Summary
Denne protokol beskriver en enkel og effektiv metode til indsamling af blod fra den subklaviske vene hos rotter. Det muliggør hurtig, rettidig og let identificerbar prøveudtagning uden bedøvelse og opnår blod af høj kvalitet gennem gentagen prøveindsamling.
Abstract
Rotter anvendes i vid udstrækning i farmakokinetiske (PK) og toksikokinetiske (TK) undersøgelser, der skal indsamle en vis mængde blod på bestemte tidspunkter for at detektere lægemiddeleksponering. Rotteblodprøvetagningsmetoden bestemmer plasmaets kvalitet og påvirker yderligere præcisionen af testresultaterne. Den subklaviske veneblodindsamlingsmetode, der er beskrevet i denne protokol, indsamler blodprøver gentagne gange i dyrs bevidste tilstand for at imødekomme behovene hos PK- og TK-test. Færdighederne i fastholdelseshåndtering og passende procedure for nålesnit sikrer succesraten for blodindsamling. Det er let at betjene, samtidig med at plasmakvaliteten sikres, og samtidig tages der hensyn til dyrevelfærd. Denne metode kræver dog dygtig betjening, og en forkert metode kan forårsage svaghed hos dyr, smerte, halthed og endda dødelighed. Den nuværende metode er blevet anvendt i testfaciliteten til et 4-ugers oralt toksicitetsstudie i Sprague Dawley (SD) rotter med TK. Den maksimale mængde blod indsamlet inden for 24 timer oversteg ikke 20% af dyrets samlede blod. Dyrenes kropsvægt var mere end 200 g for mænd og kvinder. Dataene viste, at dyrenes kropsvægt steg støt hver uge, og den kliniske observation var normal efter gentagen prøveindsamling.
Introduction
Ifølgeretningslinjerne fra International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) 1 og National Medical Products Administration (NMPA) guidelines2 skal antallet af tidspunkter for indsamling af blod fra rotter i den toksikokinetiske undersøgelse (TK) opfylde kravene i den dynamiske lægemiddeleksponeringsvurdering. Det omtrentlige totale blodvolumen af en rotte er 55-70 ml / kg legemsvægt3. Opsamlingstidspunkterne er generelt intensive inden for 30 minutter efter dosering og falder derefter, og mere end ti blodprøver skal indsamles inden for 48 timer i rutinemæssig test4. For eksempel indsamles blodprøver på 12-tidspunkter (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 time, 2 h, 3 timer, 4 timer, 8 timer og 12 timer) i TK-undersøgelse af oralt administrerede lægemidler. Forskere skal gentagne gange indsamle 200-250 μL blod i rotter for at opnå plasma af høj kvalitet til TK-testen5.
Blodindsamlingsstederne hos rotter omfatter haleblodkar, retro-orbital plexusvene, submandibulær vene, hjerte, abdominal aorta6 og så videre. Blandt dem er blodindsamling fra den kaudale vene hos rotter en hyppigt anvendt metode, som kræver erfarne og dygtige operatører 7,8. At indsamle blod fra retro-orbital plexusvenen er mindre kompliceret; Denne metode anbefales dog ikke, da den kan skade rotternes syn9, og blod fra hjertet og abdominal aorta er kun egnet til endelig blodprøvetagning10. En anden metode til indsamling af blod fra den submandibulære vene hos en bevidst rotte har vist sig at resultere i flere komplikationer og afslørede utilstrækkelig blodprøvekvalitet11. Derfor kan forskere bedøve dyret for at reducere vanskeligheden ved prøveudtagning. Alligevel øger anæstesien også omkostningerne ved eksperimentet, og mere alvorligt vil det påvirke metabolisk tilstand hos rotter12. Denne protokol bruger en hurtig og ligetil metode til indsamling af blod i de subklaviske vener hos rotter uden bedøvelse, hvilket muliggør nøjagtig positionering og bilateral alternerende blodindsamling for at opnå prøver af høj kvalitet rettidigt og gentaget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. Mandlige og kvindelige Sprague Dawley (SD) rotter, ~ 6-11 uger blev brugt til forsøgene. Rotterne blev opdrættet efter retningslinjerne for pasning og brug af forsøgsdyr13.
1. Tilberedning af dyr
BEMÆRK: Alle SD-rotter, der blev brugt i denne undersøgelse, var vågne og blev ikke bedøvet / aflivet. Evnen til fastholdelseshåndtering ved at gribe fat i huden på dyrets ryg er nødvendig.
- Find det laveste punkt i den subklaviske trekantede fossa mellem nakken og forbenet i en rotte. Bevæg ~ 2-3 mm mod hovedet og nå nålepunktet på blodindsamlingsstedet (figur 1). Fjern hårene ved hjælp af en elektrisk barbermaskine.
BEMÆRK: Afhængigt af forsøgsbehovene kan serum eller plasma være påkrævet. Plasma er taget som et eksempel i denne protokol, og det vil ikke påvirke driften af blodindsamling. - Forbered vatpinde farvet med 75% alkohol til aftørring og desinfektion og tørre vatpinde til aftørring.
2. Prøveudtagning af blod
BEMÆRK: Mindst 2 personer, som begge skal have erfaring med blodindsamling og rottefastholdelsesteknikker, skal udføre disse trin.
- Tag fat i huden på nakken med den ene hånd for at holde rottens hoved, hals og bryst oprejst og blotlægge injektionsstedet (video 1). Ret forbenet på siden af injektionsstedet for at opretholde dets niveau.
- Hold sprøjten parallelt med rottens hoved med den anden hånd og vip sprøjten udad 5°-10°, så spidsen vippes mod ventral retning.
- Indsæt nålen helt ind i det forreste hulrum. Træk sprøjten tilbage for at opretholde undertrykket i tuben.
- Flyt langsomt nålen fra dybt til lavt og tilbage op ad samme sti. Når blod er kommet ind i kanylen, skal nålens position fastgøres (video 2).
BEMÆRK: Blodet vil derefter blive fyldt med en konstant hastighed i sprøjten, som vist i figur 2A (set forfra) og figur 2B (set fra siden). - Overvåg den maksimale blodmængde i overensstemmelse med de standarder, der er fastsat af institutionens udvalg for dyrepleje og brug. Dette afhænger af dyrets vægt og sundhed. I mangel af andre krav må du ikke fjerne mere end 20% af dyrets samlede blodvolumen inden for 24 timer, hvilket kræver ~ 3 ugers rekreation14.
- Når der er taget tilstrækkelig blodprøve, skal du straks trække sprøjten ud og forberede blodbehandlingen (trin 3).
- Tryk på rottens injektionssted i ~1-2 minutter for at stoppe blødningen. Da opsamlingsstedet er i den nederste del af nakken, skal du klemme huden på den subklaviske vene for at stoppe blødningen ved at trykke på den (figur 3).
BEMÆRK: Blod kan indsamles skiftevis fra den bilaterale subklaviske vene, når gentagen blodindsamling er nødvendig. - Sæt rotten tilbage i buret og observer dens tilstand.
3. Behandling af blodprøven
- Fjern kanylen fra sprøjten og kassér den i den skarpe værktøjsbeholder. Overfør langsomt blodet fra sprøjten til et 1,5 ml rør. Tryk sprøjten mod væggen for at undgå eventuelle bobledannelser.
BEMÆRK: Da tryk kan få røde blodlegemer til at briste, skal nålen fjernes for at forhindre hæmolyse14. - Dæk mikrocentrifugerøret, svip det forsigtigt, og vend det på hovedet mindst fem gange for grundigt at blande blodet med antikoagulanten.
- Hele blodprøven centrifugeres ved 2000 x g i ~10-15 minutter ved stuetemperatur inden for 120 minutter efter opsamling af plasmaet.
- Brug en pipettepistol (se materialetabel) til at overføre det øvre plasma til et tomt mikrocentrifugerør. Rør ikke ved pipettehovedet med det nedre fuldblod. Bortskaf eller centrifuger plasmaet, der er forurenet med de røde blodlegemer.
- Prøverne anvendes straks, eller de opbevares ved -30 °C.
BEMÆRK: Lægemidlets egenskaber bestemmer opbevaringstiden. Plasmaprøverne opnået fra den subklaviske vene er gennemskinnelige og lysegule. Hæmolyse kan gøre plasmaet rødt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gode plasmaprøver fra den subklaviske vene var gennemskinnelige lysegule (figur 4, venstre rør). Forkert blodindsamling eller manipulation resulterede i hæmolyse (figur 4, højre rør).
Data fra testfaciliteten viste, at i en 4-ugers oral toksicitetsundersøgelse af en øjendråbe hos SD-rotter med TK blev blodprøver indsamlet to gange på 9-tidspunkter (0 timer, 0,167 timer, 0,5 timer, 1 time, 2 timer, 4 timer, 8 timer, 12 timer og 24 timer) mellem den første (dag 1) og den sidste doseringsdag (dag 28). Doseringen for TKB-, TKC- og TKD-rotterne var henholdsvis 10 mg/kg, 30 mg/kg og 100 mg/kg, og doseringsvolumenet var 10 ml/kg. Blodindsamlingsvolumenet af den første prøveudtagning var ~ 0,2 ml, dyrets alder var ~ 6-7 uger, handyrets kropsvægt var ~ 268-297 g, og hunnens var ~ 214-239 g. Blodvolumenet af den sidste prøveudtagning var ~ 0,3 ml, dyrets alder var ~ 10-11 uger, handyrets kropsvægt var ~ 376-462 g, og hundyrets kropsvægt var ~ 254-300 g. Der var et interval på 28 dage mellem de to tidspunkter for TK-blodindsamling. Dyrenes kropsvægt steg støt hver uge, og den kliniske observation var normal. Den samlede mængde blod fra en 250 g rotte er ca. 16 ml15, og den maksimale mængde blod indsamlet inden for 24 timer oversteg ikke 20% af dyrets samlede blod. Kropsvægtdataene for hundyr er vist i tabel 1, og data for handyr er vist i tabel 2.
Figur 1: Afbildning af nålepunktet på blodindsamlingsstedet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Blodekstraktionsproces. Blodet blev opnået glat. (A) Set forfra. (B) Set fra siden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentation af den hæmostatiske metode. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Prøvens udseende efter centrifugering. Det venstre rør viste et kvalificeret plasmabillede. Det højre rør viste en hæmolyseprøve. Plasmaet så lyserødt eller rødt ud. Jo mørkere farven er, desto højere er hæmolysehastigheden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Anatomien af den subklaviske vene. Denne vene er placeret under kravebenet, og nålen kan nå den lige passeret gennem den subklaviske trekantede fossa højst 0,5 cm. Det forbinder den indre jugular vene, vertebrale vene og ydre jugular vene for at danne kranial vena vene. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Kropsvægtdata for hundyr. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Legemsvægtdata for handyr. Klik her for at downloade denne tabel.
Video 1: Top-down visning af rotteblodprøvetagningsprocessen. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Set fra siden af rotteblodprøvetagningsprocessen. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er visse fordele ved at indsamle blod fra de subklaviske vener. (1) Da stedet for blodtapningen let adskilles, og venøs plexus ikke er regelmæssig på grund af rotternes forskellige stillinger, kan den beskrevne metode let lokalisere placeringen af venøs plexus, samtidig med at rotternes stabile og behagelige stillinger opretholdes. (2) Operationen er let og gunstig for den hurtige udvikling af teknikernes færdigheder og mindre smerte for dyr. (3) En driftstilstand, der gør dyret behageligt, reducerer rastløs adfærd betydeligt og forhindrer blodsprøjt. (4) Det er en blodtrækningsmetode med høj hastighed (20 s), høj effektivitet, lave omkostninger og uden bedøvelse, hvilket reducerer risikoen for dyrebedøvelse og fastholdelsestiden med hensyn til dyrevelfærd.
I denne protokol holdes rotterne komfortable i fastholdelsesprocessen, slapper moderat af ved håndtering og undgår langvarig berøring. Løs håndtering gør det muligt for rotter at bevæge sig hurtigt og kan forårsage utilsigtet skade på dyr eller mennesker; Tværtimod kan det forårsage hypoxi hos rotter. Det er vigtigt at stoppe blødningen, mens du trykker på prøveudtagningsstedet. Operatørerne holder dyret i deres arme for at udjævne dem i mørket. Derudover må det negative tryk ikke være for højt under blodindsamlingen; Ellers vil det føre til dårlig blodprøvetagning. Da farmakokinetiske og TK-undersøgelser kræver gentagen blodtapning, skal blodvolumenet kontrolleres i henhold til forskellige dyrevægt- og sundhedsforhold; I mellemtiden vil et alternativt blodindsamlingssted gavne dyrevelfærden. Hvis dyrene er små eller svage, får de glucose og andre kosttilskud på passende vis under de betingelser, som testen tillader. Nåleindtaget skal være glat og fri for modstand, og når der ikke er blod at opsamle, eller der ikke er nogen modstand, skal nålen indsættes igen i en let justeret retning eller skiftes side. I blodprøvetagningsprocessen er det nødvendigt at undgå at blande blod taget to gange fra indsættelse. Når blodprøvevolumenet til den første injektion er utilstrækkeligt, kræves den anden injektion, sprøjten skal udskiftes, og erstatningsrøret tages til blodet, der opsamles igen i tilfælde af hæmolyse. Det anbefales at afslutte indsamlingen af blod på én gang. Blodet i sprøjten fastgøres til væggen og injiceres i blodopsamlingsrøret for at undgå bobler under processen. For at indsamle blod rettidigt skal operatøren være fuldt forberedt 2 minutter før indsamlingen og injicere 1 min før det. Når dyret er mindre samarbejdsvilligt eller udfordrende at betjene, skal det beroliges på forhånd. Derfor skal der være en gruppe kvalificerede teknikere.
Brachial plexus er vinkelret på og bag den subklaviske vene, så forkert drift kan føre til brachial plexusskade, smerter i forbenet, halthed, flinching og andre negative symptomer16. Denne teknik kan også anvendes på marsvin og opfylde blodindsamlingsbehov i marsvinforsøg, men yderligere forskning er nødvendig for at trække blod fra marsvin ved denne metode.
Anatomien af en subklavisk vene er vist i figur 5. Den subklaviske vene er placeret under kravebenet, og nålen kan nå den lige gennem den subklaviske trekantede fossa, der ikke er større end 0,5 cm. Metoden er derfor risikabel og kræver en kvalificeret professionel. En ukvalificeret professionel vil resultere i dyrs hyperaktivitet, vanskeligheder med at kontrollere, dårlig blodcirkulation, dyresvaghed eller endda dødelighed efter en seriel blodindsamling. Forkert kirurgi vil også beskadige brystet eller arterien. Som følge heraf er det afgørende at involvere en kvalificeret professionel for at opnå et vellykket eksperiment.
Afslutningsvis præsenterer denne protokol en alternativ metode til indsamling af blod fra den subklaviske vene hos rotter, som giver teknisk støtte til PK- og TK-undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Limei Wang, Jianmin Guo, Xiaoman Zhong, Yali Sheng, Qiwen Lai, Hui Song og Wei Yang har en økonomisk interesse i Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd, som dog ikke støttede dette arbejde. De øvrige forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af Guangdong Provincial Key Laboratory of Drug Non-clinical Evaluation and Research (No.2018B030323024) og Key Program "New Drug Creation" af Guangdong Key Research and Development Plan (No.2019B020202001), Guangzhou Fundamental and Application Foundation Research Project (No.202002030249 og No.202002030156).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
- Shravya, K., et al. International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH M2 EWG. Electronic common technical document. , (2014).
- Tan, Y., et al. The China Food and Drug Administration (CFDA). , Springer International Publishing. (2015).
- McGuill, M. W., Andrew, N. R. Biological effects of blood loss: Implications for sampling volumes and techniques. ILAR Journal. 31 (4), 5-20 (1989).
- Aguilar-Mariscal, H., et al. Oral pharmacokinetics of meloxicam in the rat using a high-performance liquid chromatography method in micro-whole-blood samples. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 29 (9), 587-592 (2007).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. JoVE. , Cambridge, MA. (2021).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Itziar, F., Arantza, P., Nahia, D., Virginia, P., Juan, R. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (2), 202-206 (2010).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: A comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Laboratory Animals. 44 (4), 352-358 (2010).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comparative Medicine. 67 (2), 138-146 (2017).
- National Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. , National Academies Press. Washington DC. (2011).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766 (2015).
- Diehl, K., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Casal, D., et al. Functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat. Journal of Visualized Experiments. (158), e59767 (2020).
