Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Blutentnahme aus der Vena subclavia bei Ratten. Es ermöglicht eine schnelle, zeitnahe und leicht identifizierbare Probenahme ohne Anästhesie und erhält qualitativ hochwertiges Blut durch wiederholte Probenentnahme.
Abstract
Ratten werden häufig in pharmakokinetischen (PK) und toxikokinetischen (TK) Studien verwendet, bei denen zu bestimmten Zeitpunkten eine bestimmte Menge Blut gesammelt werden muss, um die Arzneimittelexposition nachzuweisen. Die Rattenblutentnahmemethode bestimmt die Qualität des Plasmas und beeinflusst darüber hinaus die Genauigkeit der Testergebnisse. Die in diesem Protokoll beschriebene Blutentnahmemethode der Subclavia-Vene sammelt wiederholt Blutproben im Bewusstseinszustand von Tieren, um die Anforderungen von PK- und TK-Tests zu erfüllen. Die Fähigkeiten der zurückhaltenden Handhabung und das geeignete Verfahren der Nadelstiche gewährleisten die Erfolgsrate der Blutentnahme. Es ist einfach zu bedienen und gewährleistet gleichzeitig die Qualität des Plasmas und trägt gleichzeitig dem Tierwohl Rechnung. Diese Methode erfordert jedoch eine fachmännische Bedienung, und eine unsachgemäße Methode kann Tierschwäche, Schmerzen, Lahmheit und sogar Sterblichkeit verursachen. Die aktuelle Methode wurde in der Testeinrichtung für eine 4-wöchige orale Toxizitätsstudie an Sprague Dawley (SD) Ratten mit TK angewendet. Die maximale Blutmenge, die innerhalb von 24 Stunden entnommen wurde, überstieg 20 % des Gesamtblutes des Tieres nicht. Das Körpergewicht der Tiere betrug mehr als 200 g bei Männchen und Weibchen. Die Daten zeigten, dass das Körpergewicht der Tiere jede Woche stetig zunahm und die klinische Beobachtung nach wiederholter Probenentnahme normal war.
Introduction
Gemäß den Richtlinien der Internationalen Konferenz zur Harmonisierung der technischen Anforderungen für die Registrierung von Humanarzneimitteln (ICH)1 und den Richtlinien der National Medical Products Administration (NMPA)2 muss die Anzahl der Blutentnahmezeitpunkte von Ratten in der toxikokinetischen Studie (TK) den Anforderungen der dynamischen Arzneimittelexpositionsbewertung entsprechen. Das ungefähre Gesamtblutvolumen einer Ratte beträgt 55-70 ml/kg Körpergewicht3. Die Entnahmezeitpunkte sind in der Regel innerhalb von 30 Minuten nach der Verabreichung intensiv und nehmen danach ab, und mehr als zehn Blutproben müssen innerhalb von 48 Stunden in Routinetestsentnommen werden 4. Zum Beispiel werden Blutproben zu 12 Zeitpunkten (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 8 h und 12 h) in der TK-Studie von oral verabreichten Medikamenten gesammelt. Forscher müssen wiederholt 200-250 μL Blut bei Ratten sammeln, um qualitativ hochwertiges Plasma für den TK-Testzu erhalten 5.
Die Blutentnahmestellen bei Ratten umfassen Schwanzblutgefäße, retroorbitale Plexusvene, submandibuläre Vene, Herz, Bauchaorta6 und so weiter. Unter ihnen ist die Blutentnahme aus der Schwanzvene von Ratten eine häufig verwendete Methode, die erfahrene und erfahrene Bediener erfordert 7,8. Blut aus der retroorbitalen Plexusvene zu sammeln ist weniger kompliziert; Diese Methode wird jedoch nicht empfohlen, da sie das Sehvermögen der Rattenschädigen kann 9 und Blut aus dem Herzen und der Bauchaorta nur für die endgültige Blutentnahme10 geeignet ist. Es hat sich gezeigt, dass eine andere Methode zur Blutentnahme aus der Vena submandibularis bei einer bewussten Ratte zu mehr Komplikationen führt und eine unzureichende Blutprobenqualität aufzeigt11. Daher können Forscher das Tier betäuben, um die Schwierigkeit der Probenahme zu reduzieren. Dennoch erhöht die Anästhesie auch die Kosten des Experiments, und noch schlimmer ist, dass sie den Stoffwechselzustand von Ratten beeinflusst12. Das vorliegende Protokoll verwendet eine schnelle und unkomplizierte Methode zur Blutentnahme in den Subclavia-Venen von Ratten ohne Anästhesie, die eine genaue Positionierung und eine bilaterale alternierende Blutentnahme ermöglicht, um rechtzeitig und wiederholt qualitativ hochwertige Proben zu erhalten.
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Protocol
Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. genehmigt. Männliche und weibliche Sprague Dawley (SD) Ratten, ~6-11 Wochen wurden für die Experimente verwendet. Die Ratten wurden nach den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstierenaufgezogen 13.
1. Zubereitung von Tieren
HINWEIS: Alle SD-Ratten, die in dieser Studie verwendet wurden, waren wach und wurden nicht anästhesiert/eingeschläfert. Die Geschicklichkeit des Rückgriffs durch Greifen der Haut auf dem Rücken des Tieres ist erforderlich.
- Finden Sie den tiefsten Punkt der dreieckigen Fossa subclavia zwischen Hals und Vorderbein bei einer Ratte. Bewegen Sie ~2-3 mm in Richtung Kopf und erreichen Sie die Nadelspitze an der Blutentnahmestelle (Abbildung 1). Entfernen Sie die Haare mit einem elektrischen Rasierer.
HINWEIS: Abhängig von den experimentellen Anforderungen kann Serum oder Plasma erforderlich sein. Plasma wird in diesem Protokoll als Beispiel genommen und hat keinen Einfluss auf den Betrieb der Blutentnahme. - Bereiten Sie Wattestäbchen, die mit 75% Alkohol gefärbt sind, zum Abwischen und Desinfizieren und trocknende Wattestäbchen zum Abwischen vor.
2. Blutentnahme
HINWEIS: Mindestens 2 Personen, die beide Erfahrung in der Blutentnahme und in Rattenrückhaltetechniken haben müssen, sollten diese Schritte durchführen.
- Fassen Sie die Haut im Nacken mit einer Hand an, um den Kopf, den Hals und die Brust der Ratte aufrecht zu halten und die Injektionsstelle freizulegen (Video 1). Begradigen Sie die Vordergliedmaßen an der Seite der Injektionsstelle, um ihre Höhe zu halten.
- Halten Sie die Spritze mit der anderen Hand parallel zum Kopf der Ratte und neigen Sie die Spritze um 5°-10° nach außen, so dass die Spitze in die ventrale Richtung geneigt ist.
- Führen Sie die Nadel vollständig in die vordere Höhle ein. Ziehen Sie die Spritze zurück, um den Unterdruck im Röhrchen aufrechtzuerhalten.
- Bewegen Sie die Nadel langsam von tief nach flach und gehen Sie den gleichen Weg zurück. Wenn Blut in die Spritzennadel eingedrungen ist, fixieren Sie die Position der Nadel (Video 2).
HINWEIS: Das Blut wird dann mit einer konstanten Geschwindigkeit in die Spritze gefüllt, wie in Abbildung 2A (Vorderansicht) und Abbildung 2B (Seitenansicht) gezeigt. - Überwachen Sie die maximale Blutmenge in Übereinstimmung mit den Standards, die von der Tierpflege- und -verwendungskommission der Einrichtung festgelegt wurden. Dies hängt vom Gewicht und der Gesundheit des Tieres ab. In Ermangelung anderer Anforderungen dürfen innerhalb von 24 Stunden nicht mehr als 20% des Gesamtblutvolumens des Tieres entnommen werden, was ~3 Wochen Erholung erfordert14.
- Wenn eine ausreichende Blutprobe entnommen ist, ziehen Sie die Spritze sofort heraus und bereiten Sie sich auf die Blutbehandlung vor (Schritt 3).
- Setzen Sie die Injektionsstelle der Ratte für ~ 1-2 Minuten unter Druck, um die Blutung zu stoppen. Da sich die Entnahmestelle im unteren Teil des Halses befindet, drücken Sie die Haut der Vena subclavia zusammen, um die Blutung zu stoppen, indem Sie darauf drücken (Abbildung 3).
HINWEIS: Blut kann abwechselnd aus der bilateralen Vena subclavia entnommen werden, wenn eine wiederholte Blutentnahme erforderlich ist. - Bringen Sie die Ratte in den Käfig zurück und beobachten Sie ihren Zustand.
3. Aufbereitung der Blutprobe
- Entfernen Sie die Nadel aus der Spritze und entsorgen Sie sie in den scharfen Werkzeugbehälter. Übertragen Sie das Blut langsam aus der Spritze in ein 1,5-ml-Röhrchen. Drücken Sie die Spritze gegen die Wand, um Blasenbildungen zu vermeiden.
HINWEIS: Da Druck dazu führen kann, dass rote Blutkörperchen reißen, entfernen Sie die Nadel, um eine Hämolysezu verhindern 14. - Decken Sie das Mikrozentrifugenröhrchen ab, schnippen Sie es vorsichtig und drehen Sie es mindestens fünfmal auf den Kopf, um das Blut gründlich mit dem Antikoagulans zu vermischen.
- Zentrifugieren Sie die Vollblutprobe bei 2000 x g für ~10-15 min bei Raumtemperatur innerhalb von 120 min nach dem Sammeln des Plasmas.
- Verwenden Sie eine Pipettenpistole (siehe Materialtabelle), um das obere Plasma in ein leeres Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Berühren Sie den Pipettenkopf nicht mit dem unteren Vollblut. Entsorgen oder zentrifugieren Sie das mit den roten Blutkörperchen kontaminierte Plasma.
- Verwenden Sie die Proben sofort oder lagern Sie sie bei -30 °C.
HINWEIS: Die Eigenschaften des Arzneimittels bestimmen die Lagerzeit. Die aus der Vena subclavia gewonnenen Plasmaproben sind durchscheinend und hellgelb. Hämolyse kann das Plasma rot färben.
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Representative Results
Gute Plasmaproben aus der Vena subclavia waren durchscheinend hellgelb (Abbildung 4, linkes Röhrchen). Eine unsachgemäße Blutentnahme oder -manipulation führte zu einer Hämolyse (Abbildung 4, rechter Schlauch).
Die Daten der Testeinrichtung zeigten, dass in einer 4-wöchigen oralen Toxizitätsstudie eines Augentropfens bei SD-Ratten mit TK zweimal Blutproben zu 9 Zeitpunkten (0 h, 0,167 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h und 24 h) zwischen dem ersten (Tag 1) und dem letzten Dosierungstag (Tag 28) entnommen wurden. Die Dosierung für die TKB-, TKC- und TKD-Ratten betrug 10 mg/kg, 30 mg/kg bzw. 100 mg/kg, und das Dosierungsvolumen betrug 10 ml/kg. Das Blutentnahmevolumen der ersten Probenahme betrug ~0,2 ml, das Alter des Tieres ~6-7 Wochen, das Körpergewicht des männlichen Tieres ~268-297 g und das des Weibchens ~214-239 g. Das Blutvolumen der letzten Probenahme betrug ~0,3 ml, das Alter des Tieres ~10-11 Wochen, das Körpergewicht des männlichen Tieres ~376-462 g und das des weiblichen Tieres ~254-300 g. Zwischen den beiden Zeitpunkten der TK-Blutentnahme lag ein Abstand von 28 Tagen. Das Körpergewicht der Tiere nahm jede Woche stetig zu, und die klinische Beobachtung war normal. Die Gesamtblutmenge einer 250 g Ratte beträgt etwa 16 ml15, und die maximale Blutmenge, die innerhalb von 24 h entnommen wurde, überstieg 20% des Gesamtblutes des Tieres nicht. Die Körpergewichtsangaben der weiblichen Tiere sind in Tabelle 1 und die der männlichen Tiere in Tabelle 2 dargestellt.
Abbildung 1: Darstellung der Nadelspitze der Blutentnahmestelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Ablauf der Blutentnahme. Das Blut wurde reibungslos gewonnen. (A) Vorderansicht. (B) Seitenansicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Darstellung der hämostatischen Methode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Aussehen der Probe nach der Zentrifugation. Die linke Röhre zeigte ein qualifiziertes Plasmabild. Das rechte Röhrchen zeigte eine Hämolyseprobe. Das Plasma sah rosa oder rot aus. Je dunkler die Farbe, desto höher die Hämolyserate. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Die Anatomie der Vena subclavia. Diese Vene befindet sich unterhalb des Schlüsselbeins, und die Nadel kann sie nur durch die dreieckige Fossa subclavia nicht mehr als 0,5 cm erreichen. Es verbindet die Vena jugularis interna, die Vena vertebralis und die Vena jugularis externa, um die Vena cranialis zu bilden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Körpergewichtsdaten weiblicher Tiere. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Körpergewichtsdaten männlicher Tiere. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Video 1: Draufsicht auf die Rattenblutentnahme. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 2: Seitenansicht der Rattenblutentnahme. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Es gibt bestimmte Vorteile der Blutentnahme aus den Venen subclavia. (1) Da der Ort der Blutentnahme leicht dissoziiert ist und der Venenplexus aufgrund der unterschiedlichen Körperhaltungen der Ratten nicht regelmäßig ist, kann die beschriebene Methode die Position des Venenplexus leicht lokalisieren, während die stabilen und bequemen Körperhaltungen der Ratten beibehalten werden. (2) Die Operation ist einfach und günstig für die schnelle Entwicklung der Fähigkeiten der Techniker und weniger Schmerzen für Tiere. (3) Ein Betriebsmodus, der es dem Tier angenehm macht, reduziert unruhiges Verhalten erheblich und verhindert Blutspritzer. (4) Es handelt sich um eine Blutentnahmemethode mit hoher Geschwindigkeit (20 s), hoher Effizienz, niedrigen Kosten und ohne Anästhesie, die das Risiko einer Tieranästhesie und die Zeit der Zurückhaltung im Sinne des Tierschutzes reduziert.
In diesem Protokoll werden die Ratten bei der Zurückhaltung bequem gehalten, entspannen sich bei der Handhabung mäßig und vermeiden eine lange Berührung. Die lockere Handhabung ermöglicht es Ratten, sich schnell zu bewegen, und kann zu versehentlichen Verletzungen von Tieren oder Menschen führen. Im Gegenteil, es kann bei Ratten zu Hypoxie führen. Es ist wichtig, die Blutung zu stoppen, während Sie auf die Probenahmestelle drücken. Die Bediener halten das Tier in den Armen, um es in der Dunkelheit zu glätten. Außerdem darf der Unterdruck während der Blutentnahme nicht zu hoch sein; Andernfalls führt es zu einer schlechten Blutentnahme. Da die PK- und TK-Studien eine wiederholte Blutentnahme erfordern, muss das Blutvolumen entsprechend dem Gewicht und den Gesundheitsbedingungen der Tiere kontrolliert werden. In der Zwischenzeit wird eine alternative Blutentnahmestelle dem Tierschutz zugute kommen. Wenn die Tiere klein oder schwach sind, werden sie unter den durch den Test zugelassenen Bedingungen angemessen mit Glukose und anderen Ergänzungsmitteln versorgt. Der Nadeleinlass muss glatt und frei von Widerstand sein, und wenn kein Blut zu sammeln ist oder kein Widerstand vorhanden ist, sollte die Nadel in einer leicht angepassten Richtung wieder eingeführt oder die Seite gewechselt werden. Bei der Blutentnahme ist es notwendig, das Mischen von Blut, das zweimal aus der Insertion entnommen wurde, zu vermeiden. Wenn das Blutprobenvolumen für die erste Injektion nicht ausreicht, ist die zweite Injektion erforderlich, die Spritze muss ausgetauscht werden und der Ersatzschlauch wird im Falle einer Hämolyse erneut für das entnommene Blut entnommen. Es wird empfohlen, die Blutentnahme sofort zu beenden. Das Blut in der Spritze wird an der Wand befestigt und in das Blutentnahmeröhrchen injiziert, um Blasen während des Prozesses zu vermeiden. Um rechtzeitig Blut zu entnehmen, muss der Bediener 2 Minuten vor der Entnahme vollständig vorbereitet sein und 1 Minute vorher injizieren. Wenn das Tier weniger kooperativ oder schwierig zu bedienen ist, muss es im Voraus beruhigt werden. Daher muss es eine Gruppe qualifizierter Techniker geben.
Der Plexus brachialis ist senkrecht zu und hinter der Vena subclavia, so dass eine unsachgemäße Operation zu einer Verletzung des Plexus brachialis, Schmerzen in den Vordergliedmaßen, Lahmheit, Zucken und anderen nachteiligen Symptomen führen kann16. Diese Technik kann auch auf Meerschweinchen angewendet werden und die Blutentnahmebedürfnisse in Meerschweinchenexperimenten erfüllen, aber weitere Forschung ist erforderlich, um Blut von Meerschweinchen mit dieser Methode zu entnehmen.
Die Anatomie einer Vena subclavia ist in Abbildung 5 dargestellt. Die Vena subclavia befindet sich unterhalb des Schlüsselbeins, und die Nadel kann es nur durch die dreieckige Fossa subclavia erreichen, die nicht größer als 0,5 cm ist. Die Methode ist daher riskant und erfordert einen qualifizierten Fachmann. Ein unqualifizierter Fachmann führt zu Hyperaktivität der Tiere, Schwierigkeiten bei der Kontrolle, schlechter Durchblutung, Tierschwäche oder sogar Mortalität nach einer seriellen Blutentnahme. Eine falsche Operation schädigt auch die Brust oder die Arterie. Daher ist es wichtig, einen qualifizierten Fachmann einzubeziehen, um ein erfolgreiches Experiment zu erzielen.
Zusammenfassend stellt dieses Protokoll eine alternative Methode zur Blutentnahme aus der Vena subclavia von Ratten vor, die technische Unterstützung für PK- und TK-Studien bietet.
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Disclosures
Limei Wang, Jianmin Guo, Xiaoman Zhong, Yali Sheng, Qiwen Lai, Hui Song und Wei Yang haben eine finanzielle Beteiligung an der Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd., die diese Arbeit jedoch nicht unterstützte. Die anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde vom Guangdong Provincial Key Laboratory of Drug Non-clinical Evaluation and Research (Nr. 2018B030323024) und dem Schlüsselprogramm "New Drug Creation" des Guangdong Key Research and Development Plan (Nr. 2019B020202001), dem Guangzhou Fundamental and Application Foundation Research Project (Nr. 202002030249 und Nr. 202002030156) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
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