Summary
Mevcut protokol, sıçanlarda subklaviyen damardan kan toplamak için basit ve etkili bir yöntemi açıklamaktadır. Anestezi olmadan hızlı, zamanında ve kolayca tanımlanabilir örnekleme sağlar ve tekrarlayan numune toplama yoluyla yüksek kaliteli kan elde eder.
Abstract
Sıçanlar, ilaca maruz kalmayı tespit etmek için belirli zaman noktalarında belirli miktarda kan toplaması gereken farmakokinetiği (PK) ve toksikokinetik (TK) çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Sıçan kan örnekleme yöntemi, plazmanın kalitesini belirler ve test sonuçlarının hassasiyetini daha da etkiler. Bu protokolde açıklanan subklaviyen ven kan toplama yöntemi, PK ve TK testlerinin ihtiyaçlarını karşılamak için hayvanların bilinçli durumlarında tekrar tekrar kan örnekleri toplar. Kısıtlama işleme becerileri ve uygun iğne kesisi prosedürü kan alımının başarı oranını sağlar. Plazma kalitesini sağlarken ve aynı zamanda hayvan refahını karşılarken kullanımı kolaydır. Bununla birlikte, bu yöntem yetenekli bir operasyon gerektirir ve uygun olmayan bir yöntem hayvan zayıflığına, ağrıya, topallığa ve hatta ölümlere neden olabilir. Mevcut yöntem, TK'lı Sprague Dawley (SD) sıçanlarında 4 haftalık bir oral toksisite çalışması için test tesisinde kullanılmıştır. 24 saat içinde toplanan maksimum kan miktarı, hayvanın toplam kanının% 20'sini geçmedi. Hayvanların vücut ağırlığı erkekler ve dişiler için 200 g'dan fazlaydı. Veriler, hayvanların vücut ağırlığının her hafta istikrarlı bir şekilde arttığını ve tekrarlayan numune toplamadan sonra klinik gözlemin normal olduğunu gösterdi.
Introduction
İnsan Kullanımı İçin İlaçların Tescili için Teknik Gereksinimlerin Uyumlaştırılması Uluslararası Konferansı (ICH) kılavuzları1 ve Ulusal Tıbbi Ürünler İdaresi (NMPA) kılavuzları2'ye göre, toksikokinetik (TK) çalışmadaki sıçanların kan toplama zaman noktalarının sayısının, dinamik ilaca maruz kalma değerlendirmesinin gereksinimlerini karşılaması gerekir. Bir sıçanın yaklaşık toplam kan hacmi 55-70 mL / kg vücut ağırlığı3'tür. Toplama zaman noktaları genellikle dozlamadan sonraki 30 dakika içinde yoğundur ve bundan sonra azalır ve rutin testlerde 48 saat içinde ondan fazla kan örneğinin toplanması gerekir4. Örneğin, kan örnekleri, oral yoldan verilen ilaçların TK çalışmasında 12 zaman noktasında (0 dakika, 5 dakika, 10 dakika, 15 dakika, 30 dakika, 45 dakika, 1 saat, 2 saat, 3 saat, 4 saat, 8 saat ve 12 saat) toplanır. Araştırmacılar, TK testi 5 için yüksek kaliteli plazma elde etmek için sıçanlarda tekrar tekrar 200-250 μL kan toplamalıdır.
Sıçanlardaki kan toplama bölgeleri kuyruk kan damarları, retro-orbital pleksus veni, submandibuler ven, kalp, abdominal aort6 vb. İçerir. Bunlar arasında, sıçanların kaudal damarından kan toplanması, deneyimli ve yetenekli operatörler gerektiren sık kullanılan bir yöntemdir 7,8. Retro-orbital pleksus veninden kan toplamak daha az karmaşıktır; Bununla birlikte, bu yöntem sıçanların görme duyusuna zarar verebileceği için önerilmez9 ve kalpten ve abdominal aorttan gelen kan sadece son kan örneklemesi10 için uygundur. Bilinçli bir sıçanda submandibuler damardan kan toplamanın bir başka yönteminin daha fazla komplikasyona neden olduğu ve yetersiz kan örneği kalitesi11 ortaya koyduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, araştırmacılar örnekleme zorluğunu azaltmak için hayvanı uyuşturabilirler. Yine de, anestezi aynı zamanda deneyin maliyetini de arttırır ve daha ciddi olarak, sıçanların metabolik durumunu etkileyecektir12. Mevcut protokol, anestezi olmadan sıçanların subklaviyen damarlarında kan toplamak için hızlı ve basit bir yöntem kullanır, bu da zamanında ve tekrarlanan bir şekilde yüksek kaliteli örnekler elde etmek için doğru konumlandırma ve bilateral alternatif kan alımına izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan tüm hayvan deneyleri, Guangdong Lewwin Farmasötik Araştırma Enstitüsü Co., Ltd.'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. erkek ve dişi Sprague Dawley (SD) sıçanları, deneyler için ~ 6-11 hafta kullanıldı. Sıçanlar, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kılavuzlara uyularak yetiştirildi13.
1. Hayvan hazırlığı
NOT: Bu çalışmada kullanılan tüm SD sıçanlar uyanıktı ve anestezi / ötenazi yapılmadı. Hayvanın arkasındaki cildi kavrayarak kısıtlama kullanma becerisine ihtiyaç vardır.
- Subklaviyen üçgen fossa'nın boyun ve ön ayak arasındaki en düşük noktasını bir sıçanda bulun. Başa doğru ~ 2-3 mm hareket ettirin ve kan toplama bölgesindeki iğne noktasına ulaşın (Şekil 1). Elektrikli tıraş makinesi kullanarak saçları çıkarın.
NOT: Deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak, serum veya plazma gerekebilir. Plazma bu protokolde örnek olarak alınmıştır ve kan toplama işlemini etkilemeyecektir. - Silmek ve dezenfekte etmek için% 75 alkol ile lekelenmiş pamuklu çubuklar ve silmek için kuru pamuklu çubuklar hazırlayın.
2. Kan örneklemesi
NOT: Her ikisi de kan alma ve sıçan kısıtlama teknikleri konusunda deneyimli olması gereken en az 2 kişi bu adımları uygulamalıdır.
- Sıçanın başını, boynunu ve göğsünü dik tutmak ve enjeksiyon bölgesini ortaya çıkarmak için boynun arkasındaki cildi bir elinizle tutun (Video 1). Seviyesini korumak için enjeksiyon bölgesinin yan tarafındaki ön ayağı düzeltin.
- Şırıngayı diğer elinizle sıçanın kafasına paralel tutun ve şırıngayı dışarı doğru 5 ° -10 ° eğin, böylece uç ventral yöne doğru eğilir.
- İğneyi tamamen ön boşluğa yerleştirin. Tüp içindeki negatif basıncı korumak için şırıngayı geri çekin.
- İğneyi yavaşça derinlerden sığlığa doğru hareket ettirin ve aynı yolu yedekleyin. Şırınga iğnesine kan girdiğinde, iğnenin konumunu sabitleyin (Video 2).
NOT: Kan, daha sonra Şekil 2A (önden görünüm ) ve Şekil 2B'de (yandan görünüm) gösterildiği gibi şırıngada sabit bir oranda doldurulacaktır. - Kurumun hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından belirlenen standartlara uygun olarak maksimum kan miktarını izleyin. Bu, hayvanın ağırlığına ve sağlığına bağlıdır. Başka gereksinimlerin yokluğunda, hayvanın toplam kan hacminin% 20'sinden fazlasını 24 saat içinde çıkarmayın, bu da ~ 3 haftalık iyileşmegerektirir 14.
- Yeterli kan örneği toplandığında, hemen şırıngayı geri çekin ve kan tedavisine hazırlanın (adım 3).
- Kanamayı durdurmak için sıçanın enjeksiyon bölgesini ~ 1-2 dakika boyunca basınçlandırın. Toplama bölgesi boynun alt kısmında olduğundan, üzerine bastırarak kanamayı durdurmak için subklaviyen venin derisini sıkıştırın (Şekil 3).
NOT: Tekrarlanan kan alımına ihtiyaç duyulduğunda bilateral subklaviyen damardan dönüşümlü olarak kan toplanabilir. - Sıçanı kafese geri döndürün ve durumunu gözlemleyin.
3. Kan örneğinin işlenmesi
- İğneyi şırıngadan çıkarın ve keskin alet kabına atın. Kanı yavaşça şırıngadan 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Varsa kabarcık oluşumlarını önlemek için şırıngayı duvara bastırın.
NOT: Basınç kırmızı kan hücrelerinin yırtılmasına neden olabileceğinden, hemolizi önlemek için iğneyi çıkarın14. - Mikrosantrifüj tüpünü örtün, hafifçe hafifçe kaydırın ve kanı antikoagülanla iyice karıştırmak için en az beş kez baş aşağı çevirin.
- Tam kan örneğini, plazmayı topladıktan sonra 120 dakika içinde oda sıcaklığında ~ 10-15 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüj yapın.
- Üst plazmayı boş bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir pipet tabancası kullanın (bkz. Pipet kafasına alt tam kan ile dokunmayın. Kırmızı kan hücreleri ile kontamine olmuş plazmayı atın veya yeniden santrifüj edin.
- Numuneleri hemen kullanın veya -30 °C'de saklayın.
NOT: İlacın özellikleri depolama süresini belirler. Subklaviyen venden elde edilen plazma örnekleri yarı saydam ve açık sarıdır. Hemoliz plazmayı kırmızıya çevirebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Subklaviyen venden alınan iyi plazma örnekleri yarı saydam soluk sarı renkteydi (Şekil 4, sol tüp). Yanlış kan alımı veya manipülasyonu hemoliz ile sonuçlandı (Şekil 4, sağ tüp).
Test tesisinin verileri, TK'li SD sıçanlarda bir göz damlasının 4 haftalık bir oral toksisite çalışmasında, kan örneklerinin ilk (Gün 1) ile son dozlama günü (Gün 28) arasında 9 zaman noktasında (0 saat, 0.167 saat, 0.5 saat, 1 saat, 2 saat, 4 saat, 8 saat, 12 saat ve 24 saat) iki kez toplandığını göstermiştir. TKB, TKC ve TKD sıçanları için dozaj sırasıyla 10 mg / kg, 30 mg / kg ve 100 mg / kg idi ve dozaj hacmi 10 mL / kg idi. İlk örneklemenin kan toplama hacmi ~ 0.2 mL, hayvanın yaşı ~ 6-7 hafta, erkek hayvanın vücut ağırlığı ~ 268-297 g ve dişininki ~ 214-239 g idi. Son örneklemenin kan hacmi ~ 0.3 mL, hayvanın yaşı ~ 10-11 hafta, erkek hayvanın vücut ağırlığı ~ 376-462 g ve dişi hayvanınki ~ 254-300 g idi. TK kan alımının iki zamanı arasında 28 günlük bir aralık vardı. Hayvanların vücut ağırlığı her hafta istikrarlı bir şekilde arttı ve klinik gözlem normaldi. 250 g'lık bir sıçanın toplam kan miktarı yaklaşık 16 mL15'tir ve 24 saat içinde toplanan maksimum kan miktarı, hayvanın toplam kanının% 20'sini geçmemiştir. Dişi hayvanların vücut ağırlığı verileri Tablo 1'de, erkek hayvanların vücut ağırlığı verileri ise Tablo 2'de gösterilmiştir.
Şekil 1: Kan toplama bölgesinin iğne ucunun tasviri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kan çıkarma işlemi. Kan sorunsuz bir şekilde elde edildi. (A) Önden görünüm. (B) Yandan görünüm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hemostatik yöntemin gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Santrifüjleme sonrası numune görünümü. Sol tüp nitelikli bir plazma görüntüsü gösterdi. Sağ tüp hemoliz örneği gösterdi. Plazma pembe veya kırmızı görünüyordu. Renk ne kadar koyu olursa, hemoliz oranı o kadar yüksek olur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 5: Subklaviyen venin anatomisi. Bu damar klavikulanın altında bulunur ve iğne, subklaviyen üçgen fossadan en fazla 0,5 cm'den geçerek ona ulaşabilir. Kraniyal vena venini oluşturmak için iç juguler ven, vertebral ven ve dış juguler veni birleştirir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Dişi hayvanların vücut ağırlığı verileri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: Erkek hayvanların vücut ağırlığı verileri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 1: Sıçan kan örnekleme işleminin yukarıdan aşağıya görünümü. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 2: Sıçan kan örnekleme işleminin yandan görünümü. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subklaviyen damarlardan kan toplamanın bazı faydaları vardır. (1) Kan toplama bölgesi kolayca ayrıştığından ve sıçanların farklı duruşları nedeniyle venöz pleksus düzenli olmadığından, tarif edilen yöntem, sıçanların stabil ve rahat duruşlarını korurken venöz pleksusun pozisyonunu kolayca lokalize edebilir. (2) Operasyon, teknisyenlerin becerilerinin hızlı gelişimi ve hayvanlara daha az acı vermesi için kolay ve elverişlidir. (3) Hayvanı rahat ettirmek için bir çalışma modu, huzursuz davranışları önemli ölçüde azaltır ve kan sıçramasını önler. (4) Hayvan refahı açısından hayvan anestezisi riskini ve kısıtlama süresini azaltan, yüksek hızlı (20 sn), yüksek verimli, düşük maliyetli ve anestezisiz bir kan alma yöntemidir.
Bu protokolde, sıçanlar kısıtlama sürecinde rahat tutulur, uzun süreli bir dokunuştan kaçınırken ve kaçınırken orta derecede gevşer. Gevşek kullanım, sıçanların hızlı hareket etmesini sağlar ve hayvanlara veya insanlara kazara zarar verebilir; aksine, sıçanlarda hipoksiye neden olabilir. Örnekleme bölgesine basarken kanamayı durdurmak önemlidir. Operatörler hayvanı karanlıkta yumuşatmak için kollarında tutarlar. Ek olarak, kan alımı sırasında negatif basınç çok yüksek olmamalıdır; aksi takdirde, zayıf kan örneklemesine yol açacaktır. PK ve TK çalışmaları tekrarlanan kan alımını gerektirdiğinden, kan hacmi farklı hayvan ağırlığına ve sağlık koşullarına göre kontrol edilmelidir; Bu arada, alternatif bir kan toplama alanı hayvan refahına fayda sağlayacaktır. Hayvanlar küçük veya zayıfsa, testin izin verdiği koşullar altında uygun şekilde glikoz ve diğer takviyelerle sağlanır. İğne girişi pürüzsüz ve dirençten arındırılmış olmalı ve toplanacak kan olmadığında veya direnç olmadığında, iğne hafifçe ayarlanmış bir yönde veya değiştirilen taraflarda yeniden yerleştirilmelidir. Kan örnekleme işleminde, yerleştirmeden iki kez alınan kanın karıştırılmasını önlemek gerekir. İlk enjeksiyon için kan numunesi hacmi yetersiz olduğunda, ikinci enjeksiyon gereklidir, şırınganın değiştirilmesi gerekir ve hemoliz durumunda tekrar toplanan kan için yedek tüp alınır. Bir kerede kan toplamayı bitirmeniz önerilir. Şırıngadaki kan duvara tutturulur ve işlem sırasında kabarcıkları önlemek için kan toplama tüpüne enjekte edilir. Zamanında kan toplamak için, operatörün toplamadan 2 dakika önce tamamen hazırlanması ve bundan 1 dakika önce enjekte edilmesi gerekir. Hayvan daha az işbirlikçi olduğunda veya çalışması zor olduğunda, önceden yatıştırılmalıdır. Bu nedenle, bir grup nitelikli teknisyen olması gerekir.
Brakiyal pleksus, subklaviyen venin arkasına ve arkasına diktir, bu nedenle yanlış operasyon brakiyal pleksus yaralanmasına, ön ayak ağrısına, topallığa, çırpınmaya ve diğer olumsuzsemptomlara yol açabilir 16. Bu teknik kobaylara da uygulanabilir ve kobay deneylerinde kan toplama ihtiyacını karşılayabilir ancak bu yöntemle kobaylardan kan almak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Subklaviyen venin anatomisi Şekil 5'te gösterilmiştir. Subklaviyen ven klavikulanın altında bulunur ve iğne, 0,5 cm'den daha büyük olmayan subklaviyen üçgen fossadan geçerek ona ulaşabilir. Bu nedenle yöntem risklidir ve nitelikli bir profesyonel gerektirir. Niteliksiz bir profesyonel, hayvan hiperaktivitesine, kontrol zorluğuna, zayıf kan dolaşımına, hayvan zayıflığına ve hatta seri kan alımını takiben ölüm oranına neden olacaktır. Yanlış ameliyat ayrıca göğse veya artere zarar verecektir. Sonuç olarak, başarılı bir deney elde etmek için nitelikli bir profesyoneli dahil etmek çok önemlidir.
Sonuç olarak, bu protokol, PK ve TK çalışmaları için teknik destek sağlayan sıçanların subklaviyen veninden kan toplamak için alternatif bir yöntem sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Limei Wang, Jianmin Guo, Xiaoman Zhong, Yali Sheng, Qiwen Lai, Hui Song ve Wei Yang, bu çalışmayı desteklemeyen Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd.'de finansal bir çıkara sahiptir. Diğer yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu araştırma, Guangdong İl İlaç Klinik Olmayan Değerlendirme ve Araştırma Anahtar Laboratuvarı (No.2018B030323024) ve Guangdong Anahtar Araştırma ve Geliştirme Planı Anahtar Programı "Yeni İlaç Oluşturma" (No.2019B020202001), Guangzhou Temel ve Uygulama Vakfı Araştırma Projesi (No.202002030249 ve No.202002030156) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
- Shravya, K., et al. International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH M2 EWG. Electronic common technical document. , (2014).
- Tan, Y., et al. The China Food and Drug Administration (CFDA). , Springer International Publishing. (2015).
- McGuill, M. W., Andrew, N. R. Biological effects of blood loss: Implications for sampling volumes and techniques. ILAR Journal. 31 (4), 5-20 (1989).
- Aguilar-Mariscal, H., et al. Oral pharmacokinetics of meloxicam in the rat using a high-performance liquid chromatography method in micro-whole-blood samples. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 29 (9), 587-592 (2007).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. JoVE. , Cambridge, MA. (2021).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Itziar, F., Arantza, P., Nahia, D., Virginia, P., Juan, R. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (2), 202-206 (2010).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: A comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Laboratory Animals. 44 (4), 352-358 (2010).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comparative Medicine. 67 (2), 138-146 (2017).
- National Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. , National Academies Press. Washington DC. (2011).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766 (2015).
- Diehl, K., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Casal, D., et al. Functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat. Journal of Visualized Experiments. (158), e59767 (2020).
