Summary
Il presente protocollo descrive un metodo semplice ed efficiente per raccogliere il sangue dalla vena succlavia nei ratti. Consente un campionamento rapido, tempestivo e facilmente identificabile senza anestesia e ottiene sangue di alta qualità attraverso la raccolta ripetitiva dei campioni.
Abstract
I ratti sono ampiamente utilizzati negli studi di farmacocinetica (PK) e tossicocinetica (TK) che devono raccogliere una certa quantità di sangue in punti temporali specifici per rilevare l'esposizione al farmaco. Il metodo di prelievo del sangue di ratto determina la qualità del plasma e influisce ulteriormente sulla precisione dei risultati del test. Il metodo di raccolta del sangue della vena succlavia descritto in questo protocollo raccoglie ripetutamente campioni di sangue nello stato di coscienza degli animali per soddisfare le esigenze dei test PK e TK. Le abilità di gestione della contenzione e la procedura appropriata di incisione dell'ago assicurano il tasso di successo della raccolta del sangue. È facile da usare, garantendo allo stesso tempo la qualità del plasma e allo stesso tempo il benessere degli animali. Tuttavia, questo metodo richiede un'operazione esperta e uno improprio può causare debolezza, dolore, zoppia e persino mortalità degli animali. L'attuale metodo è stato utilizzato nella struttura di test per uno studio di tossicità orale di 4 settimane in ratti Sprague Dawley (SD) con TK. La quantità massima di sangue raccolta entro 24 ore non ha superato il 20% del sangue totale dell'animale. Il peso corporeo degli animali era superiore a 200 g per maschi e femmine. I dati hanno mostrato che il peso corporeo degli animali aumentava costantemente ogni settimana e l'osservazione clinica era normale dopo la raccolta ripetitiva dei campioni.
Introduction
Secondo le linee guida 1 della Conferenza internazionale sull'armonizzazione dei requisiti tecnici per la registrazione dei prodotti farmaceutici per uso umano (ICH)e le linee guida 2 della National Medical Products Administration (NMPA), il numero di punti temporali di raccolta del sangue dei ratti nello studio tossicocinetico (TK) deve soddisfare i requisiti della valutazione dinamica dell'esposizione ai farmaci. Il volume totale approssimativo del sangue di un ratto è 55-70 ml / kg di peso corporeo3. I punti temporali di raccolta sono generalmente intensi entro 30 minuti dopo la somministrazione e diminuiscono dopo, e più di dieci campioni di sangue devono essere raccolti entro 48 ore nei test di routine4. Ad esempio, i campioni di sangue vengono raccolti in 12 punti temporali (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 8 h e 12 h) nello studio TK di farmaci somministrati per via orale. I ricercatori devono raccogliere ripetutamente 200-250 μL di sangue nei ratti per ottenere plasma di alta qualità per il test TK5.
I siti di raccolta del sangue nei ratti includono vasi sanguigni della coda, vena del plesso retro-orbitale, vena sottomandibolare, cuore, aorta addominale6 e così via. Tra questi, la raccolta del sangue dalla vena caudale dei ratti è un metodo frequentemente usato, che richiede operatori esperti e qualificati 7,8. Raccogliere il sangue dalla vena del plesso retro-orbitale è meno complicato; Tuttavia, questo metodo non è raccomandato in quanto può danneggiare la vista dei ratti9 e il sangue dal cuore e dall'aorta addominale è appropriato solo per il prelievo di sangue finale10. Un altro metodo di raccolta del sangue dalla vena sottomandibolare in un ratto cosciente ha dimostrato di provocare più complicazioni e ha rivelato una qualità del campione di sangue insufficiente11. Pertanto, i ricercatori possono anestetizzare l'animale per ridurre la difficoltà di campionamento. Tuttavia, l'anestesia aumenta anche il costo dell'esperimento e, cosa più grave, influenzerà lo stato metabolico dei ratti12. Il presente protocollo utilizza un metodo rapido e semplice di raccolta del sangue nelle vene succlavia dei ratti senza anestesia, consentendo un posizionamento accurato e una raccolta bilaterale alternata del sangue per ottenere campioni di alta qualità in modo tempestivo e ripetuto.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. Per gli esperimenti sono stati utilizzati ratti maschi e femmine di Sprague Dawley (SD), ~ 6-11 settimane. I ratti sono stati allevati seguendo le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio13.
1. Preparazione degli animali
NOTA: Tutti i ratti SD utilizzati in questo studio erano svegli e non sono stati anestetizzati / eutanasiati. È necessaria l'abilità di gestire la contenzione afferrando la pelle sul dorso dell'animale.
- Trova il punto più basso della fossa triangolare succlavia tra il collo e l'arto anteriore in un ratto. Spostarsi ~2-3 mm verso la testa e raggiungere il punto dell'ago nel sito di raccolta del sangue (Figura 1). Rimuovere i capelli usando un rasoio elettrico.
NOTA: A seconda delle esigenze sperimentali, possono essere necessari siero o plasma. Il plasma è preso come esempio in questo protocollo e non influenzerà l'operazione di raccolta del sangue. - Preparare tamponi di cotone macchiati con alcool al 75% per pulire e disinfettare e tamponi di cotone asciutti per pulire.
2. Prelievo di sangue
NOTA: Almeno 2 persone, entrambe esperte nella raccolta del sangue e nelle tecniche di contenzione dei ratti, devono eseguire questi passaggi.
- Afferrare la pelle sulla parte posteriore del collo con una mano per mantenere la testa, il collo e il seno del ratto in posizione verticale ed esporre il sito di iniezione (Video 1). Raddrizzare l'arto anteriore sul lato del sito di iniezione per mantenere il suo livello.
- Tenere la siringa parallela alla testa del ratto con l'altra mano e inclinare la siringa verso l'esterno di 5°-10° in modo che la punta sia inclinata verso la direzione ventrale.
- Inserire l'ago completamente nella cavità anteriore. Tirare indietro la siringa per mantenere la pressione negativa all'interno del tubo.
- Spostare lentamente l'ago da profondo a poco profondo e risalire lo stesso percorso. Quando il sangue è entrato nell'ago della siringa, fissare la posizione dell'ago (Video 2).
NOTA: Il sangue verrà quindi riempito a velocità costante nella siringa, come mostrato nella Figura 2A (vista frontale) e nella Figura 2B (vista laterale). - Monitorare la quantità massima di sangue in conformità con gli standard stabiliti dal comitato per la cura e l'uso degli animali dell'istituzione. Questo dipende dal peso e dalla salute dell'animale. In assenza di altri requisiti, non rimuovere più del 20% del volume totale del sangue dell'animale entro 24 ore, il che richiede ~ 3 settimane di recupero14.
- Quando viene raccolto un campione di sangue sufficiente, prelevare immediatamente la siringa e prepararsi per il trattamento del sangue (fase 3).
- Pressurizzare il sito di iniezione del ratto per ~ 1-2 minuti per fermare l'emorragia. Poiché il sito di raccolta si trova nella parte inferiore del collo, pizzicare la pelle della vena succlavia per fermare l'emorragia premendo su di essa (Figura 3).
NOTA: Il sangue può essere raccolto alternativamente dalla vena succlavia bilaterale quando è necessaria una raccolta ripetuta del sangue. - Riporta il topo nella gabbia e osserva le sue condizioni.
3. Elaborazione del campione di sangue
- Rimuovere l'ago dalla siringa e gettarlo nel contenitore per utensili affilato. Trasferire lentamente il sangue dalla siringa a un tubo da 1,5 ml. Premere la siringa contro il muro per evitare la formazione di bolle, se presenti.
NOTA: Poiché la pressione può causare la rottura dei globuli rossi, rimuovere l'ago per prevenire l'emolisi14. - Coprire il tubo della microcentrifuga, sfiorarlo delicatamente e capovolgerlo almeno cinque volte per mescolare accuratamente il sangue con l'anticoagulante.
- Centrifugare l'intero campione di sangue a 2000 x g per ~10-15 minuti a temperatura ambiente entro 120 minuti dopo aver raccolto il plasma.
- Utilizzare una pistola per pipette (vedere la tabella dei materiali) per trasferire il plasma superiore in una provetta vuota per microcentrifuga. Non toccare la testina della pipetta con il sangue intero inferiore. Smaltire o centrifugare nuovamente il plasma contaminato dai globuli rossi.
- Utilizzare immediatamente i campioni o conservarli a -30 °C.
NOTA: Le caratteristiche del farmaco determinano il tempo di conservazione. I campioni di plasma ottenuti dalla vena succlavia sono traslucidi e giallo chiaro. L'emolisi può trasformare il plasma in rosso.
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Representative Results
I buoni campioni di plasma della vena succlavia erano traslucidi di colore giallo pallido (Figura 4, il tubo sinistro). La raccolta o la manipolazione impropria del sangue ha provocato l'emolisi (Figura 4, il tubo destro).
I dati della struttura di test hanno mostrato che in uno studio di tossicità orale di 4 settimane di un collirio in ratti SD con TK, i campioni di sangue sono stati raccolti due volte in 9 punti temporali (0 h, 0,167 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h e 24 h) tra il primo (giorno 1) e l'ultimo giorno di somministrazione (giorno 28). Il dosaggio per i ratti TKB, TKC e TKD era rispettivamente di 10 mg / kg, 30 mg / kg e 100 mg / kg e il volume di dosaggio era di 10 ml / kg. Il volume di raccolta del sangue del primo campionamento era ~ 0,2 ml, l'età dell'animale era ~ 6-7 settimane, il peso corporeo dell'animale maschio era ~ 268-297 g e quello della femmina era ~ 214-239 g. Il volume del sangue dell'ultimo campionamento era ~ 0,3 ml, l'età dell'animale era ~ 10-11 settimane, il peso corporeo dell'animale maschio era ~ 376-462 g e quello dell'animale femmina era ~ 254-300 g. C'è stato un intervallo di 28 giorni tra i due tempi di raccolta del sangue TK. Il peso corporeo degli animali aumentava costantemente ogni settimana e l'osservazione clinica era normale. La quantità totale di sangue di un ratto da 250 g è di circa 16 ml15 e la quantità massima di sangue raccolto entro 24 ore non ha superato il 20% del sangue totale dell'animale. I dati relativi al peso corporeo delle femmine sono riportati nella tabella 1 e quelli degli animali maschi sono riportati nella tabella 2.
Figura 1: Rappresentazione della punta dell'ago del sito di raccolta del sangue. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Processo di estrazione del sangue. Il sangue è stato ottenuto senza intoppi. (A) Vista frontale. (B) Vista laterale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Rappresentazione del metodo emostatico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Aspetto del campione dopo centrifugazione. Il tubo sinistro mostrava un'immagine al plasma qualificata. Il tubo destro ha mostrato un campione di emolisi. Il plasma sembrava rosa o rosso. Più scuro è il colore, maggiore è il tasso di emolisi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Anatomia della vena succlavia. Questa vena si trova sotto la clavicola e l'ago può raggiungerla appena passata attraverso la fossa triangolare succlavia non più di 0,5 cm. Si unisce alla vena giugulare interna, alla vena vertebrale e alla vena giugulare esterna per formare la vena cranica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Dati sul peso corporeo delle femmine. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Dati sul peso corporeo degli animali maschi. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Video 1: Vista dall'alto verso il basso del processo di prelievo del sangue di ratto. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 2: Vista laterale del processo di prelievo del sangue di ratto. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Ci sono alcuni benefici della raccolta di sangue dalle vene succlavia. (1) Poiché il sito della raccolta del sangue è facilmente dissociato e il plesso venoso non è regolare a causa delle diverse posture dei ratti, il metodo descritto può facilmente localizzare la posizione del plesso venoso mantenendo le posture stabili e confortevoli dei ratti. (2) L'operazione è facile e favorevole al rapido sviluppo delle capacità dei tecnici e meno dolore per gli animali. (3) Una modalità operativa per rendere l'animale confortevole riduce significativamente i comportamenti irrequieti e previene gli schizzi di sangue. (4) È un metodo di prelievo del sangue ad alta velocità (20 s), alta efficienza, basso costo e senza anestesia, che riduce il rischio di anestesia animale e il tempo di contenzione in termini di benessere degli animali.
In questo protocollo, i ratti sono tenuti a proprio agio nel processo di contenzione, rilassandosi moderatamente durante la manipolazione ed evitando un tocco a lungo termine. La manipolazione allentata consente ai ratti di muoversi rapidamente e può causare lesioni accidentali ad animali o persone; Al contrario, può causare ipossia nei ratti. È essenziale fermare il sanguinamento mentre si preme sul sito di campionamento. Gli operatori tengono l'animale tra le braccia per appianarlo nell'oscurità. Inoltre, la pressione negativa non deve essere troppo alta durante la raccolta del sangue; altrimenti, porterà a uno scarso prelievo di sangue. Poiché gli studi PK e TK richiedono ripetuti prelievi di sangue, il volume del sangue deve essere controllato in base al peso dell'animale e alle diverse condizioni di salute; Nel frattempo, un sito alternativo di raccolta del sangue andrà a beneficio del benessere degli animali. Se gli animali sono piccoli o deboli, vengono forniti loro glucosio e altri integratori in modo appropriato nelle condizioni consentite dal test. L'ingresso dell'ago deve essere liscio e privo di resistenza e, quando non c'è sangue da raccogliere, o non c'è resistenza, l'ago deve essere reinserito in una direzione leggermente regolata o cambiato lato. Nel processo di prelievo del sangue, è necessario evitare di mescolare il sangue prelevato due volte dall'inserimento. Quando il volume del campione di sangue per la prima iniezione è insufficiente, è necessaria la seconda iniezione, la siringa deve essere sostituita e il tubo sostitutivo viene prelevato per il sangue raccolto nuovamente in caso di emolisi. Si consiglia di terminare subito la raccolta del sangue. Il sangue nella siringa è attaccato alla parete e iniettato nel tubo di raccolta del sangue per evitare bolle durante il processo. Per raccogliere il sangue tempestivamente, l'operatore deve essere completamente preparato 2 minuti prima della raccolta e iniettare 1 minuto prima. Quando l'animale è meno collaborativo o difficile da usare, deve essere calmato in anticipo. Quindi, ci deve essere un gruppo di tecnici qualificati.
Il plesso brachiale è perpendicolare a e dietro la vena succlavia, quindi un funzionamento improprio può portare a lesioni del plesso brachiale, dolore agli arti anteriori, zoppia, flinching e altri sintomi avversi16. Questa tecnica può essere applicata anche alle cavie e soddisfare le esigenze di raccolta del sangue negli esperimenti sulle cavie, ma sono necessarie ulteriori ricerche per prelevare sangue dalle cavie con questo metodo.
L'anatomia di una vena succlavia è mostrata nella Figura 5. La vena succlavia si trova sotto la clavicola e l'ago può raggiungerla semplicemente passando attraverso la fossa triangolare succlavia non più grande di 0,5 cm. Il metodo è quindi rischioso e richiede un professionista qualificato. Un professionista non qualificato si tradurrà in iperattività animale, difficoltà di controllo, cattiva circolazione del sangue, debolezza animale o persino mortalità a seguito di una raccolta di sangue seriale. Un intervento chirurgico errato danneggerà anche il torace o l'arteria. Di conseguenza, è fondamentale coinvolgere un professionista qualificato per ottenere un esperimento di successo.
In conclusione, questo protocollo presenta un metodo alternativo per la raccolta del sangue dalla vena succlavia dei ratti, che fornisce supporto tecnico per gli studi PK e TK.
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Disclosures
Limei Wang, Jianmin Guo, Xiaoman Zhong, Yali Sheng, Qiwen Lai, Hui Song e Wei Yang hanno un interesse finanziario nel Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd, che, tuttavia, non ha supportato questo lavoro. Gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dal Guangdong Provincial Key Laboratory of Drug Non-clinical Evaluation and Research (No.2018B030323024) e dal Key Program "New Drug Creation" del Guangdong Key Research and Development Plan (No.2019B020202001), Guangzhou Fundamental and Application Foundation Research Project (No.202002030249 e No.202002030156).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
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