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Chemistry

Verwendung eines zyklischen Ionenmobilitätsspektrometers für Tandemionen-Mobilitätsexperimente

Published: January 20, 2022 doi: 10.3791/63451
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1INRAE, UR BIA, F-44316 Nantes, France, 2INRAE, BIBS Facility, F-44316 Nantes, France

Summary

Die Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) ist eine interessante Ergänzung zur Massenspektrometrie zur Charakterisierung von Biomolekülen, insbesondere weil sie empfindlich auf Isomerie reagiert. Dieses Protokoll beschreibt ein Tandem-IMS-EXPERIMENT (IMS/IMS), das die Isolierung eines Moleküls und die Generierung der Mobilitätsprofile seiner Fragmente ermöglicht.

Abstract

Eine genaue Charakterisierung chemischer Strukturen ist wichtig, um ihre zugrunde liegenden biologischen Mechanismen und funktionellen Eigenschaften zu verstehen. Die Massenspektrometrie (MS) ist ein beliebtes Werkzeug, reicht aber nicht immer aus, um alle strukturellen Merkmale vollständig zu enthüllen. Zum Beispiel, obwohl Kohlenhydrate biologisch relevant sind, wird ihre Charakterisierung durch zahlreiche Ebenen der Isomerie erschwert. Die Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) ist eine interessante Ergänzung, da sie empfindlich auf Ionenkonformationen und damit auf Isomerie reagiert.

Darüber hinaus haben die jüngsten Fortschritte die Technik erheblich verbessert: Die letzte Generation von Cyclic IMS-Instrumenten bietet im Vergleich zu linearen IMS-Instrumenten zusätzliche Fähigkeiten, wie z.B. ein erhöhtes Auflösungsvermögen oder die Möglichkeit, Tandemionenmobilitätsexperimente (IMS/IMS) durchzuführen. Während IMS/IMS wird ein Ion basierend auf seiner Ionenmobilität ausgewählt, fragmentiert und erneut analysiert, um Informationen zur Ionenmobilität über seine Fragmente zu erhalten. Jüngste Arbeiten zeigten, dass die Mobilitätsprofile der in solchen IMS/IMS-Daten enthaltenen Fragmente als Fingerabdruck eines bestimmten Glykans fungieren und in einer molekularen Netzwerkstrategie verwendet werden können, um Glykomik-Datensätze strukturell relevant zu organisieren.

Das Ziel dieses Protokolls ist es daher, zu beschreiben, wie IMS/IMS-Daten generiert werden, von der Probenvorbereitung bis zur endgültigen CCS-Kalibrierung (Collision Cross Section) der Ionenmobilitätsdimension, die reproduzierbare Spektren liefert. Am Beispiel eines repräsentativen Glykans zeigt dieses Protokoll, wie eine IMS/IMS-Kontrollsequenz auf einem zyklischen IMS-Instrument aufgebaut wird, wie diese Kontrollsequenz berücksichtigt werden kann, um die IMS-Ankunftszeit in die Driftzeit (d. h. die effektive Trennungszeit, die auf die Ionen angewendet wird) zu übersetzen und wie die relevanten Mobilitätsinformationen aus den Rohdaten extrahiert werden können. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die kritischen Punkte eines IMS/IMS-Experiments klar zu erklären und so neuen zyklischen IMS-Anwendern zu helfen, einfache und reproduzierbare Akquisitionen durchzuführen.

Introduction

Die vollständige chemische Charakterisierung von Biomolekülen ist der Schlüssel zum Verständnis ihrer zugrunde liegenden biologischen und funktionellen Eigenschaften. Zu diesem Zweck haben sich in den letzten Jahren "Omics"-Wissenschaften entwickelt, die auf die großflächige Charakterisierung chemischer Strukturen in biologischen Konzentrationen abzielen. In der Proteomik und Metabolomik ist MS zu einem Kerninstrument geworden, um die strukturelle Heterogenität in biologischen Medien zu entschlüsseln - insbesondere dank ihrer Empfindlichkeit und Fähigkeit, strukturelle Informationen durch Tandem-MS (MS/MS) bereitzustellen. In MS / MS-Strategien wird ein Ion entsprechend seiner Masse ausgewählt, dann fragmentiert und schließlich werden die Massen seiner Fragmente erfasst, um einen Fingerabdruck des Moleküls zu erstellen. MS/MS-Spektren können insbesondere verwendet werden, um Spektraldatenbanken1,2 abzugleichen oder die übergeordneten Strukturen vorläufig zu rekonstruieren3,4. Unter der Annahme, dass ähnliche Spektren zu ähnlichen Verbindungen gehören, können MS/MS-Daten auch verwendet werden, um molekulare Netzwerke (MNs) aufzubauen, die verwandte Spezies durch einen Ähnlichkeitswert verbinden5,6.

Aufgrund der inhärenten Eigenschaft von MS, das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z) von Ionen zu erkennen, ist die Technik jedoch blind für eine Reihe von strukturellen Merkmalen, die in den Bereich der (Stereo-)Isomerie fallen. Zum Beispiel bestehen Kohlenhydrate aus mehreren Monosaccharid-Untereinheiten, von denen viele Stereoisomere oder sogar Epimere sind (z. B. Glc vs. Gal oder Glc vs. Man). Diese Untereinheiten sind durch glykosidische Bindungen verbunden, die sich durch die Position der Verknüpfung (Regioisomerie) und die sterische Konfiguration des anomeren Kohlenstoffs (Anomere) unterscheiden können. Diese Eigenschaften erschweren es für eigenständige MS, zwischen Kohlenhydratisomeren zu unterscheiden7, und nur die Regioisomerie kann mit hochenergetischen Aktivierungsmethoden behandelt werden8,9,10. Obwohl die Derivatisierung eine Option ist, um die Äquivalenz stereoisomerer Gruppen zu stören11, erfordert sie eine umfangreiche Probenvorbereitung. Eine weitere, einfachere Option besteht darin, MS mit einer analytischen Dimension zu koppeln, die empfindlich auf Isomerie reagiert, wie z. B. IMS.

Da dieses Protokoll für Benutzer gedacht ist, die bereits mit den grundlegenden Konzepten von IMS vertraut sind, und weil detaillierte Überprüfungen an anderer Stelle verfügbar sind12,13, wird hier nur ein kurzer Überblick über die Prinzipien von IMS gegeben. IMS ist ein Gasphasen-Trennverfahren, das auf der Wechselwirkung von Ionen mit einem Puffergas und einem elektrischen Feld beruht und letztendlich Ionen gemäß ihren Gasphasenkonformationen trennt. Verschiedene Prinzipien von IMS, die an MS gekoppelt sind, finden sich auf kommerziellen Instrumenten: Einige arbeiten bei abwechselnd hohen und niedrigen elektrischen Feldern (feldasymmetrisches IMS, FAIMS), während die meisten innerhalb der niedrigen Feldgrenze arbeiten - insbesondere Driftröhren-IMS (DTIMS, linear abnehmendes elektrisches Feld), Wanderwellen-IMS (TWIMS, symmetrische Potentialwellen) und gefangenes IMS (TIMS, hoher Durchfluss von Puffergas-Einfangionen gegen elektrische Felder)13 . Die Low-Field-Verfahren ermöglichen den Zugang zu einem sogenannten CCS, einer Eigenschaft des Ion-Gas-Paares, die die Oberfläche (in Å2 oder nm2) des Ions darstellt, das während der Trennung mit dem Puffergas interagiert. CCS ist theoretisch instrumentenunabhängig und somit nützlich, um Daten zu generieren, die zwischen verschiedenen Labors reproduziert werden können14. Ionenmobilitätstrennungen können durch verschiedene Parameter und insbesondere durch Schwankungen des Gasdrucks und der Gastemperatur in der Mobilitätszelle beeinflusst werden. Die CCS-Kalibrierung ist eine Möglichkeit, hier Abhilfe zu schaffen, da sowohl das Kalibrant als auch die interessierende Spezies in ähnlicher Weise betroffen sein werden13. Es ist jedoch zwingend erforderlich, das Gerät in einem temperaturgeführten Raum zu installieren und über ein zuverlässiges Gasdruckregelsystem zu verfügen.

Eine interessante Weiterentwicklung von IMS ist IMS/IMS, das erstmals 2006 von Clemmers Gruppe als Analogon zu MS/MS15,16 eingeführt wurde. In IMS/IMS wird ein Ion von Interesse selektiv aufgrund seiner Ionenmobilität isoliert; es wird dann aktiviert (bis zur möglichen Fragmentierung), und eine neue IMS-Analyse des aktivierten Ions oder der aktivierten Fragmente wird durchgeführt. Im ersten Instrumententwurf wurden zwei IMS-Zellen in Reihe geschaltet, getrennt durch einen Ionentrichter, in dem die Aktivierung stand. Obwohl seitdem eine Reihe von IMS/IMS-Setups vorgeschlagen wurden (für eine Überprüfung siehe Eldrid und Thalassinos17), wurde das erste kommerzielle Massenspektrometer mit IMS/IMS-Fähigkeit erst 201918 verfügbar. Dieses Instrument verbesserte das ursprüngliche Konzept erheblich, indem es mit einem anderen technologischen Durchbruch kombiniert wurde: einem zyklischen Design der IMS-Zelle.

Die zyklische IMS-Zelle erlaubt es theoretisch, die Driftweglänge und damit das Auflösungsvermögen des Instruments19 nahezu unendlich zu erhöhen. Dies wurde durch eine spezielle Instrumentengeometrie erreicht, bei der die zyklische TWIMS-Zelle orthogonal zur optischen Hauptachse der Ionen platziert wird. Ein Multifunktions-Array-Bereich am Eingang der IMS-Zelle ermöglicht die Steuerung der Richtung des Ionenpfads: (i) Senden von Ionen seitwärts für die IMS-Trennung, (ii) vorwärts für die MS-Detektion oder (iii) rückwärts von der IMS-Zelle, die in einer Prearray-Zelle gespeichert werden soll. Von dieser Prearray-Speicherzelle aus können die Ionen aktiviert und die Fragmente in die IMS-Zelle zur Messung der Ionenmobilität reinjiziert werden, ein Ansatz, der erfolgreich zur Charakterisierung von Stereoisomeren verwendet wurde20. Letztendlich enthalten die gesammelten Daten Ionenmobilität und m/z-Informationen für den Vorläufer und seine Fragmente.

In einer kürzlich erschienenen Publikation, die dieses zyklische Design für Glykananalysen verwendete (Ollivier et al.21), zeigten wir, dass das Mobilitätsprofil der in solchen IMS / IMS-Daten enthaltenen Fragmente als Fingerabdruck eines Biomoleküls fungiert, das in einer molekularen Netzwerkstrategie verwendet werden kann. Das daraus resultierende Netzwerk, IM-MN genannt, führte zur strukturell relevanten Organisation von Glykomik-Datensätzen, während das ausschließlich aus MS/MS-Daten (MS-MN) aufgebaute Netzwerk wenig Informationen preisgab. Um diese Veröffentlichung zu ergänzen und Cyclic IMS-Benutzern bei der Implementierung dieses Workflows zu helfen, enthält dieses Protokoll eine vollständige Beschreibung des Protokolls, das zum Sammeln der Daten verwendet wird. Dieses Protokoll konzentriert sich nur auf die Generierung der IMS/IMS-Daten, die Benutzer dann zum Aufbau von IM-MN-Netzwerken (siehe 21) oder für eine andere Anwendung ihrer Wahl verwenden können. Der Aufbau von IM-MN wird hierin nicht berücksichtigt, da Protokolle für die molekulare Vernetzung bereits verfügbar sind22. Die entscheidenden Punkte, die befolgt werden müssen, um wertvolle und reproduzierbare IMS/IMS-Akquisitionen zu generieren, werden hervorgehoben. Am Beispiel eines der von Ollivier et al. untersuchten Oligosaccharide 21 werden die folgenden Schritte detailliert beschrieben: (i) Probenvorbereitung, (ii) Abstimmung des zyklischen IMS-Instruments, (iii) automatisierte Peak-Picking der Daten und (iv) CCS-Kalibrierung.

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Protocol

HINWEIS: Eine Übersicht über das Protokoll finden Sie in Abbildung 1. Die Parameter, die für die im vorliegenden Protokoll beschriebenen Experimente verwendet werden, finden Sie in der Ergänzungstabelle S1 und der Ergänzungstabelle S2.

1. Vorbereitung der Probenlösung

HINWEIS: Das Protokoll wird anhand eines Arabinoxylanpentasaccharids (23-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose oder XA2XX; siehe Materialtabelle) als Beispiel beschrieben.

  1. Herstellung des Lösungsmittels: 500 μM LiCl in 50:50 H2O:MeOH (vol./vol.).
    1. Bereiten Sie eine 100 mM große Stammlösung aus Lithiumchlorid (LiCl) in H2O unter einem Gewicht von 212 mg LiCl vor und fügen Sie 50 ml hochreines deionisiertes Wasser (H2O) in ein 50 ml konisches Polypropylenröhrchen hinzu. Schütteln, bis es vollständig aufgelöst ist.
      HINWEIS: Das Lösungsmittel wird mit einem Lithiumsalz dotiert, um die Bildung von [M + Li] + -Addukten in der Ionenquelle des Spektrometers zu fördern, da es im Vergleich zu anderen Alkaliaddukten normalerweise qualitativ bessere Fragmentierungsspektren liefert. Die Verwendung von LiCl wird empfohlen, da festgestellt wurde, dass organische Säuren (und damit ihre Salze) IMS-Profile beeinflussen23.
    2. In einer Glasflasche die LiCl-Stammlösung 200x: auf 250 μL der Stammlösung verdünnen, 24,75 ml H2O hinzufügen. 25 ml Methanol (MeOH) zugeben, um eine endgültige LiCl-Konzentration von 500 μM in 50:50 H2O:MeOH (v/v) zu erreichen. Beschallen Sie für 2 Minuten, um das Lösungsmittel zu entgasen.
      HINWEIS: MeOH stellt eine Gesundheitsgefährdung dar (H225, H301, H311, H331, H370); Manipulieren Sie unter einer Dunstabzugshaube mit einem Laborkittel, Handschuhen und Augenschutz. Ein Anteil von 50:50 MeOH/H2O (v/v) scheint das beste Lösungsmittel für die Ionisation von Oligosacchariden zu sein; MeOH kann jedoch bei Bedarf durch Acetonitril (ACN) ersetzt werden.
  2. In einem 1,5 ml Polypropylenröhrchen 1 mg des Kohlenhydrats wiegen. Mit einem geeigneten Volumen von 500 μM LiCl auflösen, um eine Konzentration von 1 mg/ml zu erreichen. Auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml in 50:50 MeOH/H2O + 500 μM LiCl verdünnen. Bei 4 °C lagern.
    HINWEIS: Die Konzentration von 10 μg/ml wurde gewählt, um das Signal über alle Fragmentionen während IMS/IMS-MS zu optimieren (dies gilt für eine reine Verbindung; erhöhen Sie die Konzentration bei der Arbeit an Gemischen). Für die Erfassung von Referenz-IMS/IMS-Spektren ist die Probe nicht weiter zu verdünnen: Es wird eine Sättigung des MS-Detektors vor der Fragmentierung erwartet, obwohl das Gerät Optionen bietet, um sie zu korrigieren (siehe Schritt 3.2.).

2. Tuning des Cyclic IMS Massenspektrometers

HINWEIS: Softwarebezogene Anweisungen (Fenster, Menüs und Befehle) sind fett hervorgehoben.

