Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה ויעילה לאיסוף דם מהווריד הסובקלאבי בחולדות. הוא מאפשר דגימה מהירה, מהירה וקלה לזיהוי ללא הרדמה ומשיג דם איכותי באמצעות איסוף דגימות חוזר.
Abstract
חולדות נמצאות בשימוש נרחב במחקרים פרמקוקינטיים (PK) וטוקסיקוקינטיים (TK) שצריכים לאסוף כמות מסוימת של דם בנקודות זמן ספציפיות כדי לזהות חשיפה לסמים. שיטת דגימת הדם של חולדות קובעת את איכות הפלזמה ומשפיעה עוד יותר על דיוק תוצאות הבדיקה. שיטת איסוף הדם של הוורידים הסובקלאביים המתוארת בפרוטוקול זה אוספת דגימות דם שוב ושוב במצב המודע של בעלי חיים כדי לענות על הצרכים של בדיקות PK ו- TK. מיומנויות הטיפול בריסון וההליך המתאים של חתך המחט מבטיחים את שיעור ההצלחה של איסוף הדם. זה קל לתפעול תוך הבטחת איכות הפלזמה ובו זמנית קייטרינג רווחת בעלי חיים. עם זאת, שיטה זו דורשת הפעלה מיומנת, ושיטה לא נכונה עלולה לגרום לחולשה של בעלי חיים, כאבים, צליעה ואף תמותה. השיטה הנוכחית שימשה במתקן הבדיקה למחקר רעילות אוראלית בן 4 שבועות בחולדות Sprague Dawley (SD) עם TK. כמות הדם המקסימלית שנאספה תוך 24 שעות לא עלתה על 20% מכלל הדם של החיה. משקל גופם של בעלי החיים היה יותר מ-200 גרם לזכרים ולנקבות. הנתונים הראו כי משקל גופם של בעלי החיים עלה בהתמדה מדי שבוע, והתצפית הקלינית הייתה תקינה לאחר איסוף דגימות חוזר.
Introduction
על פי הנחיות 1 של הוועידה הבינלאומית להרמוניזציה של דרישות טכניות לרישום תרופות לשימוש אנושי (ICH)והנחיות 2 של מנהל המוצרים הרפואיים הלאומי (NMPA), מספר נקודות הזמן לאיסוף הדם של חולדות במחקר הטוקסיקוקינטי (TK) צריך לעמוד בדרישות של הערכת החשיפה הדינמית לתרופות. נפח הדם הכולל המשוער של חולדה הוא 55-70 מ"ל/ק"ג משקל גוף3. נקודות זמן האיסוף הן בדרך כלל אינטנסיביות תוך 30 דקות לאחר המינון ויורדות לאחר מכן, ויש לאסוף יותר מעשר דגימות דם תוך 48 שעות בבדיקות שגרתיות4. לדוגמה, דגימות דם נאספות ב -12 נקודות זמן (0 דקות, 5 דקות, 10 דקות, 15 דקות, 30 דקות, 45 דקות, 1 שעות, 2 שעות, 3 שעות, 4 שעות, 8 שעות ו -12 שעות) במחקר TK של תרופות הניתנות דרך הפה. חוקרים חייבים לאסוף שוב ושוב 200-250 μL של דם בחולדות כדי לקבל פלזמה באיכות גבוהה עבור בדיקת TK5.
אתרי איסוף הדם בחולדות כוללים כלי דם זנב, וריד מקלעת רטרו-אורביטלי, וריד תת-לסתני, לב, אבי עורקים בטני6 וכן הלאה. ביניהם, איסוף דם מן הווריד הקאודלי של חולדות היא שיטה נפוצה, אשר דורש מפעילים מנוסים ומיומנים 7,8. כדי לאסוף דם מן הווריד מקלעת רטרו מסלולית הוא פחות מסובך; עם זאת, שיטה זו אינה מומלצת מכיוון שהיא עלולה לפגוע בראייה של החולדות9, ודם מהלב ומאבי העורקים הבטני מתאים רק לדגימת דם סופית10. שיטה נוספת לאיסוף דם מהווריד התת-לסתי בחולדה מודעת הוכחה כגורמת לסיבוכים רבים יותר וחשפה איכות דגימת דם לא מספקת11. לכן, החוקרים עשויים להרדים את בעל החיים כדי להפחית את הקושי בדגימה. עם זאת, ההרדמה גם מייקרת את עלות הניסוי, וחמור מכך, היא תשפיע על המצב המטבולי של חולדות12. הפרוטוקול הנוכחי משתמש בשיטה מהירה ופשוטה של איסוף דם בוורידים התת-צלביים של חולדות ללא הרדמה, ומאפשר מיקום מדויק ואיסוף דם לסירוגין דו-צדדי כדי לקבל דגימות באיכות גבוהה בזמן ובאופן חוזר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של גואנגדונג Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. חולדות זכרים ונקבות Sprague Dawley (SD), ~ 6-11 שבועות שימשו לניסויים. החולדות גודלו בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה13.
1. הכנת בעלי חיים
הערה: כל חולדות האס-די ששימשו במחקר זה היו ערות ולא הורדמו/הורדמו. יש צורך במיומנות של טיפול בריסון על ידי אחיזת העור בגבו של בעל החיים.
- מצא את הנקודה הנמוכה ביותר של פוסה משולש subclavian בין הצוואר ואת הגפה הקדמית בחולדה. זוזו ~2-3 מ"מ לכיוון הראש והגיעו לנקודת המחט באתר איסוף הדם (איור 1). הסירו את השיער באמצעות מכונת גילוח חשמלית.
הערה: בהתאם לצרכי הניסוי, ייתכן שיהיה צורך בסרום או בפלזמה. פלזמה נלקחת כדוגמה בפרוטוקול זה, וזה לא ישפיע על הפעולה של איסוף הדם. - הכינו צמר גפן מוכתמים ב-75% אלכוהול לניגוב וחיטוי וצמר גפן יבש לניגוב.
2. דגימת דם
הערה: לפחות 2 אנשים, שניהם חייבים להיות מנוסים באיסוף דם וטכניקות ריסון חולדות צריכים לבצע את השלבים הבאים.
- אחזו בעור העורף ביד אחת כדי לשמור על הראש, הצוואר והשד של החולדה זקופים וחשפו את אזור ההזרקה (סרטון 1). יישרו את הגפה הקדמית בצד אתר ההזרקה כדי לשמור על רמתה.
- החזיקו את המזרק במקביל לראש החולדה ביד השנייה והטו את המזרק כלפי חוץ ב-5°-10°, כך שהקצה יהיה מוטה לכיוון הגחון.
- הכנס את המחט במלואה לחלל הקדמי. משוך לאחור את המזרק כדי לשמור על לחץ שלילי בתוך הצינור.
- הזיזו באיטיות את המחט מעומק לרדוד וחזרו באותו נתיב. כאשר הדם נכנס למחט המזרק, תקן את מיקום המחט (וידאו 2).
הערה: הדם יתמלא בקצב קבוע במזרק, כפי שמוצג באיור 2A (מבט קדמי) ובאיור 2B (מבט מהצד). - יש לעקוב אחר כמות הדם המרבית בהתאם לסטנדרטים שנקבעו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים במוסד. זה תלוי במשקל ובבריאות של החיה. בהיעדר דרישות אחרות, אין להסיר יותר מ -20% מנפח הדם הכולל של בעל החיים תוך 24 שעות, מה שדורש ~ 3 שבועות של התאוששות14.
- כאשר דגימת דם מספקת נאספת, מיד למשוך את המזרק ולהתכונן לטיפול בדם (שלב 3).
- יש ללחוץ על אתר ההזרקה של החולדה למשך ~1-2 דקות כדי לעצור את הדימום. מאחר שאתר האיסוף נמצא בחלק התחתון של הצוואר, צבטו את העור של הווריד התת-קלאבי כדי לעצור את הדימום על-ידי לחיצה עליו (איור 3).
הערה: ניתן לאסוף דם לסירוגין מהווריד התת-קלאבי הדו-צדדי כאשר יש צורך באיסוף דם חוזר. - החזירו את החולדה לכלוב והתבוננו במצבה.
3. עיבוד דגימת הדם
- הסר את המחט מהמזרק והשלך אותה במיכל הכלים החד. לאט להעביר את הדם מן המזרק לצינור 1.5 מ"ל. לחץ את המזרק על הקיר כדי למנוע היווצרות בועות, אם בכלל.
הערה: מכיוון שלחץ עלול לגרום לתאי דם אדומים להיקרע, הסר את המחט כדי למנוע המוליזה14. - כסו את צינור המיקרוצנטריפוגה, העבירו אותו בעדינות והפכו אותו לפחות חמש פעמים כדי לערבב היטב את הדם עם נוגד הקרישה.
- צנטריפוגה את כל דגימת הדם ב 2000 x גרם במשך ~ 10-15 דקות בטמפרטורת החדר בתוך 120 דקות לאחר איסוף הפלזמה.
- השתמש באקדח פיפטה (ראה טבלת חומרים) כדי להעביר את הפלזמה העליונה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה ריק. אין לגעת בראש פיפטה עם הדם השלם התחתון. יש להיפטר או לבצע צנטריפוגה מחדש של הפלזמה המזוהמת בכדוריות הדם האדומות.
- השתמש בדגימות באופן מיידי או אחסן אותן ב -30 ° C.
הערה: המאפיינים של התרופה קובעים את זמן האחסון. דגימות הפלזמה המתקבלות מהווריד הסובקלבי שקופות וצהובות בהירות. המוליזה עלולה להפוך את הפלזמה לאדומה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דגימות פלזמה טובות מהווריד הסובקלבי היו שקופות בצבע צהוב בהיר (איור 4, הצינור השמאלי). איסוף דם לא תקין או מניפולציה לא נכונה גרמו להמוליזה (איור 4, הצינור הימני).
הנתונים של מתקן הבדיקה הראו כי במחקר רעילות אוראלית בן 4 שבועות של טיפת עיניים בחולדות SD עם TK, דגימות דם נאספו פעמיים בנקודות זמן של 9 (0 שעות, 0.167 שעות, 0.5 שעות, שעה אחת, שעתיים, 4 שעות, 8 שעות, 12 שעות ו-24 שעות) בין היום הראשון (יום 1) ליום המינון האחרון (יום 28). המינון עבור חולדות TKB, TKC ו-TKD היה 10 מ"ג/ק"ג, 30 מ"ג/ק"ג ו-100 מ"ג/ק"ג, בהתאמה, ונפח המינון היה 10 מ"ל/ק"ג. נפח איסוף הדם של הדגימה הראשונה היה ~ 0.2 מ"ל, גיל החיה היה ~ 6-7 שבועות, משקל הגוף של החיה הזכר היה ~ 268-297 גרם, וזה של הנקבה היה ~ 214-239 גרם. נפח הדם של הדגימה האחרונה היה ~ 0.3 מ"ל, גיל החיה היה ~ 10-11 שבועות, משקל הגוף של החיה הזכרית היה ~ 376-462 גרם, וזה של החיה הנקבה היה ~ 254-300 גרם. היה מרווח של 28 ימים בין שני הזמנים של איסוף הדם TK. משקל גופם של בעלי החיים עלה בהתמדה מדי שבוע, והתצפית הקלינית הייתה תקינה. כמות הדם הכוללת של חולדה 250 גרם היא כ 16 מ"ל15, ואת כמות הדם המקסימלית שנאספה בתוך 24 שעות לא יעלה על 20% מכלל הדם של החיה. נתוני משקל הגוף של נקבות מוצגים בטבלה 1, ונתוני הזכרים מוצגים בטבלה 2.
איור 1: תיאור של נקודת המחט של אתר איסוף הדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תהליך מיצוי דם. הדם הושג בצורה חלקה. (A) מבט מלפנים. (B) מבט מהצד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ייצוג השיטה ההמוסטטית. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הופעת הדגימה לאחר צנטריפוגה. הצינור השמאלי הראה תמונת פלזמה מוסמכת. הצינור הימני הראה דגימת המוליזה. הפלזמה נראתה ורודה או אדומה. ככל שהצבע כהה יותר, כך שיעור ההמוליזה גבוה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: האנטומיה של הווריד התת-קלאבי. וריד זה ממוקם מתחת לעצם הבריח, והמחט יכולה להגיע אליו רק עבר דרך פוסה משולשת subclavian לא יותר מ 0.5 ס"מ. הוא מצטרף לווריד הצוואר הפנימי, לווריד החוליות ולווריד הצוואר החיצוני כדי ליצור את וריד הווריד הגולגולתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: נתוני משקל גוף של נקבות בעלי חיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: נתוני משקל גוף של בעלי חיים זכרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
סרטון 1: מבט מלמעלה למטה על תהליך דגימת הדם של חולדות. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון 2: מבט מהצד על תהליך דגימת הדם של חולדות. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם יתרונות מסוימים של איסוף דם מן הוורידים subclavian. (1) מכיוון שאתר איסוף הדם מנותק בקלות, ומקלעת הוורידים אינה סדירה בשל התנוחות השונות של החולדות, השיטה המתוארת יכולה בקלות למקם את מיקום המקלעת הוורידית תוך שמירה על התנוחות היציבות והנוחות של החולדות. (2) הניתוח קל ונוח לפיתוח מהיר של כישורי טכנאים ופחות כאב לבעלי חיים. (3) מצב הפעלה כדי להקל על בעל החיים מפחית באופן משמעותי התנהגויות חסרות מנוחה ומונע התזת דם. (4) זוהי שיטת לקיחת דם במהירות גבוהה (20 שניות), יעילות גבוהה, בעלות נמוכה וללא הרדמה, המפחיתה את הסיכון להרדמת בעלי חיים ואת זמן הריסון מבחינת רווחת בעלי החיים.
בפרוטוקול זה, החולדות נשמרות בנוח בתהליך האיפוק, מרגיעות במתינות בעת הטיפול ונמנעות ממגע ממושך. טיפול רופף מאפשר לחולדות לנוע במהירות ועלול לגרום לפציעה בשוגג של בעלי חיים או בני אדם; להיפך, זה עלול לגרום היפוקסיה בחולדות. חיוני לעצור את הדימום תוך כדי לחיצה על אתר הדגימה. המפעילים מחזיקים את החיה בזרועותיהם כדי להחליק אותם בחשיכה. בנוסף, הלחץ השלילי לא חייב להיות גבוה מדי במהלך איסוף הדם; אחרת, זה יוביל לדגימת דם לקויה. מכיוון שמחקרי PK ו- TK דורשים איסוף דם חוזר, יש לשלוט בנפח הדם בהתאם למשקל ומצבים בריאותיים שונים של בעלי חיים; בינתיים, אתר איסוף דם חלופי יועיל לרווחת בעלי החיים. אם בעלי החיים קטנים או חלשים, הם מקבלים גלוקוז ותוספים אחרים כראוי בתנאים המותרים על ידי הבדיקה. כניסת המחט חייבת להיות חלקה וללא התנגדות, וכאשר אין דם לאסוף, או שאין התנגדות, יש להחדיר את המחט מחדש בכיוון מותאם מעט או לשנות צדדים. בתהליך דגימת הדם, יש להימנע מערבוב דם שנלקח פעמיים מהחדרתו. כאשר נפח דגימת הדם לזריקה הראשונה אינו מספיק, נדרשת הזריקה השנייה, יש להחליף את המזרק, ואת הצינור החלופי נלקח עבור הדם שנאסף שוב במקרה של המוליזה. מומלץ לסיים את איסוף הדם בבת אחת. הדם במזרק מחובר לדופן ומוזרק לצינור איסוף הדם כדי למנוע בועות במהלך התהליך. כדי לאסוף דם בזמן, המפעיל צריך להיות מוכן לחלוטין 2 דקות לפני האיסוף ולהזריק 1 דקה לפני כן. כאשר בעל החיים פחות משתף פעולה או מאתגר לתפעול, יש להרגיע אותו מראש. לפיכך, צריכה להיות קבוצה של טכנאים מוסמכים.
המקלעת הברכיאלית ניצבת לווריד התת-קלעי ומאחוריו, ולכן פעולה לא נכונה עלולה להוביל לפגיעה במקלעת הברכיאלית, כאבי גפיים קדמיות, צליעה, רפיון ותסמינים שליליים אחרים16. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על שרקנים ולענות על צרכי איסוף הדם בניסויים בשרקנים, אך יש צורך במחקר נוסף כדי לשאוב דם משרקנים בשיטה זו.
האנטומיה של וריד תת-קלאבי מוצגת באיור 5. הווריד התת-קלאבי ממוקם מתחת לעצם הבריח, והמחט יכולה להגיע אליו רק כשהיא עוברת דרך הפוסה המשולשת הסובקלאבית שגודלה אינו עולה על 0.5 ס"מ. לכן השיטה מסוכנת ודורשת איש מקצוע מוסמך. איש מקצוע לא מוסמך יגרום להיפראקטיביות של בעלי חיים, קושי בשליטה, זרימת דם לקויה, חולשה של בעלי חיים או אפילו תמותה בעקבות איסוף דם סדרתי. ניתוח לא נכון יפגע גם בחזה או בעורק. כתוצאה מכך, חיוני לערב איש מקצוע מוסמך כדי להשיג ניסוי מוצלח.
לסיכום, פרוטוקול זה מציג שיטה חלופית לאיסוף דם מהווריד הסובקלבי של חולדות, המספקת תמיכה טכנית למחקרי PK ו- TK.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Limei Wang, Jianmin Guo, Xiaoman Zhong, Yali Sheng, Qiwen Lai, Hui Song ו- Wei Yang יש עניין כספי ב- Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd, אשר, עם זאת, לא תמך בעבודה זו. המחברים האחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מעבדת המפתח המחוזית של גואנגדונג להערכה ומחקר לא קליניים של תרופות (No.2018B030323024) ותוכנית המפתח "יצירת תרופות חדשות" של תוכנית המחקר והפיתוח של מפתח גואנגדונג (No.2019B020202001), פרויקט המחקר של קרן היסוד והיישום של גואנגזו (No.202002030249 ו- No.202002030156).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
- Shravya, K., et al. International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH M2 EWG. Electronic common technical document. , (2014).
- Tan, Y., et al. The China Food and Drug Administration (CFDA). , Springer International Publishing. (2015).
- McGuill, M. W., Andrew, N. R. Biological effects of blood loss: Implications for sampling volumes and techniques. ILAR Journal. 31 (4), 5-20 (1989).
- Aguilar-Mariscal, H., et al. Oral pharmacokinetics of meloxicam in the rat using a high-performance liquid chromatography method in micro-whole-blood samples. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 29 (9), 587-592 (2007).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. JoVE. , Cambridge, MA. (2021).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Itziar, F., Arantza, P., Nahia, D., Virginia, P., Juan, R. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (2), 202-206 (2010).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: A comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Laboratory Animals. 44 (4), 352-358 (2010).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comparative Medicine. 67 (2), 138-146 (2017).
- National Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. , National Academies Press. Washington DC. (2011).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766 (2015).
- Diehl, K., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Casal, D., et al. Functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat. Journal of Visualized Experiments. (158), e59767 (2020).
