生孢子。这里介绍的方法有效地检测植物 - 真菌相互作用中的果胶相关反应。
Introduction
植物中的细胞壁防御机制对于抑制真菌感染至关重要。研究报告了自19世纪 以来细胞壁厚度和组成的变化1，2。这些变化可以由真菌病原体诱导，其刺激的形成，从而阻止真菌进入细胞或可用于封装菌丝以从真菌 haustoria 中分离宿主细胞原生质体。动态细胞壁屏障（即和完全包裹的锄）的产生对于促进植物抗性很重要 3 。真菌相关疾病的组织病理学研究已经研究了这些机制的发生，并描述了细胞壁聚合物，纤维素，半纤维素（阿拉伯木聚糖）和胼胝糖作为真菌攻击的抗性机制4，5，6，7。
细胞壁是抵御微生物攻击的第一道屏障，损害了植物与真菌的相互作用。荔枝多糖构成细胞壁，约占真双子草植物原代细胞细胞壁组成的30%，其中同型半乳糖素是最丰富的聚合物（约60%）8。高尔基体分泌复杂的果胶化合物，这些化合物组成半乳糖醛酸链，其可能甲基化，也可能不甲基化8，9。自2012年以来，文献指出，果胶甲基酯化的程度对于确定微生物果胶酶10，11，12感染期间的相容性至关重要。因此，需要协议来验证植物 - 真菌病理系统中果酸化合物的存在和分布。
已经使用了各种技术来检测或的包封。使用的参比方法是固定组织的透射电子显微镜（TEM）和活组织和固定组织的光学显微镜。关于TEM，一些研究已经证明了细胞壁介合在真菌抗性13，14，15，16中的结构作用，并且使用凝集素和抗体是定位碳水化合物聚合物16的复杂方法。然而，研究表明，光学显微镜是一种重要的方法，组织化学和免疫组织化学工具可以更好地了解和铽包裹的组成 6 ， 7 。
致病真菌表现出两种主要类型的生活方式：生物养性和坏死性。生物养真菌依靠活细胞作为营养，而坏死养真菌杀死宿主细胞，然后生活在死亡组织中17。在拉丁美洲，咖啡叶锈病是由真菌 Hemileia vastatrix引起的，是咖啡作物中的重要疾病18，19。 Hemileia vastatrix 呈现生物营养行为，并且在抗性咖啡物种或品种中观察到的结构变化中，已经报道了超敏反应，胼胝糖，纤维素和木质素在细胞壁上的沉积以及细胞肥大14。据作者所知，文献中没有报道果胶在咖啡防锈性中的重要性。另一方面，引起脑孢子虫病的坏死性真菌 通过 一组与细胞壁降解相关的酶（例如果胶酶和聚半乳糖苷酶20）靶向果胶。咖啡中的Cercosporiosis，由真菌 Cercospora coffeicola 引起，也是对咖啡作物的主要威胁21，22。这种真菌在叶子和浆果中引起坏死性病变。渗透后， C. coffeicola 通过细胞内和细胞间途径23，24，25定植植物组织。
本方案研究细胞壁上真菌结构和果胶的存在。该方案可用于鉴定与果胶（用钌红染料染色，其特异性于果胶的多尿酸酸性基团）相关的植物反应，由宿主在与真菌的生物营养相互作用中诱导。它还有助于验证坏死菌养真菌对乳酸细胞壁降解的影响。结果表明，双染色法对鉴别真菌的结构和生殖阶段是有效的。
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Protocol
1. 缓冲液和试剂的制备
- 通过将4.28g二甲苯酸钠加入100mL蒸馏水中制备2M二甲肱酸盐缓冲液，并用0.2 N HCl将pH调节至7.25。
- 通过混合10 mL 25%戊二醛水溶液，10mL 10%甲醛水溶液，25 mL 2M二甲苯磺酸盐缓冲液和0.5mL 0.5 M CaCl2 26，制备100 mL Karnovsky固定液。用蒸馏水将体积增至100 mL。
注意：溶液可以在冰箱中保存6个月。
注意：二甲肱酯缓冲液有毒;因此，在通风橱或开放区域处理固定溶液。避免吸入溶液蒸气，并在处理时戴上手套。 - 通过混合以下方法制备Hoagland水溶液：3 mM Ca（NO3）2.4H 2 O，2 mM NH4H2PO4，5 mM KH2PO4，2 mM MgSO4.7H 2O，9.07 mM MnSO4，0.765 mM ZnSO4.7H 2O，46.4 mM H3BO3， 0.09 mM Na2MoO4.H2O、0.01 mM CuSO4 和 36 mM FeSO 4.7H2O 作为铁-EDTA（乙二胺四乙酸）27。
2. 植物样品和真菌接种
注意：对于受咖啡锈病影响的叶子的实验，五个2个月大的 阿拉比卡咖啡 幼苗cv。Catuaí在巴西圣保罗州皮拉西卡巴圣保罗大学核能农业中心（CENA）的温室中种植和饲养。
- 在装有Hoagland营养液水溶液（pH值〜5.5）的500mL塑料盆中生长咖啡植物，在保持在27±3°C的生长室中生长4个月，由LED灯在光子通量为250μmol光子s-1 m-2 下产生12小时的光周期。每周更换Hoagland营养液，持续4个月。
- 按照参考文献28中描述的方法，在其逆轴表面上用1 x 103H. vastatrix uredospores接种来自五种植物的四片膨胀的叶子。接种后，用黑色塑料袋覆盖植物，在黑暗中保持植物48小时。接种后30天收获病变。
- 从阿拉比卡咖啡cv中收获由Cercospora coffeicola引起的特征性病变。奥巴塔工厂位于巴西圣保罗州坎皮纳斯生物研究所（坐标：-22.906506126269942，-47.015075902025266）。在处理样品之前，在立体显微镜中分析病变以验证咖啡分生孢子C.然后，用分生孢子安装一些载玻片以确认疾病病因22。
3. 样品采集、固定和脱水
- 使用手术刀和镊子，在病变的中间区域（黄色斑点;图1）并将其浸入30 mL Karnovsky固定剂溶液中（图1和图2A）。固定步骤可以在冰箱中进行48小时。
- 至少四次，使用油泵将叶样品置于低真空（500-600mBar）下15分钟，以增加固定溶液在叶组织中的渗透性。使用样品旋转执行此步骤（图1）。
- 固定后，在0.5M二甲肟缓冲液（pH 7.2）中洗涤叶样品三次，每次在蒸馏水中稀释5分钟，然后将其转移到分级乙醇系列（30%，50%，70%，90%（2x）和100%（2x））中15分钟，每种乙醇浓度（图1 和 图2B）。
4. 组蛋白包埋程序
- 按照制造商的说明，通过三个步骤将样品逐渐转移到甲基丙烯酸乙二醇酯（GMA）中。首先，通过将GMA粉末（1g）与100mL碱性树脂（组蛋白试剂盒; 材料表）在磁激越下，然后按照以下步骤操作。
- 将样品浸入1：2溶液A：100%乙醇中3小时。
- 将样品浸入1：1溶液A：100%乙醇中3小时。
- 将样品浸入纯碱性树脂中2-4天。在此步骤中，将样品置于低真空下，每天至少四次，持续15分钟，然后旋转。
5. 聚合
注：聚合工艺需要 1.2 mL 塑料模具、碱性树脂和固化剂（有关商用试剂盒的详细信息，请参见 材料表 ）。
- 将15 mL溶液A（步骤4.1）与1mL固化剂在烧杯中旋转2分钟混合，以产生聚合溶液（溶液B）。
- 将1.2 mL聚合溶液（溶液B）放入塑料模具中。使用木镐，将病变的叶样品从纯碱性树脂转移到溶液B中（图2C）。避免使用镊子，因为它们会导致组织破碎。
- 确保快速定位垂直于塑料模具的叶片样品，因为溶液B在5分钟内迅速变得粘稠。可以将多个病变的叶子样品放置在单个模具中。
注意：建议在申请许多样品之前多次练习上述步骤。当样品很多时，模具之间的聚合时间不同，并且叶片样品的垂直取向可能难以实现。 - 当叶片样品的垂直取向达到时，等待30分钟，然后将塑料模具转移到含有硅胶的塑料或玻璃室中以防止潮湿。等待2-3小时聚合。
- 一旦树脂和叶样品在2-3小时后聚合，通过用打磨锉刀打磨块基，将产生的块从塑料模具中分离出来。然后，将块粘在一块木头上（图2D）。
6. 切片
- 使用配备8厘米钢刀片的旋转切片机（图2E），将块切成5μm厚的部分。将切片放在覆盖有蒸馏水的载玻片上。将切片漂浮在水面上的载玻片转移到40°C的热板上干燥并促进切片与载玻片的粘附。
- 干燥后（图2F），用块参考名称和载玻片编号标记载玻片。
7. 双重染色工艺
- 用2mL乳酚（40%甘油，20%苯酚和20%乳酸）覆盖切片，并在45°C的热板上加热5分钟（图3A）。
- 通过在装有蒸馏水的烧杯中洗涤载玻片三次来除去多余的染料（图3B-D）。
- 用2mL0.01%钌红在水中染色1分钟（图3E）。
- 通过在装有蒸馏水的烧杯中洗涤载玻片三次来除去多余的染料（图3F，G）。
- 在切片上滴一滴蒸馏水，并用24 mm x 60 mm盖玻片覆盖切片，以进行光学显微镜分析。
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Representative Results
GMA包埋部分的棉蓝色乳酚染色揭示了在生物营养和坏死营养真菌相互作用中咖啡叶肉细胞之间和内部存在几种真菌结构。
在生物营养病理系统中，当使用双染色方法染色时，含有细胞壁和致密原生质体含量的 Hhemileia vastatrix 菌丝在海绵状和栅栏实质中均以深蓝色出现（图4A，B）。茴雌雄母细胞（Hmc）和茴香母细胞也表现出强烈的深蓝色（图4C）。当用钌红复染时，细胞间空间中的真菌分布被清楚地定义（图4D）。深蓝色 Hmc 的存在有助于检测感染区域。在相互作用过程中， H. vastatrix Hmc打破了宿主细胞壁，并发展出可以被拟酸化合物包围的宫颈（图4E，F）。然而，宫颈富含果胶的包封（粉红色）不能阻止宫颈形成（图4E，F）。在某些情况下，富含果胶的封装不完全包裹haustorium（图4G），在某些情况下，haustorium完全封装（图4H）。
在坏死养成相互作用中，双重染色方案也有助于验证 咖啡孢子虫 与咖啡叶肉组织的相互作用。在真菌不存在的病变边缘，富含果胶的细胞壁保持其完整性（图5A）。双染色方法证明了细胞间菌丝的存在（图5B，C）。在相互作用区，果胶细胞壁似乎由于溶解而失去完整性（图5B，C）。生殖结构，如分生孢子，在上轴表皮中被发现（图5D）。在亚室中，发现 C. coffeicola 菌丝作为卷曲结构。病变区域的栅栏实质似乎经历细胞壁裂解（图5E）。
图1：方案中收获病变组织的各个步骤的详细信息。 用手术刀和镊子收获病变的碎片。将叶样品浸入固定溶液中。对样品进行真空泵送和旋转。遵循脱水和包埋过程的协议。将聚合的样品在旋转切片机中切片。使用双染色方法对带有病变切片的载玻片进行安装和染色，以验证真菌菌丝和富含果胶的细胞壁。 请点击此处查看此图的大图。
图2：双重染色前样品部分各个步骤的详细信息。 （A）固定步骤。（二）分级乙醇系列脱水;将叶组织以每种浓度在乙醇中孵育15分钟。（C）塑料模具内部的聚合。（D）将聚合样品块粘在一块木头上。（E）放置在切片机上的木胶块，用于切片过程。（F）载玻片上的组织切片（用箭头表示）。 请点击此处查看此图的大图。
图3：双重染色方案各个步骤的详细信息。 （A）用棉蓝色乳酚滴覆盖切片，并在45°C的热板上加热载玻片。（B-C）用蒸馏水洗涤除去多余的染料。（D）洗涤后载玻片上的部分（用箭头表示）。（E）用钌红滴覆盖各部分。（F-G）通过在蒸馏水中洗涤来去除多余的染料。请点击此处查看此图的大图。
图4：咖啡锈病病变中果胶和真菌结构的组织化学双重染色方案。 （A-C）部分仅用棉蓝色乳酚染色。真菌菌丝被染成深蓝色（箭头）。haustorium母细胞（Hmc）和haustorium（Ha）具有深蓝色。（D-H）使用棉蓝色乳酚和钌红进行双重染色。（D）叶子上脓疱（Pu）概述。（E-F）带果胶（粉红色 -红色）的胸甲颈（箭头）。（G）箭头表示富含果胶的钵的开始。（H） 用果胶（箭头）完全包封豪门。Epi Aba - 表皮异常;Epi Ada - 表皮内轴;Sp - 海绵状实质;Pp - palisade parenchyma.请点击此处查看此图的大图。
图5：咖啡叶肉组织中脑孢子虫病病变中果胶和真菌结构的组织化学双重染色方案。 （A）病灶边缘无真菌。（B-F）病变叶子的横截面。（A）海绵状薄壁富含果胶的细胞壁的完整性。（B-D，F）在感染组织中，Cercospora coffeicola菌丝是明显的（箭头），并在果胶细胞壁中引起损伤。可以验证角质层（CT）（D）下的分生孢子。Epi Aba - 表皮异常;Epi Ada - 表皮内轴;Sp - 海绵状实质;Pp - 帕利塞德帕伦奇玛;圣 - 气孔。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
本工作引入了一种替代的双染色组织化学测试，以研究细胞壁的果胶组成，该细胞壁在生物营养病理系统中封装了haustoria。目的还在于证明该方法检测其诱导的坏死性真菌和细胞壁变化的功效。在这里，咖啡实质细胞壁的果胶可以封装锈菌 Hemileia vastatrix的颈部和haustorium。Silva等人还描述了纤维素和胼胝糖在咖啡H. vastatrix 病理系统14，29中的包封。在与防御机制相关的细胞壁聚合物中，果胶在植物病原体系统中起重要作用10，11，12。因此，了解果胶功能具有很大的组织病理学价值。
咖啡中的Cercosporiosis由Cercospora coffeicola引起，会损害叶组织并最终导致细胞死亡。这些症状主要是由脑孢菌素和细胞壁降解酶20的活性引起的。使用钌红的研究表明细胞壁完整性丧失，类似于先前对柿子叶感染的柿子叶的研究30。 使用双染色方法的组织病理学分析证明了真菌菌丝的存在，并且该分析可有效检测细胞间空间中的真菌菌丝。或者，扫描电子显微镜（SEM）已显示出观察C. coffeicola菌丝25的功效;然而，这种复杂设备的可用性以及样品制备的艰苦工作是一个限制因素。此外，SEM分析不允许在细胞壁中化学识别果胶。相反，双重染色是检测果胶变化的重要方法。然而，这里描述的方法在光学显微镜的分辨率方面具有局限性，不允许增加植物 - 真菌相互作用的超微结构的细节。此外，这里介绍的双重染色方法不是专门用于检测真菌种类的，因此必须进行额外的分子论文。
样品制备遵循植物解剖学中的常规方案;但是，有些要点需要特别注意。例如，固定是一个关键步骤。样品的大小和收获它们的小心对于良好的固定至关重要。时间，温度，pH值和渗透压对植物组织至关重要31。病变的叶组织是地上器官，必须进行轻度真空以改善固定。使用乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA）需要乙醇作为脱水溶剂;未适当脱水的组织在包埋过程中可能会遇到困难。当植物组织具有许多酚类化合物时，这种情况会恶化，例如咖啡叶的情况。此外，处理组织的小部分很重要;否则，需要替代的嵌入方法32。
这里介绍的双染色技术是对Marques等人报道的方案的改编。在该协议中，作者使用棉蓝（5%）和1%沙夫兰素来区分真菌结构和植物细胞壁。该技术可用于检测不同病理系统中真菌的存在，例如拟南芥34中的Colletotrichum acutatum-citrus花瓣和Guignardia citricarpa-citrus fruit33Plasmodiophora brassicae，Vitis labrusca35中的Elsinoë ampelina等。最近，Marques和Soares36编制了一系列显微技术，包括光和荧光方法，以区分植物和真菌的特征37。但是，在某些地区或国家，例如巴西，荧光显微镜和SEM可能无法使用;因此，使用光学显微镜是大学和高中采用的研究甚至教学方法的重要且更便宜的替代方案。真菌菌丝已被棉蓝色染料36，38，39，40在植物和动物组织中显微镜检测到。这与染料与富含甲壳素的真菌壁40的正反应有关。棉蓝色配方包括乳酚，乳酚是一种充当组织41的媒染剂的溶液，从而在与棉蓝色混合时保持真菌结构。
在这里，0.05%的钌红被用来代替沙夫兰素。本研究中提出的积极方面是果胶（细胞壁的一种特定聚合物）被染色以提供重要的定性数据。钌红是一种试剂，用于检测果胶多尿酸42，43，44的酸性基团。它对果胶具有特异性，并且不会染色细胞壁的其他碳水化合物成分（即纤维素或胼胝糖）。排列在不同结构和生化骨架中的半乳糖醛酸链组成果胶8，9，45。钌红对细胞壁的反应性取决于甲基酯化的程度11。甲基酯化的程度取决于果胶甲基酯酶（PME）的活性，因此钌红也被用作区分PME活性11的工具。
因此，这里描述的双染色方法是验证植物 - 真菌相互作用中果胶修饰的有用工具。据作者所知，这是果胶在咖啡锈菌的haustorial封装中的第一篇报道。有趣的是，双染色方法对于观察真菌结构，描述对富果胶细胞壁造成的损害以及验证真菌生殖结构也很重要。应进一步研究锈病、炭疽病、脑孢子病、黑穗病和其他生物营养、半生物营养和坏死性植物-真菌相互作用的组织病理学研究，以研究该技术在不同病理系统中的潜在应用。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
作者希望感谢Hudson W. P. de Carvalho博士对开发这项工作的支持。作者还感谢电子显微镜实验室“Elliot Watanabe Kitajima教授”提供光学显微镜设施。作者感谢Flávia Rodrigues Alves Patrício博士为植物材料提供病灶。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blades DB80 HS | Leica | 14035838383 | Sectioning |
| Cacodylate buffer | EMS | # 11652 | Fixation |
| Cotton Blue Lactophenol | Metaquímica | 70SOLSIG024629 | Staining |
| Formaldehyde | EMS | #15712 | Fixation |
| Glutaraldehyde | EMS | #16216 | Fixation |
| Historesin Kit | Technovit /EMS | #14653 | Historesin for embedding |
| Hot plate | Dubesser | SSCD25X30-110V | Staining |
| Microscopy | Zeiss | #490040-0030-000 | Image capture |
| Microtome (Leica RM 2540) | Leica | 149BIO000C1 14050238005 | Sectioning |
| Plastic molding cup tray | EMS | 10176-30 | Staining |
| Ruthenium red | LABHouse | #006004 | Staining |
| Software Axion Vision | Zeiss | #410130-0909-000 | Image capture |
| Vaccum pump | Prismatec | 131 TIPO 2 V.C. | Fixation |
References
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