  1. Öffnen Sie die Instrumentenkonsole über die Gerätesteuerungssoftware (MS-Tune-Seite , siehe Softwaredetails in der Materialtabelle) und versetzen Sie das Gerät in den Betriebsmodus . Warten Sie mindestens 3 h, bis sich die hohen Spannungen in der IMS-Zelle stabilisiert haben.
    HINWEIS: Für eine optimale Reproduzierbarkeit müssen die Spannungen in der IMS-Zelle vollständig stabilisiert werden. Schalten Sie die hohen Spannungen ein und lassen Sie das Gerät über Nacht stabilisieren, bevor Sie eine zyklische IMS-Analyse durchführen. Weiterhin müssen Druck und Temperatur in der Ionenmobilitätszelle so konstant wie möglich gehalten werden. Obwohl im Vakuum-Tab ein Rücklesen für den Druck verfügbar ist, ist kein Rücklesen für die Temperatur verfügbar. Bewahren Sie das Gerät in einem thermostatisierten Labor auf. Das bei dieser Arbeit verwendete Instrument arbeitet mit 1,75 mbar in einem Labor, das bei 20 °C thermostatisiert ist.
  2. Zyklischer IMS-Geräteaufbau
    HINWEIS: Standardlösungen müssen mit dem integrierten Fluidiksystem für die Geräteeinrichtung infundiert werden.
    1. Stellen Sie die Fluidikbehälter gefüllt mit den entsprechenden vom Hersteller bereitgestellten Standards auf das Fluidiksystem auf: Reservoir B ("Lockmass"): 10 pg/μL Leucin-Enkephalin (LEU ENK) in 50:50 ACN/H2O + 0,1% Ameisensäure; Reservoir C ('Calibrant'): MajorMix.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wird die MajorMix-Kalibrierlösung verwendet, um sowohl die m/z- als auch die CCS-Abmessungen zu kalibrieren. Aus praktischen Gründen wird eine externe CCS-Kalibrierung durchgeführt (siehe Schritt 5 des Protokolls); Daher ist es auch möglich, ein hauseigenes Kalibrantgemisch für das CCS und ein weiteres Kalibrant für das m/z (z. B. Natriumformiat oder Natriumjodid) zu verwenden.
    2. Wechseln Sie auf der Seite Tune der Quartz-Konsole zur Registerkarte Fluidics . Stellen Sie die Probenfluidik auf Reservoir C und die Referenzfluidik auf Reservoir B ein. Gießen Sie beide Lösungen nacheinander in die Ionenquelle, um das MS-Signal zu überprüfen.
    3. Führen Sie die ADC-Einrichtung, die Detektoreinrichtung (mit LEU ENK) und die Massenkalibrierung (siehe Materialtabelle für die Kalibrierlösung) auf der Seite Geräteeinrichtung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
  3. Zeichnen Sie eine IMS-Erfassung der Kalibrierlösung mit einer Single-Pass-Trennung auf (verwenden Sie diese für die externe IMS-Kalibrierung).
    HINWEIS: Die Ionenquelle und die Parameter der Wanderwelle (TW) (statische Wellenhöhe und Wellengeschwindigkeit) müssen während aller Aufnahmen (Kalibrierung und Erfassungen) konstant gehalten werden. Wenn der Benutzer keine Vorkenntnisse über die optimalen Parameter für seine Probe hat, kann dieser Schritt nach Schritt 3 des Protokolls durchgeführt werden (für [M+Li]+ -Addukte von neutralen Oligosacchariden verwenden die repräsentativen Ergebnisse eine TW-Höhe von 16 V und eine TW-Geschwindigkeit von 350 m/s, die die besten Ergebnisse liefern).
    1. Wählen Sie auf der Registerkarte Fluidik die Prallwandposition Probe und infundiert das Kalibrant (siehe Materialtabelle) in der Ionenquelle (unter Verwendung des integrierten Fluidiksystems) durch die Sonde "Probe" mit einer Durchflussrate von 10 μl / min.
    2. Richten Sie eine Single-Pass-IMS-Sequenz ein. Versetzen Sie das Instrument auf der Seite "Melodie " in den Mobilitätsmodus und öffnen Sie das Fenster Steuerung zyklischer Sequenzen. Wählen Sie den erweiterten Modus aus. Wählen Sie in diesem neuen Fenster auf der Registerkarte Zyklische Funktionen die Option Bundle hinzufügen und dann Single/Multipass aus. Warten Sie, bis eine Abfolge von Mobilitätsereignissen auf der Registerkarte Sequenz desselben Fensters angezeigt wird.
      HINWEIS: Um die Echtzeitanzeige zu aktivieren, muss der Benutzer die Geräteparameter anwenden: Klicken Sie auf Tune im TOF-Modus oder Auf Im Mobilitätsmodus ausführen. Bevor das Gerät zwischen dem TOF- und dem Mobility-Modus umgeschaltet wird, muss die laufende Erfassung (einschließlich der Anzeige der Tune-Seite) abgebrochen werden. Die relative Häufigkeit von Ionen kann zwischen dem TOF-Modus und dem Mobilitätsmodus aufgrund von Änderungen der Ionenübertragungsparameter variieren.
    3. Passen Sie die Reihenfolge so an, dass alle Kalibrantenionen einen einzigen Durchgang um die zyklische IMS-Rennstrecke machen. Ändern Sie weder die Einspritzzeit noch die Auswurfzeit und erfassen Sie die Zeit; Verringern Sie jedoch die Trennungszeit auf 1 ms (auf der Registerkarte Sequenz). Wenn einige Ionen der Kalibriermischung nicht in das angezeigte Ankunftszeitfenster passen, ändern Sie die Synchronisation des IMS mit dem Pusher des orthogonalen Beschleunigungs-TOF-Analysators, indem Sie die Anzahl der Pushes Per Bin auf der Registerkarte ADC-Einstellungen erhöhen.
      HINWEIS: Die Zeiten in der Steuersequenz steuern nur das Multifunktionsarray für Ionen-Gating. Solange die Ionen in ihrem ersten (oder nten) Durchgang um die Rennstrecke eingeschaltet sind, werden sie diesen Durchgang beenden, auch wenn sich die Richtung des TW in der Zwischenzeit im Array geändert hat. Wenn die Trennzeit auf 1 ms gesenkt wird, wechselt das Array nach 1 ms in den Auswurfmodus. Dies stellt sicher, dass die schnelleren Ionen nicht genug Zeit haben, um das Array zu durchlaufen und einen zweiten Durchgang durchzuführen, bevor die langsameren Ionen ihren ersten Durchgang beenden. Daher werden alle Ionen der gleichen Anzahl von Durchgängen (dh einem Durchgang) unterzogen, die für die Durchführung der IMS-Kalibrierung erforderlich ist.
    4. Zeichnen Sie eine 2-minütige Akquisition auf. Klicken Sie im Fenster Cyclic Sequence Control auf Acquire , um das Popup-Fenster Acquisition Settings zu öffnen. Geben Sie den Dateinamen, die Beschreibung und die Erfassungsdauer (Min.) ein und klicken Sie auf Speichern.
  4. Zeichnen Sie eine weitere 2-minütige Erfassung der Kalibrierlösung unter den gleichen Bedingungen wie Schritt 2.3 auf (verwenden Sie diese, um die Qualität der CCS-Kalibrierung zu überprüfen). Klicken Sie im Fenster Cyclic Sequence Control auf Acquire , um das Popup-Fenster Acquisition Settings zu öffnen. Geben Sie den Dateinamen, die Beschreibung und die Erfassungsdauer (Min.) ein und klicken Sie auf Speichern.
  5. Waschen Sie das Fluidiksystem gründlich mit 50:50 H2O/ACN, um eine Kristallisation des Calibraants im Peek-Schlauch zu vermeiden.

3. IMS/IMS-MS Akquisition

  1. Mit einer Spritzenpumpe wird die (lithiumdotierte) Probe mit 10 μg/ml durch die Probensonde mit einer Durchflussrate von 10 μL/min infundiert.
  2. Schalten Sie das Gerät in den TOF-Modus (von der MS-Tune-Seite ), um die Stabilität des Signals zu überprüfen. Zeichnen Sie eine vollständige MS-Aufnahme (1 Minute) der Probe auf, die nützlich ist, um das Isotopenmuster und das Vorhandensein potenzieller Verunreinigungen zu überprüfen.
    HINWEIS: Da die Probenkonzentration gewählt wird, um ein gutes Ionensignal für die Fragmente zu erhalten, kann in diesem Schritt eine TOF-Sättigung beobachtet werden. Die TOF-Sättigung kann anhand der folgenden Artefakte identifiziert werden: (i) eine künstlich erhöhte MS-Auflösung, (ii) eine Änderung der Isotopenverhältnisse und (iii) eine Vielzahl von Peaks mit geringer Häufigkeit zwischen Isotopen. Verwenden Sie das DRE-Objektiv (Dynamic Range Enhancement, Quad/MS Profile/DRE Tab der Haupt-Tune-Seite), um die Übertragung von Ionen zu dämpfen und die Sättigung im TOF-Modus zu verwerfen (Abbildung 2A,B).
  3. Versetzen Sie das Gerät in den MSMS-Modus (Registerkarte Quad/MS-Profil auf der Hauptseite Tune) und wählen Sie die Masse des Zielions im MSMS-Massenfeld zur Isolierung im Quadrupol aus (im Beispiel: m/z von 685,2, entsprechend der [M+Li]+-Ionenspezies des Arabinoxylan-Pentasaccharids). Zeichnen Sie eine 1-minütige Erfassung auf, um die Vorläuferisolation bei der Verarbeitung der Daten zu überprüfen.
    HINWEIS: Lithiumaddukte haben ein Isotop bei -1 Da des Monoisotopenpeaks, das aus dem MS/MS-Auswahlfenster entfernt werden muss, damit es die Verarbeitungsschritte nicht stört. Sie kann entfernt werden, indem Sie den Auswahlbereich mithilfe der Parameter LM-Auflösung und HM-Auflösung auf der Registerkarte Quad/MS-Profil einschränken (Abbildung 2C).
  4. Richten Sie eine "Slicing"-IMS-Sequenz ein, um eine mobilitätsbasierte Auswahl des interessierenden Isomers durchzuführen.
    1. Schalten Sie das Gerät in den Mobilitätsmodus (siehe Schritt 2.3.2). Wählen Sie im Fenster Steuerung zyklischer Abfolge auf der Registerkarte Zyklische Funktionen die Option Bundle hinzufügen und dann Slicing aus. Warten Sie, bis auf der Registerkarte Sequenz eine komplexe Abfolge von Mobilitätsereignissen angezeigt wird (Abbildung 3).
      HINWEIS: Es ist möglich, jeden Schritt des IMS/IMS-Prozesses zu visualisieren: Klicken Sie auf der Registerkarte Sequenz auf das Ereignis Auswerfen und Erwerben. Sobald es rot markiert ist, verschieben Sie es mit den Aufwärts- und Abwärtstasten an die entsprechende Position innerhalb der Sequenz.
    2. Positionieren Sie das Ereignis Auswerfen und Erwerben direkt nach dem ersten Separate-Ereignis (d. h. verschieben Sie es in Zeile 3 statt in Zeile 8 in der Sequenz, wie in Abbildung 3 dargestellt), und klicken Sie dann auf Ausführen. Achten Sie darauf, dass die Ergebnisse der anfänglichen Trennung in Echtzeit angezeigt werden. Erhöhen Sie die Dauer des ersten separaten Ereignisses für eine Multipass-Trennung, indem Sie den Zeitwert für dieses Ereignis in der Sequenz ändern, bis die Auflösung der IMS-Spitzen zufriedenstellend ist. Notieren Sie eine 1-minütige Akquisition als Referenz.
      HINWEIS: Beachten Sie den Wert ADC Start Delay auf der Registerkarte ADC Setup : Es ist nützlich, die Qualität der Isolierung zu überprüfen.
    3. Klicken Sie auf Pause. Beachten Sie, dass die Ergebnisse der anfänglichen Trennung angezeigt werden, obwohl Änderungen in der Steuerungsreihenfolge erst angewendet werden, wenn der Benutzer erneut auf Ausführen klickt. Positionieren Sie das Ereignis Auswerfen und Erfassen unter den Ereignissen Auswerfen, Auswerfen in den Vorspeichervorgang sowie Halten und Auswerfen. Passen Sie die Dauer der Ereignisse so an, dass sich der angestrebte Peak im Bereich Auswerfen in den Vorspeicherbereich und jedes andere Ion entweder im Auswurf- oder im Halte- und Auswurfbereich befindet.
      HINWEIS: Die Dauer dieser drei Ereignisse im Vergleich zu den Ankunftszeitverteilungen (ATDs) kann mit dem farbcodierten Balken unterhalb des Mobilitätsspektrums auf der Registerkarte Mobilogramm visualisiert werden (Abbildung 3).
    4. Positionieren Sie das Ereignis Auswerfen und Erfassen am Ende der Sequenz, unterhalb der Ereignisse Reinject from Pre-Store und dem zweiten Separate-Ereignis . Klicken Sie auf Ausführen , um die ausgewählte Grundgesamtheit anzuzeigen.
      HINWEIS: Da die ausgewählte Grundgesamtheit die IMS-Zelle verlassen hat, ist die gesamte vorherige Trennung verloren gegangen, und es handelt sich wieder um eine Single-Pass-Trennung (die gewünscht wird).
    5. Überprüfen Sie die Qualität der Isolierung. Um sicherzustellen, dass nur der Peak of Interest ausgewählt wurde, führen Sie nach der Reinjektion dieselbe Trennung wie vor der Reinjektion durch (d. h. dieselbe separate Zeit) wie in Abbildung 4 dargestellt. Notieren Sie eine 1-minütige Akquisition als Referenz.
      HINWEIS: Die Benutzer werden aufgefordert, die ausgeworfene Population zu überprüfen. Das Zeitfenster Auswerfen in den Vorspeicher sollte dem Basisszenario entsprechen (Abbildung 4B). Um dies zu überprüfen, setzen Sie die ADC-Startverzögerung auf der Registerkarte ADC-Einstellungen in den manuellen Modus und geben Sie die in Schritt 3.4.2 notierte Verzögerungszeit ein. Notieren Sie eine 1-minütige Akquisition als Referenz.
    6. Suchen Sie auf der Registerkarte Sequenz in der Spalte neben den benutzerdefinierten Ereigniszeiten (Spalte Time Abs, rot hervorgehoben) nach den summierten Zeiten aller Ereignisse. Beachten Sie die Time Abs, die auf der Linie des Reinject from Pre-Store-Ereignisses für die Durchführung der CCS-Kalibrierung zu finden sind.
  5. Fragmentieren Sie den angestrebten Peak zwischen den beiden Runden des IMS. Ändern Sie die Spannungen des Reinjektionsschritts, um die kinetische Energie der Ionen zu erhöhen, und fragmentieren Sie sie bei Kollision mit dem Ionenmobilitätsgas.
    1. Legen Sie die Dauer des Ereignisses "Trennen " direkt vor dem Auswerfen und Erfassen auf 1 ms fest (siehe Erläuterung in Schritt 2.3.3).
    2. Aktivieren Sie in der Zeile Reinject from Pre-Store das Kontrollkästchen Aktivierung aktivieren , und optimieren Sie die Fragmentierung mit dem integrierten Steuerelement. Wenn das Spektrum zufriedenstellend ist (z. B. wenn der Basispeak ein Fragment ist), fahren Sie direkt mit Schritt 3.5.4 fort.
      HINWEIS: Wenn Sie die Aktivierung aktivieren, werden drei Spannungen auf der Leitung grau: Dies sind die Spannungen, die der Benutzer ändern muss, wenn eine manuelle Optimierung der Spannungen erforderlich ist (siehe nächster Schritt). Diese drei Spannungen (Pre-Array-Gradient, Pre-Array-Bias und Array-Offset) bilden den Gradienten, der zur Aktivierung der Ionen verwendet wird. Die kinetische Energie der Ionen nimmt mit der Steigung zwischen dem Pre-Array Bias und dem Array Offset zu (siehe Abbildung 5). Die Standardwerte der Werte für Gradient → Bias → Offset sind: ohne Aktivierung 85 → 70 → 45 V; maximale Aktivierung der eingebauten Funktion 185 → 170 → -5 V (+150 V). Vergessen Sie nach der Fragmentierung nicht, die Ionenübertragung mit der DRE-Linse neu einzustellen (verringern Sie die Dämpfung des Signals) (siehe Schritt 3.2.).
    3. Wenn die Fragmentierung mit der integrierten Steuerung nicht zufriedenstellend ist, deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Aktivierung aktivieren, und fahren Sie mit der manuellen Optimierung der Reinjektionsspannungen fort. Erhöhen Sie die Pre-Array-Gradientenspannung (die Pre-Array-Bias-Spannung muss immer 15 V unter dem Pre-Array-Gradienten gehalten werden) und senken Sie die Array-Offset-Spannung (die als negativ eingestellt werden kann), bis die Ergebnisse zufriedenstellend sind.
      HINWEIS: Bei der manuellen Einstellung der Spannungen des Multifunktionsarrays kann der Benutzer von der Mobilogrammansicht zu interaktiven Schaltplänen der im Multifunktionsarray angelegten Spannungen (PE-Diagramm) wechseln, um die Spannungseinstellungen besser zu visualisieren (Abbildung 5A).
    4. Zeichnen Sie eine 2-minütige Akquisition auf. Aktivieren Sie im Popup-Fenster der Erfassung die Option Driftzeit beibehalten, um eine Datei zu generieren, die nur die Ankunftszeiten im Vergleich zu m / z enthält (die für chromatographische Analysen verwendete Erfassungszeit - die Aufbewahrungszeit - wird aus der Datei entfernt). Beachten Sie, dass diese Datei mit *_dt gekennzeichnet ist. ROH.
      HINWEIS: Wenn der Benutzer vergisst, die Option Driftzeit beibehalten zu aktivieren, ist es immer noch möglich, die IMS-Dimension mit der Driftscope 2.9-Software (File | zu extrahieren Export nach MassLynx | Behalten Sie die Driftzeit bei).
  6. Schalten Sie das Gerät auf der Hauptseite Tune zurück in den TOF-Modus und spülen Sie das System gründlich mit 50:50 MeOH/H2O aus, bevor Sie mit dem nächsten Sample fortfahren.

4. IMS/IMS-MS Verarbeitung mit MZmine 224

HINWEIS: MZmine 2 ist über die in der Materialtabelle angegebene URL verfügbar. Die Verwendung von MZmine 2.51 wird empfohlen. Zum Zeitpunkt der Erstellung dieses Manuskripts können die späteren Versionen aufgrund einer Änderung der Importfunktion keine RAW-Dateien von Cyclic IMS-Instrumenten öffnen.

  1. Importieren Sie die Rohdatei(en), die nur die IMS - und m/z-Abmessungen (*_dt enthalten. RAW) mit Rohdatenmethoden | Rohdatenimport.
    HINWEIS: Rohdateien werden auf der linken Seite des MZmine-Hauptfensters angezeigt. Importieren Sie nicht das Original *. RAW-Dateien , die noch die Behaltenszeitdimension enthalten. MZmine unterscheidet die Aufbewahrungszeit nicht von der IMS-Ankunftszeit, und die Datenpunkte beider Dimensionen würden sich überschneiden.
  2. Optimieren Sie die Workflow-Parameter für eine repräsentative Datei, indem Sie sie im Feld Rohdatendateien Liste.
    1. Bewerten Sie den Geräuschpegel in den Daten. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Datei in der Liste Rohdatