Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dobbel fargingsmetode for å oppdage pektin i plantesvampinteraksjon

Published: February 4, 2022 doi: 10.3791/63432
Automatic Translation
1, 2
1Faculty of Animal Science and Food Engineering, Department of Basic Sciences, University of São Paulo, 2Laboratory of Nuclear Instrumentation, Center of Nuclear Energy in Agriculture, University of São Paulo

Summary

Denne protokollen beskriver en mikroskopisk metode for å oppdage pektin i kaffe-sopp interaksjon.

Abstract

Planteceller bruker forskjellige strukturelle mekanismer, enten konstituerende eller inducible, for å forsvare seg mot soppinfeksjon. Innkapsling er en effektiv induserbar mekanisme for å isolere sopp haustoria fra plantecelleprotoplasten. Omvendt er pektin, en av de polymere komponentene i celleveggen, et mål for flere pektolytiske enzymer i nekrotrofiske interaksjoner. Her presenteres en protokoll for å oppdage pektin og sopphyphae gjennom optisk mikroskopi. Den pektinrike innkapslingen i kaffecellene som er smittet av rustsvampen Hemileia vastatrix og mesophyllcelleveggmodifiseringen indusert av Cercospora coffeicola undersøkes. Lesjonerte bladprøver ble løst med Karnovsky-løsningen, dehydrert og innebygd i glykolmetakrylat i 2-4 dager. Alle trinnene ble etterfulgt av vakuumpumpende for å fjerne luft i intercellulære rom og forbedre innebyggingsprosessen. De innebygde blokkene ble seksjonert i 5-7 μm tykke seksjoner, som ble avsatt på en glasssklie dekket med vann og deretter oppvarmet ved 40 °C i 30 minutter. Deretter ble lysbildene dobbeltfarget med 5% bomullsblå i laktiofenol for å oppdage sopp og 0,05% ruthenium rød i vann for å oppdage pektin (sure grupper av polyuronsyrer av pektin). Sopp haustoria av Hemileia vastatrix ble funnet å være innkapslet av pektin. Ved kaffe cercosporiosis viste mesofyllceller oppløsning av cellevegger, og intercellulære hyphae og konidiofrener ble observert. Metoden som presenteres her er effektiv for å oppdage en pektin-assosiert respons i plante-sopp interaksjonen.

Introduction

Celleveggforsvarsmekanismer i planter er avgjørende for å begrense soppinfeksjon. Studier har rapportert endringer i celleveggtykkelse og sammensetning siden 1800-tallet 1,2. Disse endringene kan induseres av et sopppatogen som stimulerer dannelsen av en papilla, som forhindrer sopp i å komme inn i cellen eller kan brukes til å innkapsle hyphae for å isolere vertscellens protoplast fra sopp haustoria. Produksjonen av en dynamisk celleveggbarriere (dvs. papill og et fullt innkapslet haustorium) er viktig for å fremme plantemotstand3. Histopatologiske studier på sopprelaterte sykdommer har undersøkt forekomsten av disse mekanismene og har beskrevet celleveggpolymerer, cellulose, hemicellulose (arabinoxylans) og callose som motstandsmekanismer for soppangrep 4,5,6,7.

Celleveggen er den første barrieren mot mikroorganismeangrep, noe som svekker plantesvampinteraksjonen. Pectic polysakkarider komponerer celleveggen og står for ca 30% av celleveggsammensetningen i primærceller av eudikosplanter der homogalakuronans er den mest tallrike polymeren (omtrent 60%)8. Golgi skiller ut komplekse pektinforbindelser som utgjør galaktronsyrekjedene, som kan eller ikke kan metyleres 8,9. Siden 2012 har litteraturen påpekt at graden av pektinmetylesterifisering er avgjørende for å bestemme kompatibiliteten under infeksjon ved mikrobielle pektiske enzymer 10,11,12. Dermed er protokoller nødvendig for å verifisere tilstedeværelse og distribusjon av pektiske forbindelser i plante-soppbanesystemer.

Ulike teknikker har blitt brukt til å oppdage innkapsling av papill eller haustoria. Referansemetodene som brukes er transmisjonselektronmikroskopi (TEM) av fast vev og lysmikroskopi av levende og faste vev. Når det gjelder TEM, har flere studier vist den strukturelle rollen til celleveggappposisjoner i soppresistens 13,14,15,16, og at bruk av lectins og antistoffer er en intrikat metode for å finne karbohydratpolymerer 16. Studier viser imidlertid at lysmikroskopi er en viktig tilnærming, og at de histokjemiske og immunhiistokjemiske verktøyene gir en bedre forståelse av sammensetningen av papiller og haustorium innkapsling 6,7.

Patogene sopp viser to hovedtyper av livsstil: biotrofisk og nekrotrofisk. Biotrofiske sopp er avhengige av levende celler for ernæring, mens nekrotrofiske sopp dreper vertscellene, og bor deretter i det døde vevet17. I Latin-Amerika er kaffeblad rust, forårsaket av sopp hemileia vastatrix, en viktig sykdom i kaffeavlinger18,19. Hemileia vastatrix presenterer en biotrofisk oppførsel, og blant de strukturelle endringene som observeres i resistente kaffearter eller kultivarer, er det rapportert en overfølsomhetsrespons, avsetning av callose, cellulose og lignin på celleveggene, samt cellehypertrofi14. Til forfatternes kunnskap rapporterer ikke litteraturen informasjon om betydningen av pektin i kaffe rustmotstand. På den annen side, nekrotrofiske sopp som forårsaker cercosporiosis mål pektin via et sett av enzymer forbundet med cellevegg nedbrytning, som pektinases og polygalacturonase20. Cercosporiosis i kaffe, forårsaket av sopp Cercospora coffeicola er også en stor trussel mot kaffeavlinger21,22. Denne soppen forårsaker nekrotiske lesjoner i både blader og bær. Etter penetrasjon koloniserer C. coffeicola plantevev gjennom intracellulære og intercellulære veier 23,24,25.

Den nåværende protokollen undersøker tilstedeværelsen av soppstrukturer og pektin på cellevegger. Denne protokollen er nyttig for å identifisere planteresponsen forbundet med pektin (farget med rutheniumrød fargestoff, som er spesifikk for sure grupper av polyuronsyrer av pektin), indusert av verten i en biotrofisk interaksjon med sopp. Det bidrar også til å verifisere effekten av nekrotrofiske sopp på nedbrytning av pektiske cellevegger. De nåværende resultatene indikerer at den doble fargingsmetoden er effektiv for å diskriminere strukturer og reproduksjonsfasen av sopp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av bufferløsning og reagenser

  1. Forbered 2 M kaktokylatbuffer ved å tilsette 4,28 g natriumkakroktylat til 100 ml destillert vann og juster pH til 7,25 med 0,2 N HCl.
  2. Forbered 100 ml av Karnovsky-fikseringsløsningen ved å blande 10 ml 25% vandig glutaraldehyd, 10 ml 10% vandig formaldehyd, 25 ml 2 M kaktokylatbuffer og 0,5 ml 0,5 M CaCl226. Utgjør volumet til 100 ml med destillert vann.
    MERK: Oppløsningen kan oppbevares i kjøleskap i 6 måneder.
    FORSIKTIG: Kaktokylatbufferløsningen er giftig; Håndter derfor den fikseringsløsningen i en avtrekkshette eller et åpent område. Unngå å inhalere oppløsningsdampene og bruk hansker under håndtering.
  3. Forbered vandig Hoagland næringsløsning ved å blande følgende: 3 mM Ca(NO3)2,4H 2O, 2 mM NH4H2PO4, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4,7H 2O, 9,07 mM MnSO4, 0,765 mM ZnSO4,7H 2O, 46,4 mM H3BO3, 0,09 mM Na2MoO4. H2O, 0,01 mM CuSO4 og 36 mM FeSO 4,7H2O som jern-EDTA (etylendiamintetraedsyre)27.

2. Planteprøver og sopp inokulering

MERK: For eksperimenter på blader påvirket av kaffe rust, fem 2 måneder gamle frøplanter av Coffee arabica cv. Catuaí ble dyrket og holdt i et drivhus ved Center of Nuclear Energy in Agriculture (CENA) ved Universitetet i São Paulo, Piracicaba, São Paulo State, Brasil.

  1. Dyrk kaffeplanter i 500 ml plastpotter fylt med vandig Hoagland næringsløsning (pH på ~ 5,5) i 4 måneder i et vekstkammer holdt ved 27 ± 3 ° C med en 12 timers fotoperiod opprettet av LED-lamper ved fotonstrømmen på 250 μmol fotoner s-1 m-2. Bytt ut Hoagland næringsløsning hver uke i 4 måneder.
  2. Inokuler fire utvidede blader fra fem planter på deres abaxial overflater med 1 x 103 H. vastatrix uredospores etter metoden beskrevet i referanse28. Etter inokulering, hold plantene i 48 timer i mørket ved å dekke dem med en svart plastpose. Høst lesjonene 30 dager etter inokulasjon.
  3. Høst karakteristiske lesjoner forårsaket av Cercospora coffeicola fra Coffea arabica cv. Obatã planter lokalisert (koordinater: -22.906506126269942, -47.015075902025266) ved Biologisk institutt, Campinas, São Paulo State, Brasil. Før du behandler prøven, analyser lesjonene i et stereomikroskop for å bekrefte tilstedeværelsen av kaffe C. coffeicola conidia. Monter deretter noen lysbilder med conidia for å bekrefte sykdomsetiologien22.

3. Prøv høsting, fiksering og dehydrering

  1. Bruk en skalpell og pinsett, høst en ~ 10 mm2 bladprøve i midten av lesjonen (gule flekker; Figur 1) og senk den ned i 30 ml Karnovsky fixative løsning (figur 1 og figur 2A). Fikseringstrinnet kan foregå i kjøleskap i 48 timer.
  2. I minst fire ganger, underkast bladprøven til et lavt vakuum (500-600 mBar) ved hjelp av en oljepumpe i 15 minutter hver for å øke permeabiliteten til den fikseringsløsningen i bladvevet. Utfør dette trinnet med prøverotasjon (figur 1).
  3. Etter fiksering, vask bladprøven tre ganger i 0,5 M kaktocylatbuffer (pH 7,2) fortynnet i destillert vann i 5 minutter hver, og overfør den deretter til en gradert etanolserie (30 %, 50 %, 70 %, 90 % (2x) og 100 % (2x)) i 15 minutter ved hver etanolkonsentrasjon (figur 1 og figur 2B).

4. Historesin innebygging prosedyre

  1. Overfør prøvene gradvis til glykol metakrylat (GMA) i tre trinn, i henhold til produsentens instruksjoner. Lag først løsning A ved å blande GMA-pulveret (1 g) med 100 ml grunnleggende harpiks (historesinsett; Tabell over materialer) under magnetisk agitasjon, og følg deretter trinnene nedenfor.
    1. Senk prøvene ned i 1:2 Løsning A: 100 % etanol i 3 timer.
    2. Senk prøvene ned i 1:1 Løsning A: 100 % etanol i 3 timer.
    3. Senk prøvene i en ren grunnleggende harpiks i 2-4 dager. I løpet av dette trinnet, underkast prøvene til et lavt vakuum minst fire ganger om dagen i 15 minutter etterfulgt av rotasjon.

5. Polymerisasjon

MERK: Polymerisasjonsprosessen krever 1,2 ml plastformer, grunnleggende harpiks og herder (se Materialtabell for detaljer i det kommersielle settet).

  1. Bland 15 ml oppløsning A (trinn 4.1) med 1 ml herder i et beger med rotasjon i 2 minutter for å produsere polymerisasjonsløsningen (løsning B).
  2. Sett 1,2 ml av polymerisasjonsløsningen (løsning B) i plastformer. Bruk en treplukking til å overføre de lesjonerte bladprøvene fra ren grunnharpiks til løsning B (figur 2C). Unngå å bruke pinsett, da de kan forårsake vevsknusing.
  3. Sørg for å raskt orientere bladprøver vinkelrett på plastformene, da løsning B raskt blir viskøs innen 5 min. Mer enn en lesjonert bladprøve kan plasseres i en enkelt form.
    MERK: Det anbefales å øve på trinnet ovenfor flere ganger før du søker på mange prøver. Når det er mange prøver, er polymerisasjonstiden forskjellig mellom formene, og vinkelrett orientering av bladprøvene kan være vanskelig å oppnå.
  4. Når bladprøvenes vinkelrette orientering oppnås, vent i 30 min, og overfør deretter plastformen til et plast- eller glasskammer som inneholder silikagel for å forhindre fuktighet. Vent i 2-3 timer for polymerisasjon.
  5. Når harpiksen og bladprøven er polymerisert etter 2-3 h-perioden, løsner du den resulterende blokken fra plastformen ved å slipe blokkbasen med en slipefil. Lim deretter blokken til et trestykke (figur 2D).

6. Seksjonering

  1. Bruk en roterende mikrotom utstyrt med 8 cm stålblader (figur 2E), skjær blokken i 5 μm tykke seksjoner. Plasser seksjonene på glasssklier dekket med destillert vann. Overfør lysbildene med seksjonene som flyter over vann til en kokeplate ved 40 °C for å tørke og fremme vedheft av seksjonene til glasssklier.
  2. Etter tørking (figur 2F) merker du glasslysbildene med blokkreferansenavnet og lysbildenummeret.

7. Dobbel fargingsprosess

  1. Dekk seksjonene med 2 ml 5 % bomullsblå i laktoppfenol (40 % glyserol, 20 % fenol og 20 % melkesyre i vann) og varm dem opp på en varm plate ved 45 °C i 5 minutter (figur 3A).
  2. Fjern overflødig fargestoff ved å vaske lysbildet tre ganger i et beger fylt med destillert vann (figur 3B-D).
  3. Flekk med 2 ml 0,01 % rutheniumrød i vann i 1 min (figur 3E).
  4. Fjern overflødig fargestoff ved å vaske lysbildet tre ganger i et beger fylt med destillert vann (figur 3F,G).
  5. Sett en dråpe destillert vann over seksjonene og dekk seksjonene med en 24 mm x 60 mm deksellip for å utføre lysmikroskopianalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den bomullsblå laktiofenolfargingen på den GMA-innebygde delen avslørte tilstedeværelsen av flere soppstrukturer mellom og inne i kaffemesofyllceller i både biotrofiske og nekrotrofiske soppinteraksjoner.

I det biotrofiske patosystemet, når det er farget ved hjelp av dobbeltfargingsmetoden, vises Hemileia vastatrix hyphae som inneholder cellevegger og det tette protoplastinnholdet i mørkeblått i både svampete og palisadeparenchyma (figur 4A, B). Haustorium-modercellen (Hmc) og haustoria har også en sterk mørkeblå farge (figur 4C). Ved motangrep med rutheniumrød er soppfordelingen i intercellulære rom klart definert (figur 4D). Tilstedeværelsen av en mørk blå Hmc bidrar til å oppdage infeksjonssonen. Under samspillet brøt H. vastatrix Hmc vertscelleveggen og utviklet en haustorial hals som kunne være omgitt av pektiske forbindelser (figur 4E, F). Likevel er den pektinrike innkapslingen (rosa-rød farge) av haustorialhalsen ikke i stand til å forhindre haustorial formasjon (figur 4E, F). I noen tilfeller innkapslet den pektinrike innkapslingen haustoriumet ufullstendig (figur 4G), og i noen tilfeller er haustoriumet fullt innkapslet (figur 4H).

I den nekrotrofiske interaksjonen var den doble fargingsprotokollen også nyttig for å verifisere samspillet mellom Cercospora coffeicola og kaffemesophyll vev. Ved lesjonsgrensen, hvor soppen ikke er til stede, holdt den pektinrike celleveggen sin integritet (figur 5A). Den doble fargingsmetoden viste tilstedeværelsen av intercellulær hyphae (figur 5B, C). I interaksjonssoner så pektincellevegger ut til å miste sin integritet på grunn av oppløsning (figur 5B,C). Reproduktive strukturer, som conidiophore, ble funnet i adaxial epidermis (figur 5D). I det substomatiske kammeret ble C. coffeicola hyphae funnet som curling strukturer. Palisadeparenchyma i den lesjonerte regionen ser ut til å gjennomgå cellevegglys (figur 5E).

Figure 1
Figur 1: Detaljer om de enkelte trinnene i protokollen for å høste lesjonert vev. Høst lesjonens stykke med en skalpell og en pinsett. Senk bladprøvene ned i den fikseringsløsningen. Utsett prøvene for vakuumpumpe og rotasjon. Følg protokollen for dehydrerings- og innebyggingsprosessene. Den polymeriserte prøven er seksjonert i en roterende mikrotom. Lysbildene med lesjonsseksjoner er montert og farget for å verifisere sopphyphae og pektinrike cellevegger ved hjelp av dobbelfargingsmetoden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Detaljer om de enkelte trinnene i prøvedelen før dobbel farging. (A) Fikseringstrinn. (B) Dehydrering i graderte etanolserier; bladvevet inkuberes i etanol i 15 min ved hver konsentrasjon. (C) Polymerisering inne i plastformen. (D) Blokk med polymerisert prøve limt til et trestykke. (E) Trelimt blokk plassert på mikrotommet for seksjonsprosessen. (F) Vevsseksjoner på lysbildet (betegnet med piler). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Detaljer om de enkelte trinnene i dobbeltflekkingsprotokollen. (A) Dekk seksjonene med dråper bomullsblå laktoppfenol og varm opp skliene på en kokeplate ved 45 °C. (B-C) Fjern overflødig fargestoff ved å vaske i destillert vann. (D) Seksjoner på glasset glir etter vask (betegnet med piler). (E) Dekk seksjonene med dråper ruthenium rød. (F-G) Fjern overflødig fargestoff ved å vaske i destillert vann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Histokjemisk dobbeltfargingsprotokoll for pektin- og soppstrukturer i kaffe rustlesjon. (A-C) Seksjoner farget bare med bomullsblå laktoppfenol. Sopphyphae er farget i mørkeblå (piler). Haustorium morscelle (Hmc) og haustorium (Ha) har en mørk blå farge. (D-H) Dobbel farging ved hjelp av bomullsblå laktiofenol og ruthenium rød. (D) Oversikt over pustule (Pu) på et blad. (E-F) Haustorial nakke (piler) med pektin (rosa-rød farge). (G) Piler indikerer begynnelsen på pektinrik innkapsling av haustorium. (H) Fullstendig innkapsling av haustorium ved pektin (piler). Epi Aba - Epidermis abaxial; Epi Ada - Epidermis adaxial; Sp - Svampete parenchyma; Pp - palisade parenchyma. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Histokjemisk dobbeltfargingsprotokoll for pektin- og soppstrukturer i cercosporiosis lesjoner i kaffemesofyllvev. (A) Lesjonskant uten sopp. (B-F) Tverrsnitt av det lesjonerte bladet. (A) Integriteten til pektinrike cellevegger i det svampete parenchymaet. (B-D,F) I det infiserte vevet var Cercospora coffeicola hyphae tydelig (piler) og forårsaket skade i pektiske cellevegger. Det var mulig å verifisere conidiophore under kutikal (CT) (D). Epi Aba - Epidermis abaxial; Epi Ada - Epidermis adaxial; Sp - Svampete parenchyma; Pp - Palisade Parenchyma; St - Stomata. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det nåværende arbeidet introduserer en alternativ dobbeltfarging histokjemisk test for å undersøke pektinsammensetningen av cellevegger som innkapsler haustoria i et biotrofisk patosystem. Målet er også å demonstrere effekten av metoden for å oppdage nekrotrofisk sopp og celleveggendringer indusert av den. Her kan pektin av kaffeparenchyma cellevegger innkapsle både nakken og haustoriumet til rustsvampen Hemileia vastatrix. Silva et al. har også beskrevet innkapsling ved cellulose og callose i kaffe-H. vastatrix pathosystem14,29. Blant celleveggpolymerene forbundet med forsvarsmekanismer spiller pektin en viktig rolle i plantepatogensystemet 10,11,12. Derfor er kunnskap om pektinfunksjoner av stor histopatisk verdi.

Cercosporiosis i kaffe, forårsaket av Cercospora coffeicola, skader bladvevet og fører til slutt til celledød. Disse symptomene er hovedsakelig forårsaket av aktiviteten til cercosporin og cellevegg nedbrytende enzymer20. Studier med ruthenium rød viste tap av celleveggintegritet, lik en tidligere studie på persimmonblader smittet av Pseudocercospora kaki30. Den histopatologiske analysen ved hjelp av dobbeltfargingsmetoden viste tilstedeværelsen av sopphyfasen, og denne analysen er effektiv for å oppdage sopphyphae i intercellulære rom. Alternativt har skanning av elektronmikroskopi (SEM) vist effekt for å observere C. coffeicola hyphae25; Imidlertid er tilgjengeligheten av slikt sofistikert utstyr, sammen med det arbeidskrevende arbeidet med prøvepreparering, en begrensende faktor. Videre tillater SEM-analysen ikke kjemisk anerkjennelse av pektin i cellevegger. Omvendt er dobbel farging en viktig metode for å oppdage pektinendringer. Metoden beskrevet her har imidlertid en begrensning med hensyn til oppløsningen av lysmikroskopi som ikke tillater en økning i detaljer om ultrastruktur av plante-soppinteraksjon. Også den doble fargingsmetoden som presenteres her er ikke spesifikk for å oppdage sopparter, og ytterligere molekylære essays må derfor utføres.

Prøveprepareringen følger rutinemessige protokoller i planteanatomi; Noen punkter trenger imidlertid spesiell oppmerksomhet. For eksempel er fiksering et kritisk trinn. Størrelsen på prøvene og omsorgen ved høsting av dem er avgjørende for god fiksering. Tid, temperatur, pH og osmolaritet er avgjørende for plantevev31. Det lesjonerte bladvevet er luftorganer og må utsettes for et mildt vakuum for å forbedre fiksering. Bruk av glykol metakrylat (GMA) krever etanol som dehydreringsløsningsmiddel; vev som ikke er riktig dehydrert, kan gi vanskeligheter under innebyggingsprosessen. Denne tilstanden forverres når plantevevet har mange fenolforbindelser, som i tilfelle kaffeblader. Videre er det viktig å håndtere små deler av vev; Ellers kreves alternative innebyggingsmetoder32.

Dobbeltfargingsteknikken som presenteres her er en tilpasning av protokollen rapportert av Marques et al.33. I den protokollen brukte forfatterne bomullsblå (5%) og 1% safranin for å skille soppstrukturer og plantecellevegger. Teknikken var nyttig for å oppdage tilstedeværelsen av sopp i forskjellige patosystemer, som Colletotrichum acutatum-citrus kronblader og Guignardia citricarpa-sitrusfrukt 33Plasmodiophora brassicae i Arabidopsis thaliana34, Elsinoë ampelina i Vitis labrusca35 og andre. Nylig samlet Marques og Soares36en rekke mikroskopiske teknikker, inkludert lys- og fluorescensmetodene, for å skille planten og soppfunksjonene37. Men i noen regioner eller land, for eksempel Brasil, kan det hende at fluorescensmikroskoper og SEM ikke er tilgjengelige; Derfor er bruk av lysmikroskop et viktig og billigere alternativ for forskning og til og med didaktiske metoder som brukes ved universiteter og videregående skoler. Sopphyphae har blitt mikroskopisk påvist i både plante- og dyrevev med bomullsblå fargestoff 36,38,39,40. Dette er relatert til den positive reaksjonen av fargestoffet med den chitinrike soppveggen40. Den bomullsblå formelen inkluderer laktiofenol, som er en løsning som fungerer som et mordant for vevet41, og dermed bevarer soppstrukturen når den blandes med bomullsblå. 

Her ble 0,05% ruthenium rød brukt til å erstatte safranin. Det positive aspektet som presenteres i denne studien er at pektin, en bestemt polymer av celleveggen, ble farget for å gi viktige kvalitative data. Ruthenium rød er et reagens som brukes til å oppdage sure grupper av pektinpolyuronsyrer 42,43,44. Det er spesifikt for pektin og flekker ikke andre karbohydratkomponenter i celleveggen (dvs. cellulose eller callose). Kjeder av galaktronsyrer arrangert i forskjellige strukturelle og biokjemiske ryggrader komponerer pektin 8,9,45. Reaktivitet av ruthenium rød til celleveggen avhenger av graden av metyl esterifisering11. Graden av metylesterifisering avhenger av aktiviteten til pektinmetylsteraser (PME), og dermed ble rutheniumrød også brukt som et verktøy for å diskriminere PME-aktiviteten11.

Dermed er dobbeltfargingsmetoden beskrevet her et nyttig verktøy for å verifisere pektin modifikasjoner i plante-sopp interaksjoner. Så vidt forfatterne vet, er dette den første rapporten om pektin i haustorial innkapsling av kaffe rust sopp. Interessant nok var dobbeltfargingsmetoden også viktig for å observere soppstrukturer, for å beskrive skaden forårsaket av den pektinrike celleveggen, og for å verifisere sopp reproduktive strukturer. Ytterligere histopatiske studier på rust, antracnose, cercosporiosis, smuts og andre biotrofiske, hemibiotrofiske og nekrotrofiske plante-sopp interaksjoner bør utføres for å undersøke potensiell bruk av denne teknikken i forskjellige patosystemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Dr. Hudson W. P. de Carvalho for støtten til å utvikle dette arbeidet. Forfatterne er også takknemlige til Laboratoriet for elektronmikroskopi ''Prof. Elliot Watanabe Kitajima'' for å gi lysmikroskopianlegget. Forfatterne takker Dr. Flávia Rodrigues Alves Patrício for å forsyne plantematerialet med lesjoner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blades DB80 HS Leica 14035838383 Sectioning
Cacodylate buffer EMS # 11652 Fixation
Cotton Blue Lactophenol Metaquímica 70SOLSIG024629 Staining
Formaldehyde EMS #15712 Fixation
Glutaraldehyde EMS #16216 Fixation
Historesin Kit Technovit /EMS #14653 Historesin for embedding
Hot plate Dubesser SSCD25X30-110V Staining
Microscopy Zeiss #490040-0030-000 Image capture
Microtome (Leica RM 2540) Leica 149BIO000C1 14050238005 Sectioning
Plastic molding cup tray EMS 10176-30 Staining
Ruthenium red LABHouse #006004 Staining
Software Axion Vision Zeiss #410130-0909-000 Image capture
Vaccum pump Prismatec 131 TIPO 2 V.C. Fixation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5 (1863).
  2. Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).
  3. Underwood, W. The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion. Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).
  4. Hückelhoven, R. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility. Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).
  5. Voigt, C. A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).
  6. Chowdhury, J., et al. Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei. New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).
  7. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).
  8. Caffall, K. H., Mohnen, D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).
  9. Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. , Wiley Blackwell. New York. 45 (2015).
  10. Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases. Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).
  11. Lionetti, V. Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses. Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).
  12. Lionetti, V., et al. Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis. Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).
  13. Heath, M. C. Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection. Phytopathology. 61, 383-388 (1971).
  14. Silva, M. C., et al. Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).
  15. An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress. Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).
  16. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus. Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).
  17. Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits. Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).
  18. Avelino, J., et al. The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions. Food Security. 7, 303-321 (2015).
  19. Zambolim, L. Current status and management of coffee leaf rust in Brazil. Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).
  20. Swiderska-Burek, U., et al. Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555 (2020).
  21. Andrade, C. C. L., et al. Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves. Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).
  22. Zambolim, L. Coffee tree diseases. Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , Agronômica Ceres Santana (in Portuguese). São Paulo. 810 (2016).
  23. Castaño, A. J. J. Coffee rust. Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).
  24. Echandi, E. Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola. Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).
  25. Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf. Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).
  26. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  27. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , University of California. Berkeley, California. 347 (1950).
  28. Eskes, A. B. Resistance. Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, Boca Raton. 171 (1989).
  29. Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III). International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).
  30. Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves. Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).
  31. Hayat, M. A. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. , International Publishing. Berkeley Heights. 564 (1981).
  32. Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T. Large plant samples: how to process for GMA embedding. Light microscopy: methods and protocols. Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. 689, Humana Press. 37-49 (2011).
  33. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. New staining technique for fungal-infected plant tissues. Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).
  34. Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
  35. Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate. Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517 (2020).
  36. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. Piracicaba, F. E. A. L. Q. , Santana. in Portuguese 140 (2021).
  37. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).
  38. Chesters, C. G. C. Three methods of using cotton blue as a mycological stain. Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).
  39. Macedo, N. A. Manual of Techniques in Plant Histology. Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , in Portuguese 68 (1997).
  40. Lecker, A. Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health Journal. 12 (30), 24 (1999).
  41. Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. Lactic acid in wool dyeing. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103 (1895).
  42. Chamberlain, C. J. Methods in Plant Histology. , The University of Chicago Press. Chicago. 349 (1932).
  43. Sterling, C. Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain. American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).
  44. Luft, J. H. Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action. The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).
  45. Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A. Cell Wall. Plant Physiology. Kerbauy, G. B. , Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. in Portuguese 165-181 (2013).

Tags

Biologi Utgave 180 Kaffe sopp haustorium histokjemi pektin mikroskopi
Dobbel fargingsmetode for å oppdage pektin i plantesvampinteraksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G.… More

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G. Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction. J. Vis. Exp. (180), e63432, doi:10.3791/63432 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter