Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Метод двойного окрашивания для обнаружения пектина во взаимодействии растений и грибков

Published: February 4, 2022 doi: 10.3791/63432
Automatic Translation
1, 2
1Faculty of Animal Science and Food Engineering, Department of Basic Sciences, University of São Paulo, 2Laboratory of Nuclear Instrumentation, Center of Nuclear Energy in Agriculture, University of São Paulo

Summary

Этот протокол описывает микроскопический метод обнаружения пектина во взаимодействии кофе-гриба.

Abstract

Растительные клетки используют различные структурные механизмы, конститутивные или индуцируемые, чтобы защитить себя от грибковой инфекции. Инкапсуляция является эффективным индуцируемым механизмом для выделения грибковой хаустории из протопласта растительных клеток. И наоборот, пектин, один из полимерных компонентов клеточной стенки, является мишенью нескольких пектолитических ферментов в некротрофных взаимодействиях. Здесь представлен протокол обнаружения пектина и грибковых гиф с помощью оптической микроскопии. Исследована богатая пектином инкапсуляция в клетках кофейных листьев, зараженных ржавчинным грибом Hemileia vastatrix , и модификация клеточной стенки мезофилла, индуцированная Cercospora coffeicola . Поврежденные образцы листьев фиксировали раствором Карновского, обезвоживали и внедряли в метакрилат гликоля в течение 2-4 дней. Все этапы сопровождались вакуумной накачкой для удаления воздуха в межклеточных пространствах и улучшения процесса встраивания. Встроенные блоки были разделены на участки толщиной 5-7 мкм, которые осаждались на стеклянной горке, покрытой водой, и впоследствии нагревались при 40 °C в течение 30 мин. Затем слайды были дважды окрашены 5% хлопкового синего цвета в лактофеноле для обнаружения грибка и 0,05% рутения красного в воде для обнаружения пектина (кислотные группы полиуроновых кислот пектина). Было обнаружено, что грибы Hemileia vastatrix инкапсулированы пектином. При кофейном церкоспориозе клетки мезофилла проявляли растворение клеточных стенок, наблюдались межклеточные гифы и конидиофоры. Метод, представленный здесь, эффективен для обнаружения пектин-ассоциированного ответа во взаимодействии растений и грибов.

Introduction

Защитные механизмы клеточной стенки в растениях имеют решающее значение для сдерживания грибковой инфекции. Исследования сообщали об изменениях в толщине и составе клеточной стенки с19-го века 1,2. Эти изменения могут быть вызваны грибковым патогеном, который стимулирует образование сосочки, который предотвращает попадание грибов в клетку, или может быть использован для инкапсуляции гиф, чтобы изолировать протопласт клетки-хозяина от грибковой хаустории. Производство динамического барьера клеточной стенки (т.е. сосочков и полностью заключенного хаусториума) важно для повышения устойчивости растений3. Гистопатологические исследования грибковых заболеваний исследовали возникновение этих механизмов и описали полимеры клеточной стенки, целлюлозу, гемицеллюлозу (арабиноксиланы) и мозолу как механизмы устойчивости к грибковой атаке 4,5,6,7.

Клеточная стенка является первым барьером против атаки микроорганизмов, ухудшая растительно-грибковое взаимодействие. Пектические полисахариды составляют клеточную стенку и составляют около 30% состава клеточной стенки в первичных клетках растений эвдикот, в которых гомогалактуроны являются наиболее распространенным полимером (примерно 60%)8. Гольджи секретирует сложные пектиновые соединения, которые содержат цепи галактуроновой кислоты, которые могут или не могут быть метилированы 8,9. С 2012 года в литературе отмечается, что степень метилэтерификации пектина имеет решающее значение для определения совместимости при заражении микробными пектическими ферментами 10,11,12. Таким образом, необходимы протоколы для проверки наличия и распределения пектиновых соединений в растительно-грибковых патосистемах.

Различные методы были использованы для обнаружения инкапсуляции сосочков или хаусторий. В качестве эталонных методов используются просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ) неподвижной ткани и световая микроскопия живых и неподвижных тканей. Что касается ТЕА, несколько исследований продемонстрировали структурную роль аппозиций клеточных стенок в грибковой резистентности 13,14,15,16, и что использование лектинов и антител является сложным методом обнаружения углеводных полимеров 16. Тем не менее, исследования показывают, что световая микроскопия является важным подходом и что гистохимические и иммуногистохимические инструменты позволяют лучше понять состав сосочков и хаусторий 6,7.

Патогенные грибы проявляют два основных типа образа жизни: биотрофный и некротрофный. Биотрофные грибы зависят от живых клеток для их питания, тогда как некротрофные грибы убивают клетки-хозяева, а затем живут в мертвых тканях17. В Латинской Америке ржавчина кофейных листьев, вызванная грибком Hemileia vastatrix, является важным заболеванием в кофейных культурах 18,19. Hemileia vastatrix представляет собой биотрофное поведение, и среди структурных изменений, наблюдаемых у устойчивых видов или сортов кофе, сообщалось о реакции гиперчувствительности, отложении каллозы, целлюлозы и лигнина на клеточных стенках, а также о гипертрофии клеток14. Насколько известно авторам, в литературе не сообщается информация о важности пектина в устойчивости кофе к ржавчине. С другой стороны, некротрофные грибы, которые вызывают церкоспориоз, нацелены на пектин через набор ферментов, связанных с деградацией клеточной стенки, таких как пектиназы и полигалактуроназа20. Церкоспориоз в кофе, вызванный грибком Cercospora coffeicola, также представляет серьезную угрозу для кофейных культур21,22. Этот гриб вызывает некротические поражения как в листьях, так и в ягодах. После проникновения C. coffeicola колонизирует растительные ткани по внутриклеточным и межклеточным путям 23,24,25.

Настоящий протокол исследует наличие грибковых структур и пектина на клеточных стенках. Этот протокол полезен для выявления реакции растений, связанной с пектином (окрашенным рутением красным красителем, который специфичен для кислотных групп полиуроновых кислот пектина), индуцированным хозяином при биотрофическом взаимодействии с грибом. Это также помогает проверить влияние некротрофных грибов на деградацию пектических клеточных стенок. Представленные результаты показывают, что метод двойного окрашивания эффективен для различения структур и репродуктивной фазы грибов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Приготовление буферного раствора и реагентов

  1. Приготовьте 2 М какодилатного буфера, добавив 4,28 г какодилата натрия к 100 мл дистиллированной воды и отрегулируйте рН до 7,25 с 0,2 N HCl.
  2. Готовят 100 мл карновского фиксаторного раствора путем смешивания 10 мл 25% водного глутарового альдегида, 10 мл 10% водного формальдегида, 25 мл 2 М какодилатного буфера и 0,5 мл 0,5 мл 0,5 М CaCl226. Восполнить объем до 100 мл дистиллированной водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор можно хранить в холодильнике в течение 6 месяцев.
    ВНИМАНИЕ: Буферный раствор какодилата токсичен; поэтому обрабатывайте фиксирующий раствор в вытяжке или на открытой площадке. Избегайте вдыхания паров раствора и носите перчатки во время обработки.
  3. Готовят водный питательный раствор Hoagland, смешивая следующее: 3 мМ Ca(NO3)2,4H 2O, 2 мМ NH4H2PO4, 5 мМ KH2PO4, 2 мМ MgSO4,7H 2O, 9,07 мМ MnSO4, 0,765 мМ ZnSO4,7H 2O, 46,4 мМ H3BO3, 0,09 мМ На2МоО 4. H2O, 0,01 мМ CuSO4 и 36 мМ FeSO 4,7H2O в виде железа-ЭДТА (этилендиамин тетрауксусной кислоты)27.

2. Образцы растений и посев грибка

ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов на листьях, пораженных кофейной ржавчиной, пять 2-месячных саженцев Coffee arabica cv. Катуаи выращивали и хранили в теплице в Центре ядерной энергии в сельском хозяйстве (CENA) Университета Сан-Паулу, Пирасикаба, штат Сан-Паулу, Бразилия.

  1. Выращивайте кофейные растения в пластиковых горшках объемом 500 мл, наполненных водным питательным раствором Hoagland (рН ~ 5,5), в течение 4 месяцев в камере роста, поддерживаемой при 27 ± 3 °C с 12-часовым фотопериодом, созданным светодиодными лампами при фотонном потоке фотонов 250 мкмоль s-1 м-2. Заменяйте питательный раствор Hoagland каждую неделю в течение 4 месяцев.
  2. Инокулируют четыре расширенных листа пяти растений на их абаксиальных поверхностях 1 х 103 H. vastatrix uredospores по способу, описанному в ссылке28. После прививки держите растения в течение 48 ч в темноте, накрыв их черным полиэтиленовым пакетом. Собирают урожай поражений через 30 дней после прививки.
  3. Урожай характерных поражений, вызванных Cercospora coffeicola от Coffea arabica cv. Заводы Obatã расположены (координаты: -22.906506126269942, -47.015075902025266) в Биологическом институте, Кампинас, штат Сан-Паулу, Бразилия. Перед обработкой образца проанализируйте повреждения в стереомикроскопе, чтобы убедиться в наличии кофе C. coffeicola conidia. Затем установите несколько слайдов с конидиями, чтобы подтвердить этиологию заболевания22.

3. Сбор проб, фиксация и обезвоживание

  1. Используя скальпель и пинцет, соберите ~10 мм2 образца листа в средней области поражения (желтые пятна; Рисунок 1) и погрузить его в 30 мл фиксаторного раствора Карновского (фиг.1 и фиг.2А). Этап фиксации может проходить в холодильнике в течение 48 ч.
  2. По меньшей мере четыре раза подвергайте образец листа низкому вакууму (500-600 мБар) с помощью масляного насоса в течение 15 мин каждый для повышения проницаемости фиксирующего раствора в ткани листа. Выполните этот шаг с поворотом образца (рисунок 1).
  3. После фиксации промыть образец листа три раза в 0,5 М какодилатного буфера (рН 7,2), разбавленном в дистиллированной воде в течение 5 мин каждый, а затем перенести его в градуированный этанольный ряд (30%, 50%, 70%, 90% (2x) и 100% (2x)) в течение 15 мин при каждой концентрации этанола (Фиг.1 и Фиг.2В).

4. Процедура встраивания гисторезина

  1. Постепенно переводите образцы на метакрилат гликоля (ГМА) в три этапа, следуя инструкциям производителя. Во-первых, делают раствор А, смешивая порошок ГМА (1 г) со 100 мл основной смолы (набор гисторезина; Таблица материалов) при магнитном перемешивании, а затем выполните следующие действия.
    1. Погружайте образцы в 1:2 Раствор А: 100% этанол в течение 3 ч.
    2. Погружайте образцы в 1:1 Раствор А: 100% этанол в течение 3 ч.
    3. Погрузите образцы в чистую основную смолу на 2-4 дня. На этом этапе подвергайте образцы низкому вакууму, по крайней мере, четыре раза в день в течение 15 минут с последующим вращением.

5. Полимеризация

ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс полимеризации требует 1,2 мл пластиковых форм, основной смолы и отвердителя (см. Таблицу материалов для деталей коммерческого комплекта).

  1. Смешайте 15 мл раствора А (стадия 4.1) с 1 мл отвердителя в стакане с вращением в течение 2 мин для получения раствора полимеризации (раствор В).
  2. Поместите 1,2 мл полимеризационного раствора (растворА В) в пластиковые формы. Используя деревянную кирку, перенесите поврежденные образцы листьев из чистой основной смолы в раствор B (рисунок 2C). Избегайте использования пинцета, так как он может вызвать раздавливание тканей.
  3. Обеспечьте быструю ориентацию образцов листьев перпендикулярно пластиковым формам, так как раствор В быстро становится вязким в течение 5 минут. Более одного поврежденного образца листа могут быть помещены в одну форму.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется практиковать вышеуказанный шаг несколько раз, прежде чем подавать заявку на многие образцы. Когда образцов много, время полимеризации отличается среди форм, и перпендикулярная ориентация образцов листьев может быть труднодостижимой.
  4. Когда перпендикулярная ориентация образцов листьев достигнута, подождите 30 минут, а затем перенесите пластиковую форму в пластиковую или стеклянную камеру, содержащую силикагель для предотвращения влажности. Подождите 2-3 ч для полимеризации.
  5. После того, как смола и образец листа полимеризуются после 2-3-часового периода, отделите полученный блок от пластиковой формы, отшлифовав основание блока шлифовальным файлом. Затем приклейте блок к куску дерева (рисунок 2D).

6. Секционирование

  1. Используя вращающийся микротом, оснащенный стальными лезвиями 8 см (рисунок 2E), разрежьте блок на участки толщиной 5 мкм. Поместите секции на стеклянные горки, покрытые дистиллированной водой. Перенесите горки с секциями, плавающими над водой, на конфорку при 40 °C для сушки и улучшения адгезии секций к стеклянным горкам.
  2. После высыхания (рисунок 2F) пометьте стеклянные слайды ссылочным именем блока и номером слайда.

7. Процесс двойного окрашивания

  1. Покрыть участки 2 мл 5% хлопкового синего цвета лактофенолом (40% глицерина, 20% фенола и 20% молочной кислоты в воде) и нагревать их на конфорке при 45 °C в течение 5 мин (рисунок 3A).
  2. Удалите избыток красителя, промыв горку три раза в стакане, наполненном дистиллированной водой (рисунок 3B-D).
  3. Окрашивание с 2 мл 0,01% рутения красного цвета в воде в течение 1 мин (Рисунок 3Е).
  4. Удалите избыток красителя, промыв горку три раза в стакане, наполненном дистиллированной водой (рисунок 3F, G).
  5. Нанесите каплю дистиллированной воды на секции и накройте секции крышкой размером 24 мм x 60 мм для проведения анализа световой микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Окрашивание лактофенола хлопкового синего цвета на секции, встроенной в GMA, выявило наличие нескольких грибковых структур между клетками кофейного мезофилла и внутри них как в биотрофных, так и в некротрофных грибковых взаимодействиях.

В биотрофической патосистеме при окрашивании методом двойного окрашивания гифы Hemileia vastatrix, содержащие клеточные стенки и плотное содержание протопласта, появляются темно-синим цветом как в губчатой, так и в частоколовой паренхиме (рисунок 4A,B). Материнская клетка хаусториума (Hmc) и хаустория также имеют сильный темно-синий цвет (рисунок 4C). При контрокрашении рутением красного цвета распределение грибов в межклеточных пространствах четко определено (рисунок 4D). Наличие темно-синего Hmc помогает обнаружить инфекционную зону. Во время взаимодействия H. vastatrix Hmc сломал клеточную стенку хозяина и развил хаусториальную шейку, которая могла быть окружена пектическими соединениями (рисунок 4E, F). Тем не менее, богатая пектинами инкапсуляция (розово-красный цвет) гаусториальной шейки не способна предотвратить гаусториальное образование (рисунок 4E,F). В некоторых случаях богатая пектинами инкапсуляция заключает хаусторий неполный (рисунок 4G), а в некоторых случаях гаустория полностью инкапсулирована (рисунок 4H).

В некротрофном взаимодействии протокол двойного окрашивания также был полезен для проверки взаимодействия Cercospora coffeicola с тканями кофейного мезофилла. На границе поражения, где грибок отсутствует, богатая пектинами клеточная стенка сохранила свою целостность (рисунок 5А). Метод двойного окрашивания продемонстрировал наличие межклеточных гиф (рисунок 5B,C). В зонах взаимодействия пектиновые клеточные стенки, по-видимому, теряли свою целостность из-за растворения (рисунок 5B,C). Репродуктивные структуры, такие как конидиофор, были обнаружены в адаксиальном эпидермисе (рисунок 5D). В субстоматической камере C. coffeicola hyphae были обнаружены в виде скручивающихся структур. Паренхима частокола в пораженной области, по-видимому, подвергается лизису клеточной стенки (рисунок 5E).

Figure 1
Рисунок 1: Подробная информация об отдельных шагах в протоколе по сбору поврежденных тканей. Заготовьте кусочек поражения скальпелем и пинцетом. Погрузите образцы листьев в фиксирующий раствор. Подвергайте образцы вакуумной перекачке и вращению. Следуйте протоколу для процессов обезвоживания и встраивания. Полимеризованный образец секционируется во вращающемся микротоме. Слайды с участками поражения монтируются и окрашиваются для проверки грибковых гиф и богатых пектином клеточных стенок с использованием метода двойного окрашивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Подробная информация об отдельных этапах секции образца перед двойным окрашиванием. (A) Этап фиксации. B) обезвоживание в градуированных сериях этанола; ткань листа инкубируют в этаноле в течение 15 мин при каждой концентрации. (C) Полимеризация внутри пластиковой формы. (D) Блок полимеризованного образца, приклеенный к куску дерева. (E) Древесно-клееный блок, расположенный на микротоме для процесса секционирования. (F) Участки тканей на слайде (обозначенные стрелками). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Подробная информация об отдельных шагах протокола двойного окрашивания. (A) Накройте секции каплями лактофенола хлопкового синего цвета и нагрейте слайды на конфорке при температуре 45 °C. (B-C) Удалите избыток красителя путем промывки в дистиллированной воде. (D) Секции на стеклянных слайдах после стирки (обозначаются стрелками). (E) Покрыть секции каплями рутения красного цвета. (Ф-Г) Удалите избыток красителя, промыв в дистиллированной воде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Гистохимический протокол двойного окрашивания пектина и грибковых структур при поражении кофейной ржавчины. (А-С) Участки окрашивают только хлопковым синим лактофенолом. Грибковые гифы окрашены в темно-синий цвет (стрелки). Материнская клетка хаусториума (Hmc) и хаусториум (Ha) имеют темно-синий цвет. (Д-Н) Двойное окрашивание с использованием хлопкового синего лактофенола и рутения красного. (D) Обзор пустулы (Pu) на листе. (Е-Ф) Хаусториальная шея (стрелки) с пектином (розово-красного цвета). (G) Стрелки указывают на начало богатой пектинами инкапсуляции гаусториума. (H) Полная инкапсуляция хаусториума пектином (стрелками). Эпи Аба - Эпидермис абаксиальный; Эпи Ада - Эпидермис адаксиальный; Sp - Губчатая паренхима; Pp - частокол паренхимы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Гистохимический протокол двойного окрашивания пектиновых и грибковых структур при поражениях церкоспориоза в тканях кофейного мезофилла. (A) Граница поражения без грибков. (Б-Ф) Поперечные сечения пораженного листа. (А) Целостность богатых пектином клеточных стенок губчатой паренхимы. (Б-Д,Ф) В инфицированных тканях были очевидны гифы Cercospora coffeicola (стрелы) и вызывали повреждение пектических клеточных стенок. Удалось проверить конидиофор под кутикулой (КТ) (D). Эпи Аба - Эпидермис абаксиальный; Эпи Ада - Эпидермис адаксиальный; Sp - Губчатая паренхима; pp - частокол паренхимы; Св - Стомата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Настоящая работа вводит альтернативный гистохимический тест двойного окрашивания для исследования пектинового состава клеточных стенок, который инкапсулирует гаусторию в биотрофическую патосистему. Целью также является демонстрация эффективности метода обнаружения некротрофного грибка и вызванных им изменений клеточной стенки. Здесь пектин клеточных стенок кофейной паренхимы может инкапсулировать как шейку, так и хаусториум ржавого гриба Hemileia vastatrix. Silva et al. также описали инкапсуляцию целлюлозой и каллозой в патосистеме кофе-H. vastatrix 14,29. Среди полимеров клеточной стенки, связанных с защитными механизмами, пектин играет важную роль в растительно-патогенной системе 10,11,12. Поэтому знание пектиновых функций имеет большую гистопатологическую ценность.

Церкоспориоз в кофе, вызванный Cercospora coffeicola, повреждает ткани листьев и в конечном итоге приводит к гибели клеток. Эти симптомы в основном вызваны активностью церкоспорина и ферментов, разрушающих клеточную стенку20. Исследования с использованием рутения красного продемонстрировали потерю целостности клеточной стенки, аналогично предыдущему исследованию листьев хурмы, инфицированных Pseudocercospora kaki30. Гистопатологический анализ с использованием метода двойного окрашивания продемонстрировал наличие грибковых гиф и этот анализ эффективен для обнаружения грибковых гиф в межклеточных пространствах. Альтернативно, сканирующая электронная микроскопия (SEM) показала эффективность наблюдения C. coffeicola hyphae25; однако наличие такого сложного оборудования, наряду с кропотливой работой по пробоподготовке, является ограничивающим фактором. Более того, анализ SEM не позволяет химически распознавать пектин в клеточных стенках. И наоборот, двойное окрашивание является важным методом обнаружения изменений пектина. Однако описанный здесь способ имеет ограничение в отношении разрешающей способности световой микроскопии, что не позволяет увеличить детализацию ультраструктуры растительно-грибкового взаимодействия. Кроме того, метод двойного окрашивания, представленный здесь, не является специфическим для обнаружения грибковых видов, и поэтому должны быть проведены дополнительные молекулярные эссе.

Подготовка образцов осуществляется в соответствии с обычными протоколами в анатомии растений; однако некоторые моменты требуют особого внимания. Например, фиксация является критическим шагом. Размер образцов и осторожность при их сборе необходимы для хорошей фиксации. Время, температура, рН и осмолярность имеют решающее значение для растительных тканей31. Поврежденные ткани листьев являются воздушными органами и должны подвергаться мягкому вакууму для улучшения фиксации. Применение метакрилата гликоля (ГМА) требует этанола в качестве растворителя для обезвоживания; ткани, которые не обезвожены должным образом, могут представлять трудности во время процесса встраивания. Это состояние ухудшается, когда растительные ткани имеют много фенольных соединений, как в случае с кофейными листьями. Кроме того, важно иметь дело с небольшими частями тканей; в противном случае требуются альтернативные методы внедрения32.

Метод двойного окрашивания, представленный здесь, является адаптацией протокола, о котором сообщает Marques et al.33. В этом протоколе авторы использовали хлопчатобумажный синий (5%) и 1% сафранин для различения грибковых структур и клеточных стенок растений. Методика была полезна для обнаружения присутствия грибка в различных патосистемах, таких как Colletotrichum acutatum-цитрусовые лепестки и Guignardia citricarpa-цитрусовые фрукты 33Plasmodiophora brassicae в Arabidopsis thaliana34, Elsinoë ampelina в Vitis labrusca35 и другие. Недавно Маркес и Соареш36составили серию микроскопических методов, включая методы света и флуоресценции, чтобы различать растительные и грибковые особенности37. Однако в некоторых регионах или странах, таких как Бразилия, флуоресцентные микроскопы и SEM могут быть недоступны; поэтому использование световых микроскопов является важной и более дешевой альтернативой исследованиям и даже дидактическим методам, используемым в университетах и средних школах. Грибковые гифы были микроскопически обнаружены как в тканях растений, так и животных красителем хлопкового синего цвета 36,38,39,40. Это связано с положительной реакцией красителя на богатую хитином грибковую стенку40. Формула хлопкового синего цвета включает лактофенол, который представляет собой раствор, который действует как растворитель для ткани41, тем самым сохраняя грибковую структуру при смешивании с хлопковым синим. 

Здесь 0,05% рутения красного цвета было использовано для замены сафранина. Положительным аспектом, представленным в этом исследовании, является то, что пектин, специфический полимер клеточной стенки, был окрашен для предоставления важных качественных данных. Рутений красный является реагентом, используемым для обнаружения кислотных групп пектиновых полиуроновых кислот 42,43,44. Он специфичен для пектина и не окрашивает другие углеводные компоненты клеточной стенки (например, целлюлозу или каллозу). Цепи галактуроновых кислот, расположенные в различных структурных и биохимических основах, составляют пектин 8,9,45. Реакционная способность рутения красного к клеточной стенке зависит от степени метилэтерификации11. Степень метилэтерификации зависит от активности пектинметилэстераз (ПМЭ), и, таким образом, рутений красный также использовался в качестве инструмента для распознавания активности PME11.

Таким образом, метод двойного окрашивания, описанный здесь, является полезным инструментом для проверки модификаций пектина во взаимодействиях растений и грибов. Насколько известно авторам, это первое сообщение о пектине в хаусториальной инкапсуляции грибов кофейной ржавчины. Интересно, что метод двойного окрашивания также был важен для наблюдения за грибковыми структурами, для описания повреждений, нанесенных богатой пектином клеточной стенке, и для проверки грибковых репродуктивных структур. Дальнейшие гистопатологические исследования ржавчин, антракноза, церкоспориоза, головни и других биотрофических, гемибиотрофных и некротрофных растительно-грибковых взаимодействий должны быть проведены для изучения потенциального использования этого метода в различных патосистемах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Хадсона В.. де Карвалью за поддержку в разработке этой работы. Авторы также благодарны Лаборатории электронной микроскопии «Профессор Эллиот Ватанабэ Китадзима» за предоставление оборудования для световой микроскопии. Авторы благодарят доктора Флавию Родригеса Алвеса Патрисио за то, что он снабдил растительный материал повреждениями.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blades DB80 HS Leica 14035838383 Sectioning
Cacodylate buffer EMS # 11652 Fixation
Cotton Blue Lactophenol Metaquímica 70SOLSIG024629 Staining
Formaldehyde EMS #15712 Fixation
Glutaraldehyde EMS #16216 Fixation
Historesin Kit Technovit /EMS #14653 Historesin for embedding
Hot plate Dubesser SSCD25X30-110V Staining
Microscopy Zeiss #490040-0030-000 Image capture
Microtome (Leica RM 2540) Leica 149BIO000C1 14050238005 Sectioning
Plastic molding cup tray EMS 10176-30 Staining
Ruthenium red LABHouse #006004 Staining
Software Axion Vision Zeiss #410130-0909-000 Image capture
Vaccum pump Prismatec 131 TIPO 2 V.C. Fixation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5 (1863).
  2. Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).
  3. Underwood, W. The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion. Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).
  4. Hückelhoven, R. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility. Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).
  5. Voigt, C. A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).
  6. Chowdhury, J., et al. Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei. New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).
  7. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).
  8. Caffall, K. H., Mohnen, D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).
  9. Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. , Wiley Blackwell. New York. 45 (2015).
  10. Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases. Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).
  11. Lionetti, V. Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses. Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).
  12. Lionetti, V., et al. Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis. Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).
  13. Heath, M. C. Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection. Phytopathology. 61, 383-388 (1971).
  14. Silva, M. C., et al. Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).
  15. An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress. Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).
  16. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus. Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).
  17. Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits. Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).
  18. Avelino, J., et al. The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions. Food Security. 7, 303-321 (2015).
  19. Zambolim, L. Current status and management of coffee leaf rust in Brazil. Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).
  20. Swiderska-Burek, U., et al. Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555 (2020).
  21. Andrade, C. C. L., et al. Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves. Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).
  22. Zambolim, L. Coffee tree diseases. Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , Agronômica Ceres Santana (in Portuguese). São Paulo. 810 (2016).
  23. Castaño, A. J. J. Coffee rust. Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).
  24. Echandi, E. Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola. Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).
  25. Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf. Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).
  26. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  27. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , University of California. Berkeley, California. 347 (1950).
  28. Eskes, A. B. Resistance. Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, Boca Raton. 171 (1989).
  29. Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III). International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).
  30. Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves. Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).
  31. Hayat, M. A. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. , International Publishing. Berkeley Heights. 564 (1981).
  32. Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T. Large plant samples: how to process for GMA embedding. Light microscopy: methods and protocols. Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. 689, Humana Press. 37-49 (2011).
  33. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. New staining technique for fungal-infected plant tissues. Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).
  34. Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
  35. Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate. Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517 (2020).
  36. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. Piracicaba, F. E. A. L. Q. , Santana. in Portuguese 140 (2021).
  37. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).
  38. Chesters, C. G. C. Three methods of using cotton blue as a mycological stain. Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).
  39. Macedo, N. A. Manual of Techniques in Plant Histology. Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , in Portuguese 68 (1997).
  40. Lecker, A. Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health Journal. 12 (30), 24 (1999).
  41. Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. Lactic acid in wool dyeing. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103 (1895).
  42. Chamberlain, C. J. Methods in Plant Histology. , The University of Chicago Press. Chicago. 349 (1932).
  43. Sterling, C. Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain. American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).
  44. Luft, J. H. Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action. The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).
  45. Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A. Cell Wall. Plant Physiology. Kerbauy, G. B. , Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. in Portuguese 165-181 (2013).

Tags

Биология Выпуск 180 Кофе грибы хаусториум гистохимия пектин микроскопия
Метод двойного окрашивания для обнаружения пектина во взаимодействии растений и грибков
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G.… More

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G. Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction. J. Vis. Exp. (180), e63432, doi:10.3791/63432 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter