Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dobbeltfarvningsmetode til påvisning af pektin i interaktion mellem plante og svampe

Published: February 4, 2022 doi: 10.3791/63432
Automatic Translation
1, 2
1Faculty of Animal Science and Food Engineering, Department of Basic Sciences, University of São Paulo, 2Laboratory of Nuclear Instrumentation, Center of Nuclear Energy in Agriculture, University of São Paulo

Summary

Denne protokol beskriver en mikroskopisk metode til påvisning af pektin i kaffe-svamp interaktion.

Abstract

Planteceller bruger forskellige strukturelle mekanismer, enten konstitutive eller inducerbare, til at forsvare sig mod svampeinfektion. Indkapsling er en effektiv inducerbar mekanisme til at isolere svampehaustoria fra plantecelleprotoplasten. Omvendt er pektin, en af de polymere komponenter i cellevæggen, et mål for flere pektolytiske enzymer i nekrotrofe interaktioner. Her præsenteres en protokol til påvisning af pektin og svampehyfer gennem optisk mikroskopi. Den pektinrige indkapsling i cellerne i kaffeblade inficeret af rustsvampen Hemileia vastatrix og mesophyllcellevægmodifikationen induceret af Cercospora coffeicola undersøges. Læsionerede bladprøver blev fastgjort med Karnovsky-opløsningen, dehydreret og indlejret i glycolmethacrylat i 2-4 dage. Alle trin blev efterfulgt af vakuumpumpning for at fjerne luft i de intercellulære rum og forbedre indlejringsprocessen. De indlejrede blokke blev opdelt i 5-7 μm tykke sektioner, som blev deponeret på en glasrutschebane dækket med vand og efterfølgende opvarmet til 40 ° C i 30 minutter. Dernæst blev diasene dobbeltfarvede med 5% bomuldsblå i lactophenol for at detektere svampen og 0,05% rutheniumrød i vand for at detektere pektin (sure grupper af polyuronsyrer af pektin). Svampe haustoria af Hemileia vastatrix viste sig at være indkapslet af pektin. I kaffe cercosporiosis udviste mesophyllceller opløsning af cellevægge, og intercellulære hyfer og conidiophores blev observeret. Metoden, der præsenteres her, er effektiv til at detektere et pektin-associeret respons i plante-svampe-interaktionen.

Introduction

Cellevægsforsvarsmekanismer i planter er afgørende for at begrænse svampeinfektion. Undersøgelser har rapporteret ændringer i cellevægstykkelse og sammensætning siden det 19. århundrede 1,2. Disse ændringer kan induceres af et svampepatogen, der stimulerer dannelsen af en papilla, som forhindrer svampe i at komme ind i cellen eller kan bruges til at indkapsle hyferne for at isolere værtscellens protoplast fra svampehaustoria. Produktionen af en dynamisk cellevægsbarriere (dvs. papiller og et fuldt indkapslet haustorium) er vigtig for at fremme plantebestandighed3. Histopatologiske undersøgelser af svamperelaterede sygdomme har undersøgt forekomsten af disse mekanismer og har beskrevet cellevægspolymerer, cellulose, hemicellulose (arabinoxylaner) og callose som resistensmekanismer over for svampeangreb 4,5,6,7.

Cellevæggen er den første barriere mod mikroorganismeangreb, der forringer plante-svampeinteraktionen. Pektiske polysaccharider komponerer cellevæggen og tegner sig for ca. 30% af cellevægssammensætningen i primære celler i eudicotplanter, hvor homogalacturonans er den mest rigelige polymer (ca. 60%)8. Golgi udskiller komplekse pektinforbindelser, der omfatter galacturonsyrekæderne, som måske eller måske ikke er methyleret 8,9. Siden 2012 har litteraturen påpeget, at graden af pektinmethylesterificering er afgørende for at bestemme kompatibiliteten under infektion med mikrobielle pektiske enzymer 10,11,12. Således kræves protokoller for at verificere tilstedeværelsen og fordelingen af pektiske forbindelser i plantesvampepatosystemer.

Forskellige teknikker er blevet brugt til at detektere indkapsling af papiller eller haustoria. De anvendte referencemetoder er transmissionselektronmikroskopi (TEM) af fast væv og lysmikroskopi af levende og fast væv. Med hensyn til TEM har flere undersøgelser vist den strukturelle rolle, som cellevægsappositioner spiller i svamperesistens 13,14,15,16, og at brugen af lektiner og antistoffer er en indviklet metode til at lokalisere kulhydratpolymerer16. Undersøgelser viser imidlertid, at lysmikroskopi er en vigtig tilgang, og at de histokemiske og immunhistokemiske værktøjer giver en bedre forståelse af sammensætningen af papiller og haustoriumindkapsling 6,7.

Patogene svampe viser to hovedtyper af livsstil: biotrofisk og nekrotrofisk. Biotrofiske svampe er afhængige af levende celler for deres ernæring, mens nekrotrofe svampe dræber værtscellerne og derefter lever i de døde væv17. I Latinamerika er kaffebladrust, forårsaget af svampen Hemileia vastatrix, en vigtig sygdom i kaffeafgrøder18,19. Hemileia vastatrix præsenterer en biotrofisk adfærd, og blandt de strukturelle ændringer, der observeres i resistente kaffearter eller sorter, er der rapporteret om et overfølsomhedsrespons, aflejring af callose, cellulose og lignin på cellevæggene samt cellehypertrofi14. Så vidt forfatterne ved, rapporterer litteraturen ikke oplysninger om pektins betydning for kafferustbestandighed. På den anden side er nekrotrofe svampe, der forårsager cercosporiosis, målrettet mod pektin via et sæt enzymer forbundet med nedbrydning af cellevæggen, såsom pektinaser og polygalacturonase20. Cercosporiosis i kaffe, forårsaget af svampen Cercospora coffeicola er også en stor trussel mod kaffeafgrøder21,22. Denne svamp forårsager nekrotiske læsioner i både blade og bær. Efter penetration koloniserer C. coffeicola plantevæv gennem intracellulære og intercellulære veje 23,24,25.

Den nuværende protokol undersøger tilstedeværelsen af svampestrukturer og pektin på cellevægge. Denne protokol er nyttig til at identificere planteresponsen forbundet med pektin (farvet med rutheniumrødt farvestof, som er specifikt for sure grupper af polyuronsyrer af pektin), induceret af værten i en biotrofisk interaktion med svampe. Det hjælper også med at verificere virkningen af nekrotrofe svampe på nedbrydningen af pektiske cellevægge. De foreliggende resultater tyder på, at den dobbelte farvningsmetode er effektiv til at diskriminere strukturer og svampens reproduktive fase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af bufferopløsningen og reagenserne

  1. Der fremstilles 2 M cacodylatbuffer ved tilsætning af 4,28 g natriumkacodylat til 100 ml destilleret vand, og pH-værdien justeres til 7,25 med 0,2 N HCL.
  2. Forbered 100 ml karnovsky-fikseringsopløsningen ved at blande 10 ml 25% vandigt glutaraldehyd, 10 ml 10% vandig formaldehyd, 25 ml 2 M cacodylatbuffer og 0,5 ml 0,5 M CaCl226. Der fyldes op til 100 ml med destilleret vand.
    BEMÆRK: Opløsningen kan opbevares i køleskab i 6 måneder.
    FORSIGTIG: Cacodylatbufferopløsningen er giftig; håndter derfor den fikserende opløsning i en stinkhætte eller et åbent område. Undgå at indånde opløsningsdampene og brug handsker under håndtering.
  3. Forbered vandig Hoagland næringsopløsning ved at blande følgende: 3 mM Ca(NO3)2,4H20,2 mMNH4H2PO4, 5 mM KH 2PO4, 2 mM MgSO4,7H20, 9,07 mM MnSO4,0,765 mM ZnSO 4,7H20, 46,4 mM H3BO3, 0,09 mM Na2MoO4. H20, 0,01 mM CuSO4 og 36 mM FeSO 4,7H20 som jern-EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre)27.

2. Planteprøver og svampepodning

BEMÆRK: Til forsøg på blade, der er ramt af kafferust, fem 2 måneder gamle frøplanter af Coffee arabica cv. Catuaí blev dyrket og opbevaret i et drivhus på Center of Nuclear Energy in Agriculture (CENA) ved University of São Paulo, Piracicaba, São Paulo State, Brasilien.

  1. Dyrk kaffeplanter i 500 ml plastpotter fyldt med vandig Hoagland næringsopløsning (pH på ~ 5,5) i 4 måneder i et vækstkammer holdt ved 27 ± 3 ° C med en 12 timers fotoperiode skabt af LED-lamper ved fotonfluxen på 250 pmolfotoner s-1 m-2. Udskift Hoagland næringsopløsningen hver uge i 4 måneder.
  2. Inokuler fire ekspanderede blade fra fem planter på deres abaksiale overflader med 1 x 103 H. vastatrix uredosporer efter metoden beskrevet i reference28. Efter podning skal du holde planterne i 48 timer i mørket ved at dække dem med en sort plastikpose. Høst læsionerne 30 dage efter podning.
  3. Høst karakteristiske læsioner forårsaget af Cercospora coffeicola fra Coffea arabica cv. Obatã planter placeret (koordinater: -22.906506126269942, -47.015075902025266) ved Biologisk Institut, Campinas, São Paulo State, Brasilien. Før du behandler prøven, skal du analysere læsionerne i et stereomikroskop for at verificere tilstedeværelsen af kaffe C. coffeicola conidia. Monter derefter nogle dias med conidia for at bekræfte sygdommens ætiologi22.

3. Prøvehøst, fiksering og dehydrering

  1. Brug en skalpel og pincet til at høste en ~ 10 mm2 bladprøve i det midterste område af læsionen (gule pletter; Figur 1) og nedsænk det i 30 ml Karnovsky fikseringsopløsning (figur 1 og figur 2A). Fikseringstrinnet kan finde sted i køleskab i 48 timer.
  2. I mindst fire gange skal bladprøven udsættes for et lavt vakuum (500-600 mBar) ved hjælp af en oliepumpe i 15 minutter hver for at øge permeabiliteten af den fikserende opløsning i bladvævet. Udfør dette trin med prøverotation (figur 1).
  3. Efter fiksering vaskes bladprøven tre gange i 0,5 M kakodylatbuffer (pH 7,2) fortyndet i destilleret vand i 5 minutter hver og overføres derefter til en gradueret ethanolserie (30%, 50%, 70%, 90% (2x) og 100% (2x)) i 15 minutter ved hver ethanolkoncentration (figur 1 og figur 2B).

4. Historesin indlejring procedure

  1. Overfør gradvist prøverne til glycolmethacrylat (GMA) i tre trin efter producentens anvisninger. Først fremstilles opløsning A ved at blande GMA-pulveret (1 g) med 100 ml basisk harpiks (historesinsæt; Tabel over materialer) under magnetisk omrøring, og følg derefter nedenstående trin.
    1. Prøverne nedsænkes i 1:2 Opløsning A: 100% ethanol i 3 timer.
    2. Prøverne nedsænkes i 1:1 Opløsning A: 100% ethanol i 3 timer.
    3. Sænk prøverne i en ren basisk harpiks i 2-4 dage. I løbet af dette trin udsættes prøverne for et lavt vakuum mindst fire gange om dagen i 15 minutter efterfulgt af rotation.

5. Polymerisation

BEMÆRK: Polymerisationsprocessen kræver 1,2 ml plastforme, basisk harpiks og hærder (se materialetabellen for detaljerne i det kommercielle kit).

  1. 15 ml opløsning A (trin 4.1) blandes med 1 ml hærder i et bægerglas med rotation i 2 minutter for at fremstille polymerisationsopløsningen (opløsning B).
  2. Sæt 1,2 ml polymerisationsopløsningen (opløsning B) i plastforme. Brug en træplukker til at overføre de læsionerede bladprøver fra ren basisk harpiks til opløsning B (figur 2C). Undgå at bruge pincet, da de kan forårsage vævsknusning.
  3. Sørg for hurtigt at orientere bladprøver vinkelret på plastformene, da opløsning B hurtigt bliver tyktflydende inden for 5 minutter. Mere end en læsionet bladprøve kan placeres i en enkelt form.
    BEMÆRK: Det anbefales at øve ovenstående trin flere gange, før du ansøger om mange prøver. Når der er mange prøver, er polymerisationstiden forskellig mellem formene, og den vinkelrette orientering af bladprøverne kan være vanskelig at opnå.
  4. Når den vinkelrette orientering af bladprøverne er opnået, skal du vente i 30 minutter og derefter overføre plastformen til et plast- eller glaskammer indeholdende silicagel for at forhindre fugtighed. Vent i 2-3 timer til polymerisation.
  5. Når harpiksen og bladprøven er polymeriseret efter perioden 2-3 timer, skal du løsne den resulterende blok fra plastformen ved at slibe blokbasen med en slibefil. Lim derefter blokken på et stykke træ (figur 2D).

6. Sektionering

  1. Brug en roterende mikrotome udstyret med 8 cm stålblade (figur 2E) til at skære blokken i 5 μm tykke sektioner. Placer sektionerne på glasrutschebaner dækket med destilleret vand. Overfør rutsjebanerne med sektionerne, der flyder over vand, til en kogeplade ved 40 °C for at tørre og fremme sektionernes vedhæftning til glasrutsjebanerne.
  2. Efter tørring (figur 2F) skal du mærke glasrutsjebanerne med blokreferencenavnet og diasnummeret.

7. Dobbelt farvningsproces

  1. Dæk sektionerne med 2 ml 5% bomuldsblå i lactophenol (40% glycerol, 20% phenol og 20% mælkesyre i vand) og opvarm dem på en kogeplade ved 45 °C i 5 minutter (figur 3A).
  2. Fjern det overskydende farvestof ved at vaske glideren tre gange i et bægerglas fyldt med destilleret vand (figur 3B-D).
  3. Plet med 2 ml 0,01% rutheniumrød i vand i 1 min (figur 3E).
  4. Fjern det overskydende farvestof ved at vaske glideren tre gange i et bægerglas fyldt med destilleret vand (figur 3F,G).
  5. Læg en dråbe destilleret vand over sektionerne og dæk sektionerne med et 24 mm x 60 mm dækslip til udførelse af lysmikroskopianalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den bomuldsblå lactophenolfarvning på den GMA-indlejrede sektion afslørede tilstedeværelsen af flere svampestrukturer mellem og inde i kaffemesophyllceller i både biotrofiske og nekrotrofe svampeinteraktioner.

I det biotrofiske patosystem, når det farves ved hjælp af dobbeltfarvningsmetoden, vises Hemileia vastatrix hyfer indeholdende cellevægge og det tætte protoplastindhold i mørkeblåt i både svampet og palisadeparenkym (figur 4A, B). Haustoriummodercellen (Hmc) og haustoria udviser også en stærk mørkeblå farve (figur 4C). Når den er modfarvet med rutheniumrød, er svampefordelingen i de intercellulære rum klart defineret (figur 4D). Tilstedeværelsen af en mørkeblå Hmc hjælper med at detektere infektionszonen. Under interaktionen brød H. vastatrix Hmc værtscellevæggen og udviklede en haustorial hals, der kunne være omgivet af pektiske forbindelser (figur 4E, F). Ikke desto mindre er den pektinrige indkapsling (lyserød-rød farve) af den haustoriale hals ikke i stand til at forhindre haustorial dannelse (figur 4E,F). I nogle tilfælde indkapslede den pektinrige indkapsling haustorium ufuldstændigt (figur 4G), og i nogle tilfælde er haustoriumet fuldt indkapslet (figur 4H).

I den nekrotrofe interaktion var den dobbelte farvningsprotokol også nyttig til at verificere interaktionen mellem Cercospora coffeicola og kaffe mesophyll væv. Ved læsionsgrænsen, hvor svampen ikke er til stede, bevarede den pektinrige cellevæg sin integritet (figur 5A). Den dobbelte farvningsmetode viste tilstedeværelsen af intercellulære hyfer (figur 5B,C). I interaktionszoner syntes pektincellevægge at miste deres integritet på grund af opløsning (figur 5B,C). Reproduktive strukturer, såsom conidiophore, blev fundet i den adaksiale epidermis (figur 5D). I det substomatiske kammer blev C. coffeicola hyfer fundet som krøllestrukturer. Palisadeparenkymet i det læsionerede område synes at gennemgå cellevægslyse (figur 5E).

Figure 1
Figur 1: Detaljer om de enkelte trin i protokollen til høst af læsionerede væv. Høst læsionsstykket med en skalpel og en pincet. Sænk bladprøverne i den fikserende opløsning. Emnerne udsættes for vakuumpumpning og rotation. Følg protokollen for dehydrerings- og indlejringsprocesserne. Den polymeriserede prøve er opdelt i et roterende mikrotom. Diasene med læsionssektioner er monteret og farvet for at verificere svampehyfer og pektinrige cellevægge ved hjælp af dobbeltfarvningsmetoden. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Detaljer om de enkelte trin i prøveafsnittet før dobbeltfarvning. (A) Fikseringstrin. B) Dehydrering i klassificerede ethanolserier bladvævet inkuberes i ethanol i 15 minutter ved hver koncentration. (C) Polymerisation inde i plastformen. (D) Blok af polymeriseret prøve limet på et stykke træ. E) Trælimet blok placeret på mikrotomet til sektioneringsprocessen. (F) Vævssektioner på diaset (betegnet med pile). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Detaljer om de enkelte trin i dobbeltfarvningsprotokollen. (A) Dæk sektionerne med dråber bomuldsblå lactophenol, og opvarm lysbillederne på en kogeplade ved 45 °C. (B-C) Fjern det overskydende farvestof ved vask i destilleret vand. (D) Sektioner på glasrutsjebanerne efter vask (betegnet med pile). (E) Dæk sektionerne med dråber rutheniumrød. (F-G) Fjern det overskydende farvestof ved at vaske i destilleret vand. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Histokemisk dobbeltfarvningsprotokol for pektin- og svampestrukturer i kafferustlæsion. (A-C) Sektioner farvet kun med bomuldsblå lactophenol. Svampehyfer er farvet i mørkeblå (pile). Haustoriummodercellen (Hmc) og haustorium (Ha) har en mørkeblå farve. (D-H) Dobbelt farvning ved hjælp af bomuldsblå lactophenol og rutheniumrød. (D) Oversigt over pustule (Pu) på et blad. (E-F) Haustorial hals (pile) med pektin (pink-rød farve). (G) Pile angiver begyndelsen på pektinrig indkapsling af haustorium. (H) Fuldstændig indkapsling af haustorium med pektin (pile). Epi Aba - Epidermis abaxial; Epi Ada - Epidermis adaxial; Sp - svampet parenchyma; Pp - palisade parenchyma. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Histokemisk dobbeltfarvningsprotokol for pektin- og svampestrukturer i cercosporiosis læsioner i kaffe mesophyll væv. (A) Læsionsgrænse uden svampe. (B-F) Tværsnit af det læsionerede blad. (A) Integriteten af pektinrige cellevægge i det svampede parenkym. (B-D,F) I de inficerede væv var Cercospora coffeicola hyphae tydelige (pile) og forårsagede skade i pektiske cellevægge. Det var muligt at verificere conidiophore under neglebåndet (CT) (D). Epi Aba - Epidermis abaxial; Epi Ada - Epidermis adaxial; Sp - svampet parenchyma; Pp - Palisade Parenchyma; St - Stomata. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det foreliggende arbejde introducerer en alternativ dobbeltfarvning histokemisk test for at undersøge pektinsammensætningen af cellevægge, der indkapsler haustoria i et biotrofisk patosystem. Målet er også at demonstrere effekten af metoden til at detektere nekrotrofisk svamp og cellevægsændringer induceret af den. Her kan pektin af kaffeparenkymcellevægge indkapsle både halsen og haustoriet af rustsvampen Hemileia vastatrix. Silva et al. har også beskrevet indkapsling af cellulose og callose i kaffe-H. vastatrix patosystem14,29. Blandt cellevægspolymererne forbundet med forsvarsmekanismer spiller pektin en vigtig rolle i plantepatogensystemet 10,11,12. Derfor er kendskab til pektinfunktioner af stor histopatologisk værdi.

Cercosporiosis i kaffe, forårsaget af Cercospora coffeicola, beskadiger bladvævet og fører til sidst til celledød. Disse symptomer er hovedsageligt forårsaget af aktiviteten af cercosporin og cellevægsnedbringende enzymer20. Undersøgelser med rutheniumrød viste et tab af cellevægsintegritet, svarende til en tidligere undersøgelse af persimmonblade inficeret med Pseudocercospora kaki30. Den histopatologiske analyse ved hjælp af dobbeltfarvningsmetoden viste tilstedeværelsen af svampehyferne, og denne analyse er effektiv til at detektere svampehyfer i de intercellulære rum. Alternativt har scanningselektronmikroskopi (SEM) vist effektivitet til at observere C. coffeicola hyphae25; Tilgængeligheden af sådant sofistikeret udstyr sammen med det besværlige arbejde med prøveforberedelse er imidlertid en begrænsende faktor. Desuden tillader SEM-analysen ikke kemisk genkendelse af pektin i cellevægge. Omvendt er dobbeltfarvning en vigtig metode til at detektere pektinændringer. Den her beskrevne metode har imidlertid en begrænsning med hensyn til opløsningen af lysmikroskopi, der ikke tillader en stigning i detaljer om ultrastrukturen af plante-svampeinteraktion. Den dobbeltfarvningsmetode, der præsenteres her, er heller ikke specifik til påvisning af svampearter, og yderligere molekylære essays skal derfor udføres.

Prøveforberedelsen følger rutinemæssige protokoller i plantens anatomi; dog har nogle punkter brug for særlig opmærksomhed. For eksempel er fiksering et kritisk trin. Prøvernes størrelse og omhuen ved høst af dem er afgørende for god fiksering. Tid, temperatur, pH og osmolaritet er afgørende for plantevæv31. De læsionerede bladvæv er luftorganer og skal udsættes for et mildt vakuum for at forbedre fikseringen. Anvendelsen af glycolmethacrylat (GMA) kræver ethanol som et dehydreringsmiddel; væv, der ikke er ordentligt dehydreret, kan give vanskeligheder under indlejringsprocessen. Denne tilstand forværres, når plantevævene har mange phenolforbindelser, som i tilfælde af kaffeblade. Desuden er det vigtigt at håndtere små dele af væv; Ellers kræves alternative indlejringsmetoder32.

Den dobbeltfarvningsteknik, der præsenteres her, er en tilpasning af protokollen rapporteret af Marques et al.33. I denne protokol brugte forfatterne bomuldsblå (5%) og 1% safranin til at skelne svampestrukturer og plantecellevægge. Teknikken var nyttig til at detektere tilstedeværelsen af svampe i forskellige patosystemer, såsom Colletotrichum acutatum-citrus kronblade og Guignardia citricarpa-citrusfrugt 33Plasmodiophora brassicae i Arabidopsis thaliana34, Helsinoë ampelina i Vitis labrusca35 og andre. For nylig udarbejdede Marques og Soares36en række mikroskopiske teknikker, herunder lys- og fluorescensmetoderne, for at skelne mellem plante- ogsvampeegenskaberne 37. I nogle regioner eller lande, såsom Brasilien, er fluorescensmikroskoper og SEM muligvis ikke tilgængelige; Derfor er brugen af lysmikroskoper et vigtigt og billigere alternativ til forskning og endda didaktiske metoder, der anvendes på universiteter og gymnasier. Svampehyfer er mikroskopisk påvist i både plante- og dyrevæv ved bomuldsblåt farvestof 36,38,39,40. Dette er relateret til farvestoffets positive reaktion med den chitinrige svampevæg40. Den bomuldsblå formel indeholder lactophenol, som er en opløsning, der fungerer som et mordant til vævet41 og derved bevarer svampestrukturen, når den blandes med bomuldsblå. 

Her blev 0,05% rutheniumrød brugt til at erstatte safranin. Det positive aspekt, der præsenteres i denne undersøgelse, er, at pektin, en specifik polymer af cellevæggen, blev farvet for at give vigtige kvalitative data. Rutheniumrød er et reagens, der anvendes til påvisning af sure grupper af pektinpolyuronsyrer 42,43,44. Det er specifikt for pektin og pletter ikke andre kulhydratkomponenter i cellevæggen (dvs. cellulose eller callose). Kæder af galacturonsyrer arrangeret i forskellige strukturelle og biokemiske rygrad komponerer pektin 8,9,45. Reaktiviteten af rutheniumrød til cellevæggen afhænger af graden af methylesterificering11. Graden af methylesterificering afhænger af aktiviteten af pektinmethylesteraser (PME), og rutheniumrød blev derfor også anvendt som et redskab til at diskriminere PME-aktiviteten11.

Således er den dobbeltfarvningsmetode, der er beskrevet her, et nyttigt værktøj til at verificere pektinmodifikationer i plante-svampe-interaktioner. Efter forfatternes bedste overbevisning er dette den første rapport om pektin i den haustoriale indkapsling af kafferustsvampe. Interessant nok var dobbeltfarvningsmetoden også vigtig for at observere svampestrukturer, for at beskrive skaden forårsaget af den pektinrige cellevæg og for at verificere svampens reproduktive strukturer. Yderligere histopatologiske undersøgelser af rust, anthracnose, cercosporiosis, smuts og andre biotrofiske, hæmimbiotrofe og nekrotrofe plante-svampeinteraktioner bør udføres for at undersøge den potentielle anvendelse af denne teknik i forskellige patosystemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker at takke Dr. Hudson W. P. de Carvalho for støtten til at udvikle dette arbejde. Forfatterne er også taknemmelige for Laboratory of Electron Microscopy '' Prof. Elliot Watanabe Kitajima '' for at levere lysmikroskopifaciliteten. Forfatterne takker Dr. Flávia Rodrigues Alves Patrício for at have leveret plantematerialet med læsioner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blades DB80 HS Leica 14035838383 Sectioning
Cacodylate buffer EMS # 11652 Fixation
Cotton Blue Lactophenol Metaquímica 70SOLSIG024629 Staining
Formaldehyde EMS #15712 Fixation
Glutaraldehyde EMS #16216 Fixation
Historesin Kit Technovit /EMS #14653 Historesin for embedding
Hot plate Dubesser SSCD25X30-110V Staining
Microscopy Zeiss #490040-0030-000 Image capture
Microtome (Leica RM 2540) Leica 149BIO000C1 14050238005 Sectioning
Plastic molding cup tray EMS 10176-30 Staining
Ruthenium red LABHouse #006004 Staining
Software Axion Vision Zeiss #410130-0909-000 Image capture
Vaccum pump Prismatec 131 TIPO 2 V.C. Fixation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5 (1863).
  2. Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).
  3. Underwood, W. The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion. Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).
  4. Hückelhoven, R. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility. Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).
  5. Voigt, C. A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).
  6. Chowdhury, J., et al. Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei. New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).
  7. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).
  8. Caffall, K. H., Mohnen, D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).
  9. Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. , Wiley Blackwell. New York. 45 (2015).
  10. Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases. Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).
  11. Lionetti, V. Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses. Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).
  12. Lionetti, V., et al. Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis. Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).
  13. Heath, M. C. Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection. Phytopathology. 61, 383-388 (1971).
  14. Silva, M. C., et al. Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).
  15. An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress. Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).
  16. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus. Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).
  17. Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits. Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).
  18. Avelino, J., et al. The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions. Food Security. 7, 303-321 (2015).
  19. Zambolim, L. Current status and management of coffee leaf rust in Brazil. Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).
  20. Swiderska-Burek, U., et al. Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555 (2020).
  21. Andrade, C. C. L., et al. Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves. Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).
  22. Zambolim, L. Coffee tree diseases. Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , Agronômica Ceres Santana (in Portuguese). São Paulo. 810 (2016).
  23. Castaño, A. J. J. Coffee rust. Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).
  24. Echandi, E. Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola. Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).
  25. Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf. Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).
  26. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  27. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , University of California. Berkeley, California. 347 (1950).
  28. Eskes, A. B. Resistance. Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, Boca Raton. 171 (1989).
  29. Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III). International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).
  30. Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves. Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).
  31. Hayat, M. A. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. , International Publishing. Berkeley Heights. 564 (1981).
  32. Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T. Large plant samples: how to process for GMA embedding. Light microscopy: methods and protocols. Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. 689, Humana Press. 37-49 (2011).
  33. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. New staining technique for fungal-infected plant tissues. Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).
  34. Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
  35. Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate. Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517 (2020).
  36. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. Piracicaba, F. E. A. L. Q. , Santana. in Portuguese 140 (2021).
  37. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).
  38. Chesters, C. G. C. Three methods of using cotton blue as a mycological stain. Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).
  39. Macedo, N. A. Manual of Techniques in Plant Histology. Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , in Portuguese 68 (1997).
  40. Lecker, A. Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health Journal. 12 (30), 24 (1999).
  41. Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. Lactic acid in wool dyeing. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103 (1895).
  42. Chamberlain, C. J. Methods in Plant Histology. , The University of Chicago Press. Chicago. 349 (1932).
  43. Sterling, C. Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain. American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).
  44. Luft, J. H. Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action. The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).
  45. Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A. Cell Wall. Plant Physiology. Kerbauy, G. B. , Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. in Portuguese 165-181 (2013).

Tags

Biologi udgave 180 Kaffe svampe haustorium histokemi pektin mikroskopi
Dobbeltfarvningsmetode til påvisning af pektin i interaktion mellem plante og svampe
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G.… More

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G. Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction. J. Vis. Exp. (180), e63432, doi:10.3791/63432 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter