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Biology

Metodo a doppia colorazione per rilevare la pectina nell'interazione pianta-fungo

Published: February 4, 2022 doi: 10.3791/63432
Automatic Translation
1, 2
1Faculty of Animal Science and Food Engineering, Department of Basic Sciences, University of São Paulo, 2Laboratory of Nuclear Instrumentation, Center of Nuclear Energy in Agriculture, University of São Paulo

Summary

Questo protocollo descrive un metodo microscopico per rilevare la pectina nell'interazione caffè-fungo.

Abstract

Le cellule vegetali utilizzano diversi meccanismi strutturali, sia costitutivi che inducibili, per difendersi dalle infezioni fungine. L'incapsulamento è un meccanismo inducibile efficiente per isolare la haustoria fungina dal protoplasto cellulare vegetale. Al contrario, la pectina, uno dei componenti polimerici della parete cellulare, è un bersaglio di diversi enzimi pectolitici nelle interazioni necrotrofiche. Qui viene presentato un protocollo per rilevare la pectina e le ife fungine attraverso la microscopia ottica. Vengono studiati l'incapsulamento ricco di pectina nelle cellule delle foglie di caffè infettate dal fungo ruggine Hemileia vastatrix e la modificazione della parete cellulare mesofilla indotta da Cercospora coffeicola . I campioni di foglie lesionate sono stati fissati con la soluzione di Karnovsky, disidratati e incorporati nel glicole metacrilato per 2-4 giorni. Tutte le fasi sono state seguite dal pompaggio del vuoto per rimuovere l'aria negli spazi intercellulari e migliorare il processo di incorporamento. I blocchi incorporati sono stati sezionati in sezioni spesse 5-7 μm, che sono state depositate su un vetrino coperto d'acqua e successivamente riscaldate a 40 °C per 30 min. Successivamente, i vetrini sono stati doppiamente colorati con il 5% di blu di cotone in lattofenolo per rilevare il fungo e lo 0,05% di rosso rutenio in acqua per rilevare la pectina (gruppi acidi di acidi poliuronici della pectina). Le haustoria fungine di Hemileia vastatrix sono risultate incapsulate dalla pectina. Nella cercosporiosi del caffè, le cellule mesofille hanno mostrato la dissoluzione delle pareti cellulari e sono state osservate ife e conidiofori intercellulari. Il metodo qui presentato è efficace per rilevare una risposta associata alla pectina nell'interazione pianta-funghi.

Introduction

I meccanismi di difesa della parete cellulare nelle piante sono cruciali per frenare l'infezione fungina. Gli studi hanno riportato cambiamenti nello spessore e nella composizione della parete cellulare dal 19° secolo 1,2. Questi cambiamenti possono essere indotti da un agente patogeno fungino che stimola la formazione di una papilla, che impedisce ai funghi di entrare nella cellula o potrebbe essere utilizzato per incapsulare le ife per isolare il protoplasto della cellula ospite dalla haustoria fungina. La produzione di una barriera dinamica della parete cellulare (cioè papille e un haustorio completamente incassato) è importante per promuovere la resistenza delle piante3. Studi istopatologici sulle malattie fungine hanno indagato l'insorgenza di questi meccanismi e hanno descritto i polimeri della parete cellulare, la cellulosa, l'emicellulosa (arabinoxilani) e la callosio come meccanismi di resistenza all'attacco fungino 4,5,6,7.

La parete cellulare è la prima barriera contro l'attacco di microrganismi, compromettendo l'interazione pianta-fungo. I polisaccaridi pectici compongono la parete cellulare e rappresentano circa il 30% della composizione della parete cellulare nelle cellule primarie delle piante di eudico in cui gli omogalacturonani sono il polimero più abbondante (circa il 60%)8. Il Golgi secerne composti complessi di pectina che compongono le catene di acido galatturonico, che possono o meno essere metilate 8,9. Dal 2012, la letteratura ha sottolineato che il grado di esterificazione della pectina metile è fondamentale per determinare la compatibilità durante l'infezione da enzimi pectici microbici 10,11,12. Pertanto, sono necessari protocolli per verificare la presenza e la distribuzione di composti pectici nei patosistemi pianta-fungina.

Varie tecniche sono state utilizzate per rilevare l'incapsulamento di papille o haustoria. I metodi di riferimento utilizzati sono la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di tessuti fissi e la microscopia ottica di tessuti viventi e fissi. Per quanto riguarda il TEM, diversi studi hanno dimostrato il ruolo strutturale delle apposizioni della parete cellulare nella resistenza fungina 13,14,15,16 e che l'uso di lectine e anticorpi è un metodo complesso per localizzare i polimeri di carboidrati16. Tuttavia, gli studi dimostrano che la microscopia ottica è un approccio importante e che gli strumenti istochimici e immunoistochimici consentono una migliore comprensione della composizione delle papille e dell'involucro dell'haustorium 6,7.

I funghi patogeni mostrano due tipi principali di stili di vita: biotrofico e necrotrofico. I funghi biotrofici dipendono dalle cellule viventi per la loro nutrizione, mentre i funghi necrotrofici uccidono le cellule ospiti e quindi vivono nei tessuti morti17. In America Latina, la ruggine delle foglie di caffè, causata dal fungo Hemileia vastatrix, è una malattia importante nelle colture di caffè18,19. Hemileia vastatrix presenta un comportamento biotrofico e, tra i cambiamenti strutturali osservati in specie o cultivar di caffè resistenti, sono stati riportati una risposta di ipersensibilità, deposizione di callosio, cellulosa e lignina sulle pareti cellulari, nonché ipertrofia cellulare14. Per quanto a conoscenza degli autori, la letteratura non riporta informazioni sull'importanza della pectina nella resistenza alla ruggine del caffè. D'altra parte, i funghi necrotrofici che causano la cercosporiosi prendono di mira la pectina attraverso una serie di enzimi associati alla degradazione della parete cellulare, come le pectinasi e la poligalatturonasi20. La cercosporiosi nel caffè, causata dal fungo Cercospora coffeicola è anche una grave minaccia per le colture di caffè21,22. Questo fungo provoca lesioni necrotiche sia nelle foglie che nelle bacche. Dopo la penetrazione, C. coffeicola colonizza i tessuti vegetali attraverso percorsi intracellulari e intercellulari 23,24,25.

Il presente protocollo indaga la presenza di strutture fungine e pectina sulle pareti cellulari. Questo protocollo è utile per identificare la risposta vegetale associata alla pectina (colorata con colorante rosso rutenio, che è specifico per i gruppi acidi degli acidi poliuronici della pectina), indotta dall'ospite in un'interazione biotrofica con il fungo. Aiuta anche a verificare l'effetto dei funghi necrotrofici sulla degradazione delle pareti cellulari pectiche. I risultati attuali indicano che il metodo della doppia colorazione è efficace per discriminare le strutture e la fase riproduttiva dei funghi.

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Protocol

1. Preparazione della soluzione tampone e dei reagenti

  1. Preparare il tampone di cacodilato da 2 M aggiungendo 4,28 g di cacodilato di sodio a 100 ml di acqua distillata e regolare il pH a 7,25 con 0,2 N HCl.
  2. Preparare 100 mL della soluzione fissativa Karnovsky mescolando 10 mL di glutaraldeide acquosa al 25%, 10 mL di formaldeide acquosa al 10%, 25 mL di tampone cacodilato 2 M e 0,5 mL di CaCl2 26. Portare il volume a 100 ml con acqua distillata.
    NOTA: La soluzione può essere conservata in frigorifero per 6 mesi.
    ATTENZIONE: La soluzione tampone di cacodilato è tossica; pertanto, maneggiare la soluzione fissativa in una cappa aspirante o in un'area aperta. Evitare di inalare i vapori della soluzione e indossare guanti durante la manipolazione.
  3. Preparare la soluzione nutritiva acquosa di Hoagland mescolando quanto segue: 3 mM Ca(NO3)2.4H 2O, 2 mM NH4H2PO4, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H 2O, 9.07 mM MnSO4, 0.765 mM ZnSO4.7H 2O, 46.4 mM H3BO3, 0,09 mM Na2MoO4. H2O, 0,01 mM CuSO4 e 36 mM FeSO 4,7H2O come ferro-EDTA (acido tetraacetico etilendiammina)27.

2. Campioni di piante e inoculazione di funghi

NOTA: Per esperimenti su foglie affette da ruggine di caffè, cinque piantine di caffè arabica cv di 2 mesi. I Catuaí sono stati coltivati e tenuti in una serra presso il Centro di Energia Nucleare in Agricoltura (CENA) dell'Università di San Paolo, Piracicaba, Stato di San Paolo, Brasile.

  1. Coltiva piante di caffè in vasi di plastica da 500 ml riempiti con soluzione nutritiva acquosa di Hoagland (pH di ~ 5,5) per 4 mesi in una camera di crescita mantenuta a 27 ± 3 ° C con un fotoperiodo di 12 ore creato da lampade a LED al flusso fotonico di 250 μmol fotoni s-1 m-2. Sostituire la soluzione nutritiva Hoagland ogni settimana per 4 mesi.
  2. Inoculare quattro foglie espanse di cinque piante sulle loro superfici abassiali con 1 x 103 H. vastatrix uredospore seguendo il metodo descritto al riferimento28. Dopo l'inoculazione, tenere le piante per 48 ore al buio coprendole con un sacchetto di plastica nero. Raccogli le lesioni 30 giorni dopo l'inoculazione.
  3. Lesioni caratteristiche della raccolta causate da Cercospora coffeicola da Coffea arabica cv. Impianti di Obatã situati (coordinate: -22.906506126269942, -47.015075902025266) presso l'Istituto Biologico, Campinas, Stato di San Paolo, Brasile. Prima di elaborare il campione, analizzare le lesioni in uno stereomicroscopio per verificare la presenza di caffè C. coffeicola conidia. Quindi, montare alcuni vetrini con i conidi per confermare l'eziologia della malattia22.

3. Raccolta, fissazione e disidratazione del campione

  1. Usando un bisturi e una pinzetta, raccogliere un campione di foglie ~ 10 mm2 nella regione centrale della lesione (macchie gialle; Figura 1) e immergerlo in 30 ml di soluzione fissativa di Karnovsky (Figura 1 e Figura 2A). La fase di fissaggio può avvenire in frigorifero per 48 ore.
  2. Per almeno quattro volte, sottoporre il campione fogliare a un basso vuoto (500-600 mBar) utilizzando una pompa dell'olio per 15 minuti ciascuna per aumentare la permeabilità della soluzione fissativa nel tessuto fogliare. Eseguire questo passaggio con la rotazione del campione (Figura 1).
  3. Dopo la fissazione, lavare il campione di foglie tre volte in un tampone cacodilato da 0,5 M (pH 7,2) diluito in acqua distillata per 5 minuti ciascuno e quindi trasferirlo in una serie etanolica graduata (30%, 50%, 70%, 90% (2x) e 100% (2x)) per 15 minuti a ciascuna concentrazione di etanolo (Figura 1 e Figura 2B).

4. Procedura di incorporamento dell'istoresina

  1. Trasferire gradualmente i campioni al glicole metacrilato (GMA) in tre passaggi, seguendo le istruzioni del produttore. Per prima cosa, preparare la Soluzione A mescolando la polvere GMA (1 g) con 100 ml di resina basica (kit istoresina; Tabella dei materiali) sotto agitazione magnetica, quindi seguire i passaggi seguenti.
    1. Immergere i campioni in Soluzione A: 100% etanolo per 3 ore.
    2. Immergere i campioni in Soluzione A: 100% etanolo per 3 ore.
    3. Immergere i campioni in una resina basica pura per 2-4 giorni. Durante questa fase, sottoporre i campioni a un basso vuoto almeno quattro volte al giorno per 15 minuti seguiti dalla rotazione.

5. Polimerizzazione

NOTA: Il processo di polimerizzazione richiede stampi in plastica da 1,2 ml, resina di base e indurente (vedere Tabella dei materiali per i dettagli del kit commerciale).

  1. Miscelare 15 mL di soluzione A (fase 4.1) con 1 mL di indurente in un becher con rotazione per 2 minuti per produrre la soluzione di polimerizzazione (soluzione B).
  2. Mettere 1,2 ml della soluzione di polimerizzazione (soluzione B) in stampi di plastica. Utilizzando un plettro di legno, trasferire i campioni di foglie lesionate dalla resina basica pura alla soluzione B (Figura 2C). Evitare l'uso di pinzette in quanto possono causare lo schiacciamento dei tessuti.
  3. Assicurarsi di orientare rapidamente i campioni di foglie perpendicolari agli stampi in plastica poiché la soluzione B diventa rapidamente viscosa entro 5 minuti. Più di un campione di foglie lesionate può essere collocato in un singolo stampo.
    NOTA: Si consiglia di praticare il passaggio precedente più volte prima di applicare molti campioni. Quando ci sono molti campioni, il tempo di polimerizzazione è diverso tra gli stampi e l'orientamento perpendicolare dei campioni fogliari può essere difficile da raggiungere.
  4. Quando si ottiene l'orientamento perpendicolare dei campioni di foglie, attendere 30 minuti, quindi trasferire lo stampo di plastica in una camera di plastica o vetro contenente gel di silice per evitare l'umidità. Attendere 2-3 ore per la polimerizzazione.
  5. Una volta che la resina e il campione di foglie sono polimerizzati dopo il periodo di 2-3 ore, staccare il blocco risultante dallo stampo di plastica levigando la base del blocco con una lima di levigatura. Quindi, incollare il blocco su un pezzo di legno (Figura 2D).

6. Sezionamento

  1. Utilizzando un microtomo rotativo dotato di lame in acciaio da 8 cm (Figura 2E), tagliare il blocco in sezioni spesse 5 μm. Posizionare le sezioni su vetrini ricoperti di acqua distillata. Trasferire i vetrini con le sezioni galleggianti sull'acqua su una piastra calda a 40 °C per asciugare e favorire l'adesione delle sezioni alle guide di vetro.
  2. Dopo l'essiccazione (Figura 2F), etichettare i vetrini con il nome di riferimento del blocco e il numero della diapositiva.

7. Doppio processo di colorazione

  1. Coprire le sezioni con 2 mL di blu cotone al 5% in lattofenolo (40% glicerolo, 20% fenolo e 20% acido lattico in acqua) e riscaldarle su una piastra calda a 45 °C per 5 minuti (Figura 3A).
  2. Rimuovere il colorante in eccesso lavando il vetrino tre volte in un becher riempito con acqua distillata (Figura 3B-D).
  3. Macchiare con 2 mL di rosso rutenio allo 0,01% in acqua per 1 minuto (Figura 3E).
  4. Rimuovere il colorante in eccesso lavando il vetrino tre volte in un becher riempito con acqua distillata (Figura 3F,G).
  5. Mettere una goccia di acqua distillata sopra le sezioni e coprire le sezioni con un coverslip di 24 mm x 60 mm per eseguire l'analisi al microscopio ottico.

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Representative Results

La colorazione di lattofenolo blu cotone sulla sezione incorporata in GMA ha rivelato la presenza di diverse strutture fungine tra e all'interno delle cellule mesofille del caffè in entrambe le interazioni fungine biotrofiche e necrotrofiche.

Nel patosistema biotrofico, quando colorato con il metodo della doppia colorazione, Hemileia vastatrix hyphae contenente pareti cellulari e il denso contenuto di protoplasti appaiono in blu scuro sia nel parenchima spugnoso che in quello palizzata (Figura 4A,B). Anche la cellula madre dell'haustorium (Hmc) e l'haustoria mostrano un forte colore blu scuro (Figura 4C). Quando contromacchia con rosso rutenio, la distribuzione fungina negli spazi intercellulari è chiaramente definita (Figura 4D). La presenza di un Hmc blu scuro aiuta a rilevare la zona di infezione. Durante l'interazione, H. vastatrix Hmc ha rotto la parete cellulare ospite e ha sviluppato un collo haustoriale che potrebbe essere circondato da composti pectici (Figura 4E, F). Tuttavia, l'incapsulamento ricco di pectina (colore rosa-rosso) del collo haustoriale non è in grado di prevenire la formazione haustoriale (Figura 4E, F). In alcuni casi, l'incapsulamento ricco di pectina ha racchiuso l'haustorio in modo incompleto (Figura 4G) e in alcuni casi, l'haustorio è completamente incapsulato (Figura 4H).

Nell'interazione necrotrofica, il protocollo di doppia colorazione è stato utile anche per verificare l'interazione di Cercospora coffeicola con i tessuti mesofillici del caffè. Al bordo della lesione, dove il fungo non è presente, la parete cellulare ricca di pectina ha mantenuto la sua integrità (Figura 5A). Il metodo della doppia colorazione ha dimostrato la presenza di ife intercellulari (Figura 5B,C). Nelle zone di interazione, le pareti cellulari della pectina sembravano perdere la loro integrità a causa della dissoluzione (Figura 5B,C). Strutture riproduttive, come il conidioforo, sono state trovate nell'epidermide adassiale (Figura 5D). Nella camera substomatica, C. coffeicola hyphae sono state trovate come strutture di curling. Il parenchima palizzata nella regione lesionata sembra subire la lisi della parete cellulare (Figura 5E).

Figure 1
Figura 1: Dettagli dei singoli passaggi del protocollo per la raccolta dei tessuti lesionati. Raccogli il pezzo della lesione con un bisturi e una pinzetta. Immergere i campioni di foglie nella soluzione fissativa. Sottoporre i campioni al pompaggio e alla rotazione del vuoto. Seguire il protocollo per i processi di disidratazione e incorporamento. Il campione polimerizzato viene sezionato in un microtomo rotativo. I vetrini con sezioni di lesione sono montati e colorati per verificare le ife fungine e le pareti cellulari ricche di pectina utilizzando il metodo della doppia colorazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Dettagli dei singoli passaggi della sezione campione prima della doppia colorazione. (A) Fase di fissazione. B) disidratazione in serie di etanolo graduato; il tessuto fogliare viene incubato in etanolo per 15 minuti ad ogni concentrazione. (C) Polimerizzazione all'interno dello stampo plastico. (D) Blocco di campione polimerizzato incollato ad un pezzo di legno. (E) Blocco incollato al legno posizionato sul microtomo per il processo di sezionamento. (F) Sezioni di tessuto sul vetrino (indicate da frecce). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Dettagli dei singoli passaggi del protocollo di doppia colorazione. (A) Coprire le sezioni con gocce di lattofenolo blu cotone e riscaldare i vetrini su una piastra calda a 45 °C. (B-C) Rimuovere il colorante in eccesso lavandolo in acqua distillata. (D) Sezioni sui vetrini dopo il lavaggio (indicate da frecce). (E) Coprire le sezioni con gocce di rosso rutenio. (F-G) Rimuovere il colorante in eccesso lavandolo in acqua distillata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Protocollo istochimico di doppia colorazione per la pectina e le strutture fungine nella lesione da ruggine del caffè. (A-C) Sezioni macchiate solo con lattofenolo blu cotone. Le ife fungine sono macchiate di blu scuro (frecce). La cellula madre haustorium (Hmc) e l'haustorium (Ha) hanno un colore blu scuro. (D-H) Doppia colorazione con lattofenolo blu cotone e rosso rutenio. (D) Panoramica della pustola (Pu) su una foglia. (E-F) Collo haustoriale (frecce) con pectina (colore rosa-rosso). (G) Le frecce indicano l'inizio dell'incapsulamento ricco di pectina dell'haustorium. (H) Incapsulamento completo dell'haustorium mediante pectina (frecce). Epi Aba - Epidermide abassiale; Epi Ada - Epidermide adassiale; Sp - Parenchima spugnoso; Pp - parenchima palizzata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Protocollo istochimico di doppia colorazione per la pectina e le strutture fungine nelle lesioni da cercosporiosi nei tessuti mesofillici del caffè. (A) Bordo della lesione senza funghi. (B-F) Sezioni trasversali della foglia lesionata. (A) L'integrità delle pareti cellulari ricche di pectina del parenchima spugnoso. (B-D,F) Nei tessuti infetti, le cercospore di coffeicola ife erano evidenti (frecce) e causavano danni alle pareti cellulari pectiche. È stato possibile verificare il conidioforo sotto la cuticola (CT) (D). Epi Aba - Epidermide abassiale; Epi Ada - Epidermide adassiale; Sp - Parenchima spugnoso; Pp - Palisade Parenchyma; St - Stomata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il presente lavoro introduce un test istochimico alternativo a doppia colorazione per studiare la composizione della pectina delle pareti cellulari che incapsula haustoria in un patosistema biotrofico. L'obiettivo è anche quello di dimostrare l'efficacia del metodo per rilevare i funghi necrotrofici e i cambiamenti della parete cellulare da esso indotti. Qui, la pectina delle pareti cellulari del parenchima del caffè può incapsulare sia il collo che l'haustorium del fungo ruggine Hemileia vastatrix. Silva et al. hanno anche descritto l'incapsulamento da parte della cellulosa e della callosio nel patosistema coffee-H. vastatrix 14,29. Tra i polimeri della parete cellulare associati ai meccanismi di difesa, la pectina svolge un ruolo importante nel sistema patogeno-vegetale 10,11,12. Pertanto, la conoscenza delle funzioni della pectina è di grande valore istopatologico.

La cercosporiosi nel caffè, causata dalla Cercospora coffeicola, danneggia i tessuti fogliari e alla fine porta alla morte cellulare. Questi sintomi sono principalmente causati dall'attività della cercosporina e degli enzimi degradanti della parete cellulare20. Gli studi che utilizzano il rosso rutenio hanno dimostrato una perdita di integrità della parete cellulare, simile a uno studio precedente sulle foglie di cachi infettate da Pseudocercospora kaki30. L'analisi istopatologica con il metodo della doppia colorazione ha dimostrato la presenza delle ife fungine e questa analisi è efficace per rilevare le ife fungine negli spazi intercellulari. In alternativa, la microscopia elettronica a scansione (SEM) ha dimostrato efficacia nell'osservare C. coffeicola hyphae25; tuttavia, la disponibilità di attrezzature così sofisticate, insieme al laborioso lavoro di preparazione del campione, è un fattore limitante. Inoltre, l'analisi SEM non consente il riconoscimento chimico della pectina nelle pareti cellulari. Al contrario, la doppia colorazione è un metodo importante per rilevare i cambiamenti della pectina. Tuttavia, il metodo qui descritto ha una limitazione per quanto riguarda la risoluzione della microscopia ottica che non consente un aumento dei dettagli dell'ultrastruttura dell'interazione pianta-fungo. Inoltre, il metodo di doppia colorazione qui presentato non è specifico per rilevare le specie fungine e devono, pertanto, essere condotti ulteriori saggi molecolari.

La preparazione del campione segue protocolli di routine in anatomia vegetale; tuttavia, alcuni punti richiedono un'attenzione particolare. Ad esempio, la fissazione è un passaggio critico. La dimensione dei campioni e la cura nella loro raccolta sono essenziali per una buona fissazione. Tempo, temperatura, pH e osmolarità sono cruciali per i tessuti vegetali31. I tessuti fogliari lesionati sono organi aerei e devono essere sottoposti ad un lieve vuoto per migliorare la fissazione. L'uso di glicole metacrilato (GMA) richiede etanolo come solvente per la disidratazione; i tessuti che non sono adeguatamente disidratati possono presentare difficoltà durante il processo di incorporamento. Questa condizione peggiora quando i tessuti vegetali hanno molti composti fenolici, come nel caso delle foglie di caffè. Inoltre, trattare con piccole parti di tessuti è importante; in caso contrario, sono necessari metodi di incorporamento alternativi32.

La tecnica di doppia colorazione qui presentata è un adattamento del protocollo riportato da Marques et al.33. In quel protocollo, gli autori hanno usato il blu di cotone (5%) e l'1% di safranina per distinguere le strutture fungine e le pareti cellulari delle piante. La tecnica è stata utile per rilevare la presenza di funghi in diversi patosistemi, come Colletotrichum acutatum-citrus petals e Guignardia citricarpa-citrus fruit33Plasmodiophora brassicae in Arabidopsis thaliana34, Elsinoë ampelina in Vitis labrusca35, e altri. Recentemente, Marques e Soares36hanno compilato una serie di tecniche microscopiche, tra cui i metodi di luce e fluorescenza, per distinguere le caratteristiche vegetali e fungine37. Tuttavia, in alcune regioni o paesi, come il Brasile, i microscopi a fluorescenza e SEM potrebbero non essere disponibili; pertanto, l'uso di microscopi ottici è un'alternativa importante ed economica per la ricerca e persino per i metodi didattici impiegati nelle università e nelle scuole superiori. Le ife fungine sono state rilevate microscopicamente nei tessuti sia vegetali che animali dal colorante blu di cotone 36,38,39,40. Questo è legato alla reazione positiva del colorante con la parete fungina ricca di chitina40. La formula blu di cotone include lattofenolo, che è una soluzione che agisce come mordente per il tessuto41, preservando così la struttura fungina quando mescolata con il blu di cotone. 

Qui, lo 0,05% di rosso rutenio è stato utilizzato per sostituire la safranina. L'aspetto positivo presentato in questo studio è che la pectina, un polimero specifico della parete cellulare, è stata colorata per fornire importanti dati qualitativi. Il rosso rutenio è un reagente utilizzato per rilevare gruppi acidi di pectina poliuronicoacidi 42,43,44. È specifico per la pectina e non macchia altri componenti carboidrati della parete cellulare (cioè cellulosa o callosio). Catene di acidi galatturoni disposti in diverse dorsali strutturali e biochimiche compongono la pectina 8,9,45. La reattività del rosso rutenio alla parete cellulare dipende dal grado di esterificazione metilica11. Il grado di esterificazione metilica dipende dall'attività delle pectina metil esterasi (PME), e quindi il rosso rutenio è stato utilizzato anche come strumento per discriminare l'attività PME11.

Pertanto, il metodo di doppia colorazione qui descritto è uno strumento utile per verificare le modifiche della pectina nelle interazioni pianta-funghi. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo rapporto di pectina nell'incapsulamento haustoriale dei funghi ruggine del caffè. È interessante notare che il metodo della doppia colorazione era anche importante per osservare le strutture fungine, per descrivere il danno causato alla parete cellulare ricca di pectina e per verificare le strutture riproduttive fungine. Ulteriori studi istopatologici su ruggini, antracnosi, cercosporiosi, smut e altre interazioni biotrofiche, emibiotrofiche e necrotrofiche pianta-fungine dovrebbero essere condotti per studiare il potenziale uso di questa tecnica in diversi patosistemi.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Hudson W. P. de Carvalho per il supporto allo sviluppo di questo lavoro. Gli autori sono anche grati al Laboratorio di Microscopia Elettronica ''Prof. Elliot Watanabe Kitajima'' per aver fornito la struttura di microscopia ottica. Gli autori ringraziano la dottoressa Flávia Rodrigues Alves Patrício per aver fornito lesioni al materiale vegetale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blades DB80 HS Leica 14035838383 Sectioning
Cacodylate buffer EMS # 11652 Fixation
Cotton Blue Lactophenol Metaquímica 70SOLSIG024629 Staining
Formaldehyde EMS #15712 Fixation
Glutaraldehyde EMS #16216 Fixation
Historesin Kit Technovit /EMS #14653 Historesin for embedding
Hot plate Dubesser SSCD25X30-110V Staining
Microscopy Zeiss #490040-0030-000 Image capture
Microtome (Leica RM 2540) Leica 149BIO000C1 14050238005 Sectioning
Plastic molding cup tray EMS 10176-30 Staining
Ruthenium red LABHouse #006004 Staining
Software Axion Vision Zeiss #410130-0909-000 Image capture
Vaccum pump Prismatec 131 TIPO 2 V.C. Fixation

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References

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Biologia Numero 180 Caffè funghi haustorium istochimica pectina microscopia
Metodo a doppia colorazione per rilevare la pectina nell'interazione pianta-fungo
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Marques, J. P. R., Nuevo, L. G.… More

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G. Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction. J. Vis. Exp. (180), e63432, doi:10.3791/63432 (2022).

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