Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שיטת צביעה כפולה לזיהוי פקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות

Published: February 4, 2022 doi: 10.3791/63432
Automatic Translation
1, 2
1Faculty of Animal Science and Food Engineering, Department of Basic Sciences, University of São Paulo, 2Laboratory of Nuclear Instrumentation, Center of Nuclear Energy in Agriculture, University of São Paulo

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה מיקרוסקופית לזיהוי פקטין באינטראקציה בין פטריית קפה.

Abstract

תאי הצמח משתמשים במנגנונים מבניים שונים, מכוננים או בלתי ניתנים להשראה, כדי להגן על עצמם מפני זיהום פטרייתי. אנקפסולציה היא מנגנון אינדוקטיבי יעיל לבודד את האוסטוריה הפטרייתית מהפרוטופלסט של תאי הצמח. לעומת זאת, פקטין, אחד המרכיבים הפולימריים של דופן התא, הוא מטרה של מספר אנזימים פקטוליטיים באינטראקציות נקרוטרופיות. כאן מוצג פרוטוקול לאיתור פקטין ופטריות באמצעות מיקרוסקופיה אופטית. נחקרים האנקפסולציה העשירה בפקטין בתאי עלי הקפה הנגועים בפטריית החלודה Hemileia vastatrix ובשינוי דופן תא המזופיל המושרה על ידי Cercospora coffeicola . דגימות העלים הנגעים תוקנו בתמיסת קרנובסקי, התייבשו והוטמעו בגליקון מתקרילט למשך 2-4 ימים. כל השלבים בוצעו על ידי שאיבת ואקום כדי להסיר אוויר בחללים הבין-תאיים ולשפר את תהליך ההטבעה. הבלוקים המשובצים חולקו למקטעים בעובי 5-7 מיקרומטר, שהופקדו על מגלשת זכוכית מכוסה במים ולאחר מכן חוממו בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, המגלשות הוכתמו פעמיים עם 5% כותנה כחולה בלקטופנול כדי לזהות את הפטרייה ו-0.05% רותניום אדום במים כדי לזהות פקטין (קבוצות חומציות של חומצות פוליאוריות של פקטין). האוסטוריה פטרייתית של Hemileia vastatrix נמצאה עטופה בפקטין. בקפה סרקוספוריוזיס, תאי מזופיל הפגינו התמוססות של דפנות התא, ונצפו הרפיות וקונידיופורים בין-תאיים. השיטה המוצגת כאן יעילה לזיהוי תגובה הקשורה לפקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות.

Introduction

מנגנוני ההגנה על דופן התא בצמחים חיוניים לריסון זיהום פטרייתי. מחקרים דיווחו על שינויים בעובי ובהרכב דופן התא מאז המאהה-19, 1,2. שינויים אלה יכולים להיות מושרים על ידי פתוגן פטרייתי המעורר את היווצרותה של פפילה, אשר מונעת מפטריות להיכנס לתא או יכול לשמש כדי לתמצת את hyphae כדי לבודד את התא המארח protoplast מן haustoria פטרייתי. ייצור מחסום דופן תא דינמי (כלומר, פפילה והאוסטוריום עטוף במלואו) חשוב כדי לקדם את עמידות הצמח3. מחקרים היסטופתולוגיים על מחלות הקשורות לפטריות חקרו את התרחשותם של מנגנונים אלה ותיארו את הפולימרים של דופן התא, תאית, המיצלולוז (ארבינוקסילנים) ויבלות כמנגנוני התנגדות להתקפה פטרייתית 4,5,6,7.

דופן התא היא המחסום הראשון מפני התקפה מיקרואורגניזמית, הפוגעת באינטראקציה בין צמחים לפטריות. פוליסכרידים פקטיים מרכיבים את דופן התא ומהווים כ-30% מהרכב דופן התא בתאים ראשוניים של צמחי אאודיקוט שבהם הומוגלקטורונאנים הם הפולימר הנפוץ ביותר (בערך 60%)8. הגולגי מפריש תרכובות פקטין מורכבות המרכיבות את שרשראות החומצה הגלקטורונית, אשר עשויות או לא יכולות להיות מתילציה 8,9. מאז 2012, הספרות הצביעה על כך שמידת הפקטין מתיל אסטריפיקציה היא קריטית לקביעת התאימות במהלך ההדבקה על ידי אנזימים פקטיים מיקרוביאליים 10,11,12. לפיכך, פרוטוקולים נדרשים כדי לאמת את נוכחותם והפצתם של תרכובות פקטיות במערכות פאתוסיסטמיות פטרייתיות צמחיות.

טכניקות שונות שימשו כדי לזהות את האנקפסולציה של papillae או haustoria. שיטות הייחוס בהן נעשה שימוש הן מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) של רקמות קבועות ומיקרוסקופיה קלה של רקמות חיות וקבועות. בנוגע ל-TEM, מספר מחקרים הדגימו את התפקיד המבני של ניצני דופן התא בהתנגדות פטרייתית 13,14,15,16, וכי השימוש בלקטינים ונוגדנים הוא שיטה מורכבת לאיתור פולימרים של פחמימות 16. עם זאת, מחקרים מראים כי מיקרוסקופיית אור היא גישה חשובה וכי הכלים ההיסטוכימיים והאימונוהיסטוכימיים מאפשרים הבנה טובה יותר של הרכב מעטפת הפפילה וההאוזטוריום 6,7.

פטריות פתוגניות מראות שני סוגים עיקריים של אורחות חיים: ביוטרופיים ונקרוטרופיים. פטריות ביוטרופיות תלויות בתאים חיים לצורך תזונתן ואילו פטריות נקרוטרופיות הורגות את התאים המארחים, ואז חיות ברקמות המתות17. באמריקה הלטינית, חלודה של עלי קפה, הנגרמת על ידי הפטרייה Hemileia vastatrix, היא מחלה חשובה בגידולי קפה18,19. Hemileia vastatrix מציגה התנהגות ביוטרופית, ובין השינויים המבניים שנצפו במיני קפה עמידים או בתרבויות, דווח על תגובת רגישות יתר, תצהיר של קאלוז, תאית וליגנין על דפנות התא, כמו גם היפרטרופיה של תאים14. למיטב ידיעת המחברים, הספרות אינה מדווחת על מידע על חשיבותו של פקטין בעמידות לחלודה בקפה. מצד שני, פטריות נקרוטרופיות הגורמות לצרקוספוריוזיס מכוונות לפקטין באמצעות קבוצה של אנזימים הקשורים לפירוק דופן התא, כגון פקטינזות ופוליגלקטורונאז20. סרקוספוריוזיס בקפה, הנגרמת על ידי הפטרייה Cercospora coffeicola הוא גם איום גדול על גידולי קפה21,22. פטרייה זו גורמת לנגעים נמקיים הן בעלים והן בפירות יער. לאחר החדירה, C. coffeicola מיישב רקמות צמחים דרך מסלולים תוך תאיים ובין תאיים 23,24,25.

הפרוטוקול הנוכחי חוקר את הימצאותם של מבנים פטרייתיים ופקטין על דפנות התא. פרוטוקול זה שימושי כדי לזהות את התגובה הצמחית הקשורה לפקטין (מוכתם בצבע אדום רותניום, שהוא ספציפי לקבוצות חומציות של חומצות פוליאוריוניות של פקטין), המושרה על ידי המארח באינטראקציה ביוטרופית עם פטרייה. זה גם עוזר לאמת את ההשפעה של פטריות necrotrophic על התדרדרות של דפנות התאים pectic. התוצאות הנוכחיות מצביעות על כך ששיטת ההכתמה הכפולה יעילה להבחנה בין מבנים ולשלב הרבייה של פטריות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תמיסת האגירה והריאגנטים

  1. הכן 2 M cacodylate buffer על ידי הוספת 4.28 גרם של נתרן cacodylate ל 100 מ"ל של מים מזוקקים ולהתאים את ה- pH ל 7.25 עם 0.2 N HCl.
  2. הכן 100 מ"ל של תמיסת התיקון של קרנובסקי על ידי ערבוב של 10 מ"ל של 25% גלוטארלדהיד מימי, 10 מ"ל של 10% פורמלדהיד מימי, 25 מ"ל של 2 M cacodylate buffer, ו 0.5 מ"ל של 0.5 M CaCl226. להמציא את הנפח ל 100 מ"ל עם מים מזוקקים.
    הערה: ניתן לשמור את הפתרון במקרר למשך 6 חודשים.
    אזהרה: תמיסת האגירה של קקודילאט רעילה; לכן, טפל בתמיסה המקבעת במכסה אדים או בשטח פתוח. הימנעו משאיפת אדי התמיסה וללבוש כפפות בזמן הטיפול.
  3. הכן תמיסת הזנה מימית של Hoagland על ידי ערבוב הדברים הבאים: 3 mM Ca(NO3)2.4H 2O, 2 mM NH4H2PO4, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H 2O, 9.07 mM MNSO4, 0.765 mM ZnSO4.7H 2O, 46.4 mM H3BO3, 0.09 mM Na2MoO4. H2O, 0.01 mM CuSO4, ו-36 mM FeSO4.7H 2O כ-iron-EDTA (חומצה טטראצטית אתילנדיאמין)27.

2. דגימות צמחים וחיסון פטריות

הערה: לניסויים בעלים המושפעים מחלודה של קפה, חמישה שתילים בני חודשיים של קפה ערביקה cv. Catuaí גודלו ונשמרו בחממה במרכז לאנרגיה גרעינית בחקלאות (CENA) של אוניברסיטת סאו פאולו, פירצ'יקאבה, מדינת סאו פאולו, ברזיל.

  1. לגדל צמחי קפה בעציצים מפלסטיק של 500 מ"ל מלאים בתמיסת מזון מימית של Hoagland (pH של כ-5.5) למשך 4 חודשים בתא גדילה שנשמר בטמפרטורה של 27 ± 3 מעלות צלזיוס עם פוטופריוד של 12 שעות שנוצר על ידי מנורות LED בשטף הפוטונים של 250 מיקרומול פוטונים s-1 m-2. החלף את תמיסת החומרים המזינים Hoagland מדי שבוע במשך 4 חודשים.
  2. חסן ארבעה עלים מורחבים מחמישה צמחים על המשטחים האבקסיאליים שלהם עם 1 x 103 H. vastatrix uredospores בעקבות השיטה המתוארת בהתייחסות28. לאחר החיסון, יש לשמור את הצמחים במשך 48 שעות בחושך על ידי כיסוים בשקית ניילון שחורה. לקצור את הנגעים 30 יום לאחר החיסון.
  3. קציר נגעים אופייניים הנגרמים על ידי Cercospora coffeicola מ Coffea ערביקה cv. צמחי Obatã הממוקמים (קואורדינטות: -22.906506126269942, -47.015075902025266) במכון הביולוגי, קמפינאס, מדינת סאו פאולו, ברזיל. לפני עיבוד הדגימה, לנתח את הנגעים בסטריאומיקרוסקופ כדי לאמת את נוכחותו של קפה C. coffeicola conidia. לאחר מכן, הר כמה שקופיות עם conidia כדי לאשר את המחלה etiology22.

3. קציר דגימות, קיבוע והתייבשות

  1. באמצעות אזמל ופינצטה, לקטוף דגימת עלים של כ-10 מ"מ2 באזור האמצעי של הנגע (כתמים צהובים; איור 1) ולטבול אותו ב-30 מ"ל של תמיסה מקבעת קרנובסקי (איור 1 ואיור 2A). שלב הקיבוע יכול להתרחש במקרר במשך 48 שעות.
  2. במשך ארבע פעמים לפחות, העבירו את דגימת העלה לוואקום נמוך (500-600 mBar) באמצעות משאבת שמן למשך 15 דקות כל אחת כדי להגביר את החדירות של התמיסה המקבעת ברקמת העלה. בצע שלב זה באמצעות סיבוב מדגם (איור 1).
  3. לאחר הקיבוע, שטפו את דגימת העלים שלוש פעמים ב-0.5 M של חיץ קקודילט (pH 7.2) מדולל במים מזוקקים במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן העבירו אותה לסדרה אתנולית מדורגת (30%, 50%, 70%, 90%, 90% (2x) ו-100% (2x)) למשך 15 דקות בכל ריכוז אתנול (איור 1 ואיור 2B).

4. הליך הטמעת היסטוריסין

  1. העבר בהדרגה את הדגימות לגליקול מתקרילט (GMA) בשלושה שלבים, בהתאם להוראות היצרן. ראשית, הפוך את פתרון A על ידי ערבוב אבקת GMA (1 גרם) עם 100 מ"ל של שרף בסיסי (ערכת historesin; טבלת חומרים) תחת תסיסה מגנטית, ולאחר מכן בצע את השלבים הבאים.
    1. לטבול את הדגימות 1:2 פתרון A: 100% אתנול במשך 3 שעות.
    2. טבלו את הדגימות בפתרון 1:1 A: 100% אתנול למשך 3 שעות.
    3. לטבול את הדגימות בשרף בסיסי טהור למשך 2-4 ימים. במהלך שלב זה, העמידו את הדגימות בפני ואקום נמוך לפחות ארבע פעמים ביום למשך 15 דקות ולאחר מכן סיבוב.

5. פילמור

הערה: תהליך הפילמור דורש תבניות פלסטיק של 1.2 מ"ל, שרף בסיסי והקשחה (ראו טבלת חומרים לפרטי הערכה המסחרית).

  1. ערבבו 15 מ"ל של פתרון A (שלב 4.1) עם 1 מ"ל של הקשחה בכוס עם סיבוב למשך 2 דקות כדי לייצר את פתרון הפילמור (פתרון B).
  2. שים 1.2 מ"ל של תמיסת הפילמור (פתרון B) בתבניות פלסטיק. באמצעות פיק עץ, העבירו את דגימות העלים הנגעים משרף בסיסי טהור לתמיסה B (איור 2C). הימנע משימוש בפינצטה מכיוון שהם עלולים לגרום לריסוק רקמות.
  3. הקפידו לכוון במהירות דגימות עלים בניצב לתבניות הפלסטיק, שכן פתרון B הופך במהירות לצמיג תוך 5 דקות. ניתן למקם יותר מדגימת עלה נגע אחת בתבנית אחת.
    הערה: מומלץ לתרגל את השלב הנ"ל מספר פעמים לפני הגשת בקשה לדוגמאות רבות. כאשר יש דגימות רבות, זמן הפילמור שונה בין התבניות והכיוון הניצב של דגימות העלים עשוי להיות קשה להשגה.
  4. כאשר הכיוון הניצב של דגימות העלים מושג, המתן 30 דקות, ולאחר מכן העבר את תבנית הפלסטיק לתא פלסטיק או זכוכית המכיל ג'ל סיליקה כדי למנוע לחות. המתן 2-3 שעות לפילול.
  5. לאחר שהשרף ודגימת העלים עוברים פולימר לאחר התקופה של 2-3 שעות, נתקו את הגוש שנוצר מתבנית הפלסטיק על ידי שיוף בסיס הבלוק עם קובץ שיוף. לאחר מכן, הדביקו את הבלוק לחתיכת עץ (איור 2D).

6. חתך

  1. באמצעות מיקרוטום סיבובי המצויד בלהבי פלדה בקוטר 8 ס"מ (איור 2E), חתכו את הבלוק למקטעים בעובי 5 מיקרומטר. הניחו את החלקים על מגלשות זכוכית מכוסות במים מזוקקים. העבר את המגלשות עם החלקים הצפים מעל המים לצלחת חמה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס כדי לייבש ולקדם את ההדבקה של החלקים למגלשות הזכוכית.
  2. לאחר הייבוש (איור 2F), סמן את שקופיות הזכוכית בשם ההפניה לבלוק ובמספר השקופית.

7. תהליך צביעה כפול

  1. כסו את החלקים עם 2 מ"ל של 5% כותנה כחולה בלקטופנול (40% גליצרול, 20% פנול ו-20% חומצה לקטית במים) וחממו אותם על צלחת חמה ב-45 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (איור 3A).
  2. הסירו את הצבע העודף על ידי שטיפת המגלשה שלוש פעמים בכוס מלאה במים מזוקקים (איור 3B-D).
  3. כתם עם 2 מ"ל של 0.01% רותניום אדום במים למשך דקה אחת (איור 3E).
  4. הסירו את הצבע העודף על ידי שטיפת המגלשה שלוש פעמים בכוס מלאה במים מזוקקים (איור 3F,G).
  5. שים טיפה של מים מזוקקים על החלקים וכסה את החלקים עם כיסוי 24 מ"מ x 60 מ"מ לביצוע ניתוח מיקרוסקופיה קלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

צביעת הלקטופנול הכחולה מכותנה על החלק המשובץ ב-GMA חשפה את נוכחותם של מספר מבנים פטרייתיים בין תאי מזופיל קפה ובתוךיהם באינטראקציות פטרייתיות ביוטרופיות ונקרוטרופיות.

במערכת הפתוסית הביוטרופית, כאשר היא מוכתמת בשיטת ההכתמה הכפולה, Hemileia vastatrix hyphae המכילה את דפנות התא ואת תכולת הפרוטופלסט הצפופה מופיעה בכחול כהה הן בפרנכימה ספוגית והן בפרנכימה פליסיידית (איור 4A,B). גם תא האם של האוסטוריום (Hmc) וההאוזטוריה מפגינים צבע כחול כהה חזק (איור 4C). כאשר היא מוכתמת באדום רותניום, ההתפלגות הפטרייתית במרחבים הבין-תאיים מוגדרת בבירור (איור 4D). נוכחות של Hmc כחול כהה מסייע לזהות את אזור ההדבקה. במהלך האינטראקציה, H. vastatrix Hmc שבר את דופן התא המארח ופיתח צוואר האוסטוריאלי שיכול להיות מוקף בתרכובות פקטיות (איור 4E,F). אף על פי כן, האנקפסולציה העשירה בפקטין (צבע ורוד-אדום) של הצוואר האוסטוריאלי אינה מסוגלת למנוע היווצרות האוסטוריאלית (איור 4E,F). במקרים מסוימים, האנקפסולציה העשירה בפקטין עטפה את האוסטוריום באופן חלקי (איור 4G) ובמקרים מסוימים, ההאוסטוריום עטוף במלואו (איור 4H).

באינטראקציה הנקרוטרופית, פרוטוקול ההכתמה הכפולה היה שימושי גם כדי לאמת את האינטראקציה של Cercospora coffeicola עם רקמות מזופיל קפה. בגבול הנגע, שבו הפטרייה אינה נוכחת, דופן התא העשירה בפקטין שמרה על שלמותה (איור 5A). שיטת ההכתמה הכפולה הדגימה את נוכחותם של צבועים בין-תאיים (איור 5B,C). באזורי אינטראקציה, נראה שדפנות תאי פקטין איבדו את שלמותן עקב פירוק (איור 5B,C). מבני רבייה, כגון conidiophore, נמצאו באפידרמיס הא-אקסיאלי (איור 5D). בחדר התת-סטומי נמצאו C. coffeicola hyphae כמבנים מסתלסלים. נראה כי הפרנצ'ימה הפליסיידית באזור הנגע עוברת ליזה של דופן התא (איור 5E).

Figure 1
איור 1: פרטים על השלבים הבודדים בפרוטוקול לקצירת רקמות נגעים. קוצרים את חתיכת הנגע עם אזמל ופינצטה. טבלו את דוגמאות העלים לתוך התמיסה המקבעת. הכפיפו את הדגימות לשאיבת ואקום וסיבוב. עקוב אחר הפרוטוקול עבור תהליכי התייבשות והטמעה. הדגימה הפולימרית נחתכת במיקרוטום רקוב. השקופיות עם קטעי הנגעים מורכבות ומוכתמות כדי לאמת את דפנות התאים הפטרייתיים והעשירים בפקטין בשיטת ההכתמה הכפולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: פרטים על השלבים הבודדים של מקטע המדגם לפני הכתם הכפול. (א) שלב הקיבוע. (B) התייבשות בסדרת אתנול מדורגת; רקמת העלה מודגרת באתנול במשך 15 דקות בכל ריכוז. (C) פילמור בתוך תבנית הפלסטיק. (D) גוש דגימה פולימרית המודבקת לחתיכת עץ. (E) בלוק מודבק עץ הממוקם על המיקרוטום לצורך תהליך החתך. (F) קטעי רקמה בשקופית (מסומנים בחצים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: פרטים על השלבים הבודדים של פרוטוקול ההכתמה הכפולה. (A) כסו את החלקים בטיפות של לקטופנול כחול כותנה וחממו את המגלשות על צלחת חמה בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס( B-C) הסירו את הצבע העודף על ידי שטיפה במים מזוקקים. (ד) קטעים על שקופיות הזכוכית לאחר הכביסה (מסומנים בחצים). (ה) לכסות את החלקים בטיפות של אדום רותניום. (פ-ג) מסירים את עודפי הצבע על ידי שטיפה במים מזוקקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: פרוטוקול צביעה כפולה היסטוכימית למבנים פקטין ופטרייתיים בנגע חלודה של קפה. (א-ג) קטעים מוכתמים רק בלקטופנול כחול כותנה. הפטריות מוכתמות בכחול כהה (חצים). לתא האם של האוסטוריום (Hmc) ולהאוסטוריום (Ha) יש צבע כחול כהה. (ד-ח) כתמים כפולים באמצעות לקטופנול כחול כותנה ואדום רותניום. (D) סקירה כללית של pustule (Pu) על עלה. (ה-ו-ו) צוואר האוסטוריאלי (חצים) עם פקטין (צבע ורוד-אדום). (G) חצים מציינים את תחילתו של אנקפסולציה עשירה בפקטין של האוסטוריום. (H) אנקפסולציה מלאה של האוסטוריום על ידי פקטין (חצים). אפי אבה - אפידרמיס אבקסיאל; אפי עדה - אפידרמיס א-אקסיאלי; Sp - פרנצ'ימה ספוגית; Pp - palisade parenchyma. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: פרוטוקול צביעה כפולה היסטוכימית למבנים פקטין ופטרייתיים בנגעי סרקוספוריוזיס ברקמות מזופיל קפה. (A) גבול נגע ללא פטריות. (ב-ו) חתכים רוחב של העלה הנגע. (A) שלמות דפנות התאים העשירים בפקטין של הפרנצ'ימה הספוגית. (ב-ד,ו) ברקמות הנגועות, ה-Cercospora coffeicola hyphae ניכרו (חיצים) וגרמו לנזק בדפנות התאים הפקטיים. ניתן היה לאמת את הקונידיופור תחת הציפורן (CT) (D). אפי אבה - אפידרמיס אבקסיאל; אפי עדה - אפידרמיס א-אקסיאלי; Sp - פרנצ'ימה ספוגית; עמ ' - פליסייד פרנצ'ימה; רחוב - סטומטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

העבודה הנוכחית מציגה בדיקה היסטוכימית חלופית עם כתמים כפולים כדי לחקור את הרכב הפקטין של דפנות התאים, המתמצת את האוסטוריה במערכת פאתוסיסטית ביוטרופית. המטרה היא גם להדגים את היעילות של השיטה לאיתור פטרייה נקרוטרופית ושינויים בדופן התא המושרים על ידה. כאן, פקטין של דפנות תא פרנכימה קפה יכול לתמצת הן את הצוואר והן את האוסטוריום של פטריית החלודה Hemileia vastatrix. סילבה ואחרים תיארו גם את האנקפסולציה על ידי תאית וקלוז במערכת הקפה-H. vastatrix pathosystem 14,29. בין פולימרי דופן התא הקשורים למנגנוני הגנה, פקטין ממלא תפקיד חשוב במערכת הצמח-פתוגנים 10,11,12. לכן, הידע של פונקציות פקטין הוא בעל ערך היסטופתולוגי רב.

סרקוספוריוזיס בקפה, הנגרמת על ידי Cercospora coffeicola, פוגעת ברקמות העלים ובסופו של דבר מובילה למוות תאי. תסמינים אלה נגרמים בעיקר על ידי פעילות של cercosporin ו דופן התא מפרקים אנזימים20. מחקרים שהשתמשו באדום רותניום הדגימו אובדן שלמות דופן התא, בדומה למחקר קודם על עלי אפרסמון שנדבקו ב-Pseudocercospora kaki30. הניתוח ההיסטופתולוגי בשיטת ההכתמה הכפולה הדגים את נוכחותו של ההיפאה הפטרייתית וניתוח זה יעיל לזיהוי היפא פטרייתי במרחבים הבין-תאיים. לחלופין, סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) הראתה יעילות לתצפית על C. coffeicola hyphae25; עם זאת, הזמינות של ציוד מתוחכם כזה, יחד עם העבודה המייגעת של הכנת מדגם, היא גורם מגביל. יתר על כן, ניתוח SEM אינו מאפשר זיהוי כימי של פקטין בדפנות התא. לעומת זאת, צביעה כפולה היא שיטה חשובה לזיהוי שינויים בפקטין. עם זאת, לשיטה המתוארת כאן יש מגבלה ביחס לרזולוציה של מיקרוסקופיית אור שאינה מאפשרת עלייה בפרטים של מבנה האולטרה-מבנה של אינטראקציה בין צמחים לפטריות. כמו כן, שיטת ההכתמה הכפולה המוצגת כאן אינה ספציפית לזיהוי מינים פטרייתיים ולכן יש לבצע מאמרים מולקולריים נוספים.

הכנת הדגימה עוקבת אחר פרוטוקולים שגרתיים באנטומיה של הצמח; עם זאת, כמה נקודות זקוקות לתשומת לב מיוחדת. לדוגמה, קיבוע הוא שלב קריטי. גודל הדגימות והטיפול בקצירתן חיוניים לקיבוע טוב. הזמן, הטמפרטורה, ה-pH והאוסמולאריות חיוניים לרקמות הצמח31. רקמות העלים הנגעים הן איברי אוויר ויש לתת להן ואקום קל כדי לשפר את הקיבוע. השימוש בגליקול מתקרילט (GMA) דורש אתנול כממס התייבשות; רקמות שאינן מיובשות כראוי יכולות להוות קשיים במהלך תהליך ההטבעה. מצב זה מחמיר כאשר לרקמות הצמח יש תרכובות פנוליות רבות, כמו במקרה של עלי קפה. יתר על כן, התמודדות עם חלקים קטנים של רקמות היא חשובה; אחרת, נדרשות שיטות הטמעה חלופיות32.

טכניקת ההכתמה הכפולה המוצגת כאן היא התאמה של הפרוטוקול שדווח על ידי Marques et al.33. בפרוטוקול זה, החוקרים השתמשו בכחול כותנה (5%) ובספרנין של 1% כדי להבחין בין מבנים פטרייתיים לדפנות תאי צמחים. הטכניקה הייתה שימושית כדי לזהות נוכחות של פטריות במערכות פאתוסיסטמים שונות, כגון עלי כותרת של Colletotrichum acutatum-citrus ו- Guignardia citricarpa-citrus fruit33Plasmodiophora brassicae ב- Arabidopsis thaliana34, Elsinoë ampelina ב- Vitis labrusca35, ואחרים. לאחרונה, Marques and Soares36ריכזו סדרה של טכניקות מיקרוסקופיות, כולל שיטות האור והפלואורסצנציה, כדי להבחין בין הצמח לבין תכונות פטרייתיות37. עם זאת, באזורים או במדינות מסוימות, כגון ברזיל, מיקרוסקופים פלואורסצנטיים ו- SEM עשויים שלא להיות זמינים; לפיכך, השימוש במיקרוסקופי אור הוא חלופה חשובה וזולה יותר למחקר ואף לשיטות דידקטיות הנהוגות באוניברסיטאות ובבתי ספר תיכוניים. קליפות פטרייתיות זוהו באופן מיקרוסקופי הן ברקמות צמחים והן ברקמות בעלי חיים על ידי צבע כחול כותנה 36,38,39,40. זה קשור לתגובה החיובית של הצבע עם דופן פטרייתית עשירה בצ'יטין40. נוסחת כחול הכותנה כוללת לקטופנול, שהיא תמיסה הפועלת כמורדנטית לרקמה41, ובכך משמרת את המבנה הפטרייתי כאשר היא מעורבבת עם כותנה כחולה. 

כאן, 0.05% רותניום אדום שימש להחלפת ספרנין. ההיבט החיובי שהוצג במחקר זה הוא שפקטין, פולימר מסוים של דופן התא, הוכתם כדי לספק נתונים איכותיים חשובים. רותניום אדום הוא מגיב המשמש לאיתור קבוצות חומציות של חומצות פוליאורוניות פקטין 42,43,44. הוא ספציפי לפקטין ואינו מכתים רכיבי פחמימות אחרים בדופן התא (כלומר, תאית או יבלה). שרשראות של חומצות גלקטוזרוניות המסודרות בעמודי שדרה מבניים וביוכימיים שונים מרכיבות פקטין 8,9,45. התגובתיות של רותניום אדום לדופן התא תלויה במידת המתיל אסטריפיקציה11. מידת אסטריפיקציה של מתיל תלויה בפעילות של פקטין מתיל אסטרזות (PME), ולכן האדום רותניום שימש גם ככלי להבחנה בפעילות PME11.

לפיכך, שיטת ההכתמה הכפולה המתוארת כאן היא כלי שימושי לאימות שינויים בפקטין באינטראקציות בין צמחים לפטריות. למיטב ידיעתם של המחברים, זהו הדיווח הראשון על פקטין באנקפסולציה האוסטוריאלית של פטריות חלודה של קפה. באופן מעניין, שיטת ההכתמה הכפולה הייתה חשובה גם כדי לבחון מבנים פטרייתיים, לתאר את הנזק שנגרם לדופן התא העשירה בפקטין, ולאימות מבני הרבייה הפטרייתיים. מחקרים היסטופתולוגיים נוספים על חלודה, אנתרקנוז, סרקוספוריוזיס, סמוטציות ואינטראקציות ביוטרופיות, המיביוטרופיות ונקרוטרופיות אחרות בין צמחים לפטריות צריכים להתבצע כדי לחקור את השימוש הפוטנציאלי בטכניקה זו במערכות פאתוסיסטיות שונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לד"ר הדסון ו. פ. דה קרבאליו על התמיכה בפיתוח עבודה זו. המחברים מודים גם למעבדה למיקרוסקופיית אלקטרונים ''פרופ' אליוט וואטאנאבה קיטג'ימה'' על אספקת המתקן למיקרוסקופיית אור. המחברים מודים לד"ר פלביה רודריגז אלבס פטריסיו על אספקת החומר הצמחי עם נגעים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blades DB80 HS Leica 14035838383 Sectioning
Cacodylate buffer EMS # 11652 Fixation
Cotton Blue Lactophenol Metaquímica 70SOLSIG024629 Staining
Formaldehyde EMS #15712 Fixation
Glutaraldehyde EMS #16216 Fixation
Historesin Kit Technovit /EMS #14653 Historesin for embedding
Hot plate Dubesser SSCD25X30-110V Staining
Microscopy Zeiss #490040-0030-000 Image capture
Microtome (Leica RM 2540) Leica 149BIO000C1 14050238005 Sectioning
Plastic molding cup tray EMS 10176-30 Staining
Ruthenium red LABHouse #006004 Staining
Software Axion Vision Zeiss #410130-0909-000 Image capture
Vaccum pump Prismatec 131 TIPO 2 V.C. Fixation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5 (1863).
  2. Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).
  3. Underwood, W. The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion. Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).
  4. Hückelhoven, R. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility. Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).
  5. Voigt, C. A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).
  6. Chowdhury, J., et al. Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei. New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).
  7. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).
  8. Caffall, K. H., Mohnen, D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).
  9. Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. , Wiley Blackwell. New York. 45 (2015).
  10. Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases. Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).
  11. Lionetti, V. Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses. Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).
  12. Lionetti, V., et al. Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis. Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).
  13. Heath, M. C. Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection. Phytopathology. 61, 383-388 (1971).
  14. Silva, M. C., et al. Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).
  15. An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress. Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).
  16. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus. Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).
  17. Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits. Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).
  18. Avelino, J., et al. The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions. Food Security. 7, 303-321 (2015).
  19. Zambolim, L. Current status and management of coffee leaf rust in Brazil. Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).
  20. Swiderska-Burek, U., et al. Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555 (2020).
  21. Andrade, C. C. L., et al. Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves. Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).
  22. Zambolim, L. Coffee tree diseases. Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , Agronômica Ceres Santana (in Portuguese). São Paulo. 810 (2016).
  23. Castaño, A. J. J. Coffee rust. Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).
  24. Echandi, E. Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola. Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).
  25. Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf. Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).
  26. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  27. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , University of California. Berkeley, California. 347 (1950).
  28. Eskes, A. B. Resistance. Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, Boca Raton. 171 (1989).
  29. Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III). International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).
  30. Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves. Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).
  31. Hayat, M. A. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. , International Publishing. Berkeley Heights. 564 (1981).
  32. Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T. Large plant samples: how to process for GMA embedding. Light microscopy: methods and protocols. Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. 689, Humana Press. 37-49 (2011).
  33. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. New staining technique for fungal-infected plant tissues. Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).
  34. Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
  35. Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate. Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517 (2020).
  36. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. Piracicaba, F. E. A. L. Q. , Santana. in Portuguese 140 (2021).
  37. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).
  38. Chesters, C. G. C. Three methods of using cotton blue as a mycological stain. Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).
  39. Macedo, N. A. Manual of Techniques in Plant Histology. Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , in Portuguese 68 (1997).
  40. Lecker, A. Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health Journal. 12 (30), 24 (1999).
  41. Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. Lactic acid in wool dyeing. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103 (1895).
  42. Chamberlain, C. J. Methods in Plant Histology. , The University of Chicago Press. Chicago. 349 (1932).
  43. Sterling, C. Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain. American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).
  44. Luft, J. H. Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action. The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).
  45. Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A. Cell Wall. Plant Physiology. Kerbauy, G. B. , Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. in Portuguese 165-181 (2013).

Tags

ביולוגיה גיליון 180 קפה פטריות האוסטוריום היסטוכימיה פקטין מיקרוסקופיה
שיטת צביעה כפולה לזיהוי פקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G.… More

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G. Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction. J. Vis. Exp. (180), e63432, doi:10.3791/63432 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter