Bu protokol, üç farklı sferoid tipinin üretimi için bir yöntemi, onları büyük ölçekli yüksek içerikli tarama ve analiz için uygun hale getirecek şekilde detaylandırmaktadır. Ek olarak, küresel ve bireysel hücre seviyelerinde nasıl analiz edilebileceğini gösteren örnekler sunulmaktadır.
Yüksek içerikli tarama (HCS) ve yüksek içerikli analiz (HCA), araştırmacılara hücrelerden büyük ölçekli nicel fenotipik ölçümler çıkarma yeteneği sağlayan teknolojilerdir. Bu yaklaşım, hücre biyolojisindeki çok çeşitli temel ve uygulamalı olaylar hakkındaki anlayışımızı derinleştirmek için güçlü olduğunu kanıtlamıştır. Bugüne kadar, bu teknoloji için uygulamaların çoğu, tek katmanlı olarak yetiştirilen hücrelerin kullanımına dayanıyordu, ancak bu tür modellerin dokularda meydana gelen etkileşimlerin ve süreçlerin çoğunu özetlemediği giderek daha fazla fark ediliyor. Bu nedenle, sferoidler ve organoidler gibi 3 boyutlu (3B) hücre gruplarının geliştirilmesinde ve kullanımında bir ortaya çıkmıştır. Bu 3D modeller kanser biyolojisi ve ilaç dağıtım çalışmaları bağlamında özellikle güçlü olmasına rağmen, HCS ve HCA için uygun tekrarlanabilir bir şekilde üretim ve analizleri bir takım zorluklar ortaya koymaktadır. Burada detaylandırılan protokol, çok hücreli tümör sferoidlerinin (MCTS) üretilmesi için bir yöntemi açıklamakta ve HCS ve HCA ile uyumlu bir şekilde üç farklı hücre hattına uygulanabileceğini göstermektedir. Yöntem, kuyu başına birkaç yüz sferoid üretimini kolaylaştırır ve bir tarama rejiminde kullanıldığında, hepsi aynı şekilde muamele edilen kuyu başına birkaç yüz yapıdan veri elde edilebilmesi için özel bir avantaj sağlar. Yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme için sferoidlerin nasıl işleneceğini ve HCA’nın hem sferoid seviyesinde hem de her bir sferoid içindeki bireysel hücrelerden nicel özellikleri nasıl çıkarabileceğini ayrıntılarıyla anlatan örnekler de verilmiştir. Bu protokol, hücre biyolojisindeki çok çeşitli önemli soruları cevaplamak için kolayca uygulanabilir.
Geleneksel olarak, hücre bazlı tahliller, etkili bir şekilde iki boyutlu (2D) bir ortam olarak kabul edilebilecek katı bir substrat üzerinde büyüyen tek katmanlı olarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, 2B hücre kültürü modellerinin bazı bağlamlarda fizyolojik alaka düzeyinden yoksun olduğu ve hücreler arasında meydana gelen karmaşık etkileşimlerin çoğunu kopyalayamadığı giderek daha fazla kabul edilmektedir1. Üç boyutlu (3D) hücre kültürü yöntemleri araştırmacılar arasında hızla popüler hale gelmektedir ve 3D hücre modelleri, doku ortamında hücrelerin karşılaştığı fizyolojik koşulları daha iyi taklit etmek için yüksek potansiyel göstermektedir2. Kullanılan birkaç farklı 3D hücre derlemesi türü vardır, ancak en yaygın iki tip sferoidler ve organoidlerdir. Sferoidler birçok farklı hücre hattından yetiştirilebilir ve kullanılan hücre tipine ve montaj yöntemlerine bağlı olarak çeşitli şekil ve boyutlar benimseyebilirler3. Dahası, sferoidler, kanser hücre hatlarından yetiştirildiklerinde çok hücreli tümör sferoidleri (MCTS) olarak da adlandırılabilir ve bu modeller preklinik in vitro ilaç dağıtımı ve toksisite çalışmaları için özel bir kullanım alanı bulmuştur4,5. Öte yandan organoidler, vücudumuzdaki dokuları ve organları daha iyi taklit etmeyi amaçlar ve daha karmaşık morfolojik düzenlemeleri benimseyebilirler. Organoidlerin üretimi, yetişkin kök hücrelerin veya pluripotent kök hücrelerin kullanılmasını içerir; bunlar, ilgilenilen doku veya organa benzemek için uygun hücrelere yeniden programlanabilir. Öncelikle organların gelişimini araştırmak ve hastalıkları ve konakçı-patojen etkileşimlerini modellemek için kullanılırlar6.
3B hücre derlemeleri oluşturmak için kullanılan bir dizi farklı yöntem vardır. İskele tabanlı yöntemler, hücrelerin içinde bağlanabileceği veya büyüyebileceği bir substrat veya destek sağlar. Bu iskeleler çeşitli şekillerde olabilir ve çeşitli malzemelerden yapılabilir. En yaygın olanları hücre dışı matriks (ECM) bileşenleri ve hidrojellerdir ve hücrelerin doğal hücre dışı ortamına benzeyecek ve böylece fizyolojik etkileşimleri kolaylaştıracak şekilde tasarlanmıştır4,7. ECM bodrum materyali Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu tümöründen ekstrakte edilmiş ve laminin, tip IV kollajen ve perlecan8 dahil olmak üzere zengin bir ECM bileşenleri karışımı içerdiği gösterilmiştir. Bununla birlikte, avantajlı bileşimine rağmen, kullanımıyla ilgili iki ana zorluk vardır: partiden partiye değişkenliği ve 10 ° C8,9’un altında ve üstünde iki farklı agrega durumuna sahip olması. Buna karşılık, hidrojeller bileşenlerine ve sertliklerine göre esnek olma avantajına sahiptir ve istenen belirli 3D hücre düzeneğine uyacak şekilde özelleştirilebilirler7,10. İskele bazlı yöntemler organoid büyüme için gereklidir, ancak aynı zamanda sferoidler için de yaygın olarak kullanılmaktadır. Hücrelerin büyüdükleri yüzeye yapışmasını engelleyerek çalışan iskelesiz yöntemler, genellikle sadece küresel montaj ile uyumludur. Örnekler arasında, hücrelerin sferoidlere toplanmasına izin veren düz tabanlı veya U-dipli ultra düşük bağlantı (ULA) plakaları veya iplikçik/rotasyon şişelerinde hücrelerin sürekli ajitasyonunun kullanılması sayılabilir10.
Çok çeşitli biyolojik olayları incelemek için 3D hücre montajlarının kullanımı hızla popülerlik kazanmaktadır; ancak, kültürleri için seçilen yöntemin, aşağı akış analizleri için planlara uygun ve uyumlu olması esastır. Örneğin, ULA plakalarının kullanımı yüksek tutarlılığa sahip sferoidler üretir; Bununla birlikte, bu yöntem kuyu başına tek bir sferoid üretimi ile sınırlıdır, böylece verim sınırlandırılır. 3D yapının floresan görüntülemesi planlanırken özellikle dikkat edilmesi gerekir. Montajın yetiştirildiği alt tabaka veya plaka optik olarak uyumlu olmalı ve kullanılmış olabilecek iskelelerin neden olduğu ışık saçılmasının etkilerini en aza indirmek için özen gösterilmelidir11. Bu özel sorun, mikroskop objektif lenslerinin sayısal açıklığı arttıkça daha akut hale gelir.
Muhtemelen bir 3B hücre modeliyle çalışmayı seçmenin en önemli nedenlerinden biri, yalnızca tüm montaj hakkında değil, aynı zamanda içindeki tek tek hücreler hakkında hacimsel görüntüleme verilerini çıkarmaktır. Özellikle MCTS modelleri, terapötiklerin dışarıdan merkezi hücrelere (bir tümörde ihtiyaç duyacakları gibi) nasıl geçtiğine dair anlayışımızı derinleştirmek için çok güçlü olduğunu kanıtlamaya başlıyor12 ve bu nedenle farklı katmanlardaki bireysel hücrelerden bilgi edinmek çok önemlidir. Tek tek hücrelerden kantitatif bilgileri çıkaran görüntüleme teknolojisi, yüksek içerikli analiz (HCA) olarak adlandırılır ve tarama bağlamında güçlü bir yaklaşımdır13. Bugüne kadar, HCA neredeyse sadece tek katmanlı kültürlere uygulanmıştır, ancak bu yaklaşımın çok çeşitli hücresel fonksiyonların ve süreçlerin incelenmesini sağlayan 3B kültürlere uygulanma gücüne sahip olduğunun giderek daha fazla farkına varılmıştır14. Çok sayıda 3B montajın analiz edilebilmesi ve potansiyel olarak her yapının içinden hücre düzeyinde veri sağlaması açık bir avantaja sahip olacaktır. Bununla birlikte, potansiyel olarak kalın hücre gruplarının görüntülenmesi ve oluşturulan büyük veri kümelerinin görüntülenmesiyle ilgili zorlukların üstesinden gelinmesi gerekir.
Bu makalede, MCTS’nin 96 kuyucuklu bir formatta büyük ölçekli üretimi için sağlam bir iskele tabanlı yöntem sunulmuştur. Yöntem, her kuyucukta birkaç yüz 3D hücre düzeneğinin üretimini kolaylaştırır. Karaciğer, akciğer ve kolonun katı tümör modellerini temsil eden üç farklı hücre tipi için örnekler gösterilmiştir. Oluşan sferoidler çeşitli boyutlarda olabilir ve bu nedenle HCA, belirli bir boyuttaki ve / veya morfolojideki yapıları seçmek için kullanılır. Bu özellik, gözlemlenen herhangi bir fenotipin farklı boyutlardaki sferoidler arasında karşılaştırılabilmesi, ancak hepsinin aynı kuyuda aynı şekilde muamele görmesi için ek avantaj sağlar. Bu yaklaşım, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile uyumludur, daha da önemlisi, aynı hücresel gruplardan hem hücre düzeyinde hem de hücre altı düzeyinde nicel veriler sağlar. Bu sferoid üretim yöntemi, kuyu başına tek bir sferoid üreten yöntemlere göre ek bir avantaja sahiptir, her bir kuyuda üretilen çok sayıda sferoid, transkriptom ve proteom profillemesi gibi diğer aşağı akış analizleri için potansiyel olarak yeterli biyokütle sağlar.
Burada açıklanan yaklaşım, HCS ve HCA için uygun bir şekilde kuyu başına birkaç yüz sferoid üretmek için bir platformu detaylandırmaktadır. Kuyu başına sadece bir sferoid oluşumuna izin veren düz tabanlı ve yuvarlak tabanlı ULA plakalarının kullanımı gibi diğer popüler yöntemlerle karşılaştırıldığında18,19, bu yöntem yüksek çözünürlüklü bilgilerin çok sayıda sferoidden bir tarama formatında çıkarılmasına olanak sa…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) tarafından JCS’ye verilen altyapı araştırma hibesinin desteğini kabul etmektedir. UCD Hücre Tarama Laboratuvarı’ndaki çalışmalar UCD Bilim Koleji tarafından desteklenmektedir. ASC, İrlanda Araştırma Konseyi (IRC) İrlanda Hükümeti Lisansüstü Bursu (GOIPG / 2019/68) tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar ayrıca laboratuvarın tüm üyelerine katkıları ve yararlı tartışmaları için teşekkür eder. Şekil 1’deki resim BioRender’da oluşturulmuştur.
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |