Summary
O presente protocolo descreve um método simples e eficiente de coleta de sangue da veia subclávia em ratos. Permite uma amostragem rápida, oportuna e facilmente identificável sem anestesia e obtém sangue de alta qualidade através da coleta repetitiva de amostras.
Abstract
Os ratos são amplamente utilizados em estudos de farmacocinética (PK) e toxicocinéticos (TK) que precisam coletar uma certa quantidade de sangue em pontos de tempo específicos para detectar a exposição a medicamentos. O método de amostragem de sangue de rato determina a qualidade do plasma e afeta ainda mais a precisão dos resultados dos testes. O método de coleta de sangue da veia subclávia descrito neste protocolo coleta amostras de sangue repetidamente no estado consciente dos animais para atender às necessidades dos testes PK e TK. As habilidades de manuseio de contenção e procedimento apropriado de incisão com agulha garantem a taxa de sucesso da coleta de sangue. É fácil de operar, garantindo a qualidade do plasma e, ao mesmo tempo, atendendo ao bem-estar animal. No entanto, este método requer operação qualificada, e um inadequado pode causar fraqueza animal, dor, claudicação e até mortalidade. O método atual foi utilizado na instalação de teste para um estudo de toxicidade oral de 4 semanas em ratos Sprague Dawley (SD) com TK. A quantidade máxima de sangue coletada em 24 h não excedeu 20% do sangue total do animal. O peso corporal dos animais foi superior a 200 g para machos e fêmeas. Os dados mostraram que o peso corporal dos animais aumentou de forma constante a cada semana, e a observação clínica foi normal após a coleta repetitiva de amostras.
Introduction
De acordo com as diretrizes1 da Conferência Internacional sobre Harmonização de Requisitos Técnicos para Registro de Produtos Farmacêuticos para Uso Humano (ICH) e as diretrizes2 da Administração Nacional de Produtos Médicos (NMPA), o número de pontos de tempo de coleta de sangue de ratos no estudo toxicocinético (TK) precisa atender aos requisitos da avaliação dinâmica da exposição a medicamentos. O volume sanguíneo total aproximado de um rato é de 55-70 mL/kg de peso corporal3. Os pontos de coleta são geralmente intensivos dentro de 30 minutos após a dosagem e diminuem depois disso, e mais de dez amostras de sangue precisam ser coletadas dentro de 48 h em testes de rotina4. Por exemplo, amostras de sangue são coletadas em 12 pontos de tempo (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 8 h e 12 h) no estudo TK de medicamentos administrados por via oral. Os pesquisadores devem coletar repetidamente 200-250 μL de sangue em ratos para obter plasma de alta qualidade para o teste TK5.
Os locais de coleta de sangue em ratos incluem vasos sanguíneos da cauda, veia do plexo retro-orbital, veia submandibular, coração, aorta abdominal6 e assim por diante. Dentre eles, a coleta de sangue da veia caudal de ratos é um método frequentemente utilizado, que requer operadores experientes e qualificados 7,8. Coletar sangue da veia do plexo retroorbital é menos complicado; no entanto, esse método não é recomendado, pois pode danificar a visão dos ratos9, e o sangue do coração e da aorta abdominal só é apropriado para a coleta final de sangue10. Outro método de coleta de sangue da veia submandibular em um rato consciente demonstrou resultar em mais complicações e revelou qualidade insuficiente da amostra de sangue11. Portanto, os pesquisadores podem anestesiar o animal para reduzir a dificuldade de amostragem. Ainda assim, a anestesia também aumenta o custo do experimento e, mais seriamente, afetará o estado metabólico dos ratos12. O presente protocolo utiliza um método rápido e direto de coleta de sangue nas veias subclávias de ratos sem anestesia, permitindo posicionamento preciso e coleta de sangue bilateral alternada para obter amostras de alta qualidade de forma oportuna e repetida.
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Protocol
Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. Ratos Sprague Dawley (SD) machos e fêmeas, ~ 6-11 semanas foram usados para os experimentos. Os ratos foram criados seguindo as diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório13.
1. Preparação animal
NOTA: Todos os ratos SD utilizados neste estudo estavam acordados e não estavam anestesiados/eutanasiados. A habilidade de manuseio de contenção agarrando a pele nas costas do animal é necessária.
- Encontre o ponto mais baixo da fossa triangular subclávia entre o pescoço e o membro anterior em um rato. Mova ~2-3 mm em direção à cabeça e alcance o ponto de agulha no local de coleta de sangue (Figura 1). Remova o cabelo usando um barbeador elétrico.
NOTA: Dependendo das necessidades experimentais, o soro ou o plasma podem ser necessários. O plasma é tomado como um exemplo neste protocolo, e não afetará o funcionamento da coleta de sangue. - Prepare cotonetes manchados com álcool a 75% para limpar e desinfetar e cotonetes secos para limpar.
2. Colheita de amostras de sangue
NOTA: Pelo menos 2 pessoas, ambas as quais devem ter experiência em coleta de sangue e técnicas de contenção de ratos devem realizar estas etapas.
- Segure a pele na parte de trás do pescoço com uma mão para manter a cabeça, o pescoço e o peito do rato eretos e expor o local da injeção (Vídeo 1). Endireitar o membro anterior no lado do local da injeção para manter o seu nível.
- Mantenha a seringa paralela à cabeça do rato com a outra mão e incline a seringa para fora 5°-10° de modo a que a ponta fique inclinada para a direção ventral.
- Insira a agulha totalmente na cavidade anterior. Retire a seringa para manter a pressão negativa dentro do tubo.
- Mova lentamente a agulha de profunda para rasa e volte para o mesmo caminho. Quando o sangue tiver entrado na agulha da seringa, fixe a posição da agulha (Vídeo 2).
NOTA: O sangue será então preenchido a uma taxa constante na seringa, como mostrado na Figura 2A (vista frontal) e na Figura 2B (vista lateral). - Monitorar a quantidade máxima de sangue de acordo com os padrões estabelecidos pelo comitê de cuidados e uso de animais da instituição. Isso depende do peso e da saúde do animal. Na ausência de outros requisitos, não remova mais de 20% do volume sanguíneo total do animal dentro de 24 h, o que requer ~3 semanas de recuperação14.
- Quando for recolhida uma amostra de sangue suficiente, retire imediatamente a seringa e prepare-se para o tratamento com sangue (passo 3).
- Pressurize o local de injeção do rato por ~1-2 min para parar o sangramento. Como o local de coleta está na parte inferior do pescoço, aperte a pele da veia subclávia para interromper o sangramento, pressionando-o (Figura 3).
NOTA: O sangue pode ser coletado alternadamente da veia subclávia bilateral quando a coleta de sangue repetida é necessária. - Devolva o rato à gaiola e observe sua condição.
3. Processamento da amostra de sangue
- Retire a agulha da seringa e elimine-a no recipiente de ferramentas afiado. Transfira lentamente o sangue da seringa para um tubo de 1,5 ml. Pressione a seringa contra a parede para evitar formações de bolhas, se houver.
NOTA: Como a pressão pode causar a ruptura dos glóbulos vermelhos, remova a agulha para evitar a hemólise14. - Cubra o tubo de microcentrífuga, mexa-o suavemente e vire-o de cabeça para baixo pelo menos cinco vezes para misturar completamente o sangue com o anticoagulante.
- Centrifugar a amostra de sangue total a 2000 x g durante ~10-15 min à temperatura ambiente dentro de 120 min após a recolha do plasma.
- Use uma pistola de pipeta (consulte Tabela de materiais) para transferir o plasma superior para um tubo de microcentrífuga em branco. Não toque na cabeça da pipeta com o sangue total inferior. Descartar ou recentrifugar o plasma contaminado com os glóbulos vermelhos.
- Utilizar as amostras imediatamente ou armazená-las a -30 °C.
NOTA: As características da droga determinam o tempo de armazenamento. Os espécimes plasmáticos obtidos da veia subclávia são translúcidos e amarelos claros. A hemólise pode tornar o plasma vermelho.
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Representative Results
Boas amostras de plasma da veia subclávia eram amarelo pálido translúcido (Figura 4, tubo esquerdo). A coleta ou manipulação inadequada de sangue resultou em hemólise (Figura 4, tubo direito).
Os dados da instalação de teste mostraram que, em um estudo de toxicidade oral de 4 semanas de um colírio em ratos SD com TK, amostras de sangue foram coletadas duas vezes em 9 pontos de tempo (0 h, 0,167 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h e 24 h) entre o primeiro (Dia 1) e o último dia de dosagem (Dia 28). A dosagem para os ratos TKB, TKC e TKD foi de 10 mg/kg, 30 mg/kg e 100 mg/kg, respectivamente, e o volume de dosagem foi de 10 mL/kg. O volume de coleta de sangue da primeira amostragem foi de ~0,2 mL, a idade do animal foi de ~6-7 semanas, o peso corporal do animal macho foi de ~268-297 g e o da fêmea foi de ~214-239 g. O volume sanguíneo da última amostragem foi de ~0,3 mL, a idade do animal foi de ~10-11 semanas, o peso corporal do animal macho foi de ~376-462 g e o do animal fêmea foi de ~254-300 g. Houve um intervalo de 28 dias entre os dois tempos de coleta de sangue de CK. O peso corporal dos animais aumentou de forma constante a cada semana, e a observação clínica foi normal. A quantidade total de sangue de um rato de 250 g é de cerca de 16 mL15, e a quantidade máxima de sangue coletado dentro de 24 h não excedeu 20% do sangue total do animal. Os dados de peso corporal das fêmeas são apresentados na Tabela 1 e os dos machos são apresentados na Tabela 2.
Figura 1: Representação do ponto de agulha do local de coleta de sangue. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Processo de extração de sangue. O sangue foi obtido suavemente. (A) Vista frontal. (B) Vista lateral. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representação do método hemostático. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Aparência do espécime após centrifugação. O tubo esquerdo mostrou uma imagem de plasma qualificada. O tubo direito apresentava uma amostra de hemólise. O plasma parecia rosa ou vermelho. Quanto mais escura a cor, maior a taxa de hemólise. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Anatomia da veia subclávia. Esta veia está localizada abaixo da clavícula, e a agulha pode alcançá-la apenas passou pela fossa triangular subclávia não mais do que 0,5 cm. Ele se junta à veia jugular interna, veia vertebral e veia jugular externa para formar a veia da veia craniana. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Quadro 1: Dados sobre o peso corporal das fêmeas. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 2: Dados sobre o peso corporal dos animais machos. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Vídeo 1: Vista de cima para baixo do processo de amostragem de sangue de ratos. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Vista lateral do processo de amostragem de sangue de ratos. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Existem certos benefícios da coleta de sangue das veias subclávias. (1) Como o local da coleta de sangue é prontamente dissociado, e o plexo venoso não é regular devido às diferentes posturas dos ratos, o método descrito pode facilmente localizar a posição do plexo venoso, mantendo as posturas estáveis e confortáveis dos ratos. (2) A operação é fácil e favorável ao rápido desenvolvimento das habilidades dos técnicos e menos dor aos animais. (3) Um modo de operação para deixar o animal confortável reduz significativamente os comportamentos inquietos e evita respingos de sangue. (4) É um método de coleta de sangue com alta velocidade (20 s), alta eficiência, baixo custo e sem anestesia, o que reduz o risco de anestesia animal e o tempo de contenção em termos de bem-estar animal.
Neste protocolo, os ratos são mantidos confortáveis no processo de contenção, relaxando moderadamente ao manusear e evitando um toque de longa data. O manuseio solto permite que os ratos se movam rapidamente e podem causar ferimentos acidentais a animais ou pessoas; pelo contrário, pode causar hipóxia em ratos. É essencial parar o sangramento enquanto pressiona o local da amostragem. Os operadores seguram o animal em seus braços para alisá-los na escuridão. Além disso, a pressão negativa não deve ser muito alta durante a coleta de sangue; caso contrário, levará a uma má amostragem de sangue. Uma vez que os estudos PK e TK requerem colheita de sangue repetida, o volume sanguíneo deve ser controlado de acordo com diferentes condições de peso e saúde dos animais; enquanto isso, um local alternativo de coleta de sangue beneficiará o bem-estar animal. Se os animais forem pequenos ou fracos, ser-lhes-ão fornecidos glicose e outros suplementos de forma adequada, nas condições permitidas pelo ensaio. A entrada da agulha deve ser lisa e livre de resistência, e quando não há sangue para coletar, ou não há resistência, a agulha deve ser reinserida em uma direção ligeiramente ajustada ou mudada de lado. No processo de amostragem de sangue, é necessário evitar a mistura de sangue retirado duas vezes da inserção. Quando o volume da amostra de sangue para a primeira injeção é insuficiente, a segunda injeção é necessária, a seringa precisa ser substituída e o tubo de substituição é tomado para o sangue coletado novamente em caso de hemólise. Recomenda-se terminar de coletar sangue de uma só vez. O sangue na seringa é anexado à parede e injetado no tubo de coleta de sangue para evitar bolhas durante o processo. Para coletar sangue em tempo hábil, o operador precisa estar totalmente preparado 2 min antes da coleta e injetar 1 min antes disso. Quando o animal é menos cooperativo ou desafiador de operar, ele deve ser acalmado com antecedência. Por isso, é preciso que haja um grupo de técnicos qualificados.
O plexo braquial é perpendicular e atrás da veia subclávia, de modo que a operação inadequada pode levar à lesão do plexo braquial, dor no membro anterior, claudicação, flinchamento e outros sintomas adversos16. Esta técnica também pode ser aplicada a cobaias e atender às necessidades de coleta de sangue em experimentos com cobaias, mas mais pesquisas são necessárias para extrair sangue de cobaias por esse método.
A anatomia de uma veia subclávia é mostrada na Figura 5. A veia subclávia está localizada abaixo da clavícula, e a agulha pode alcançá-la apenas passando pela fossa triangular subclávia não maior que 0,5 cm. O método é, portanto, arriscado e exige um profissional qualificado. Um profissional não qualificado resultará em hiperatividade animal, dificuldade de controle, má circulação sanguínea, fraqueza animal ou mesmo mortalidade após uma coleta de sangue em série. A cirurgia incorreta também danificará o peito ou a artéria. Como resultado, é crucial envolver um profissional qualificado para alcançar um experimento bem-sucedido.
Em conclusão, este protocolo apresenta um método alternativo para a coleta de sangue da veia subclávia de ratos, que fornece suporte técnico para estudos de PK e TK.
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Disclosures
Limei Wang, Jianmin Guo, Xiaoman Zhong, Yali Sheng, Qiwen Lai, Hui Song e Wei Yang têm interesse financeiro no Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd, que, no entanto, não apoiou este trabalho. Os demais autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelo Laboratório Chave Provincial de Guangdong de Avaliação e Pesquisa Não Clínica de Medicamentos (No.2018B030323024) e pelo Programa Chave "Criação de Novos Medicamentos" do Plano de Pesquisa e Desenvolvimento Chave de Guangdong (No.2019B020202001), Projeto de Pesquisa da Fundação Fundamental e de Aplicação de Guangzhou (No.202002030249 e No.202002030156).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
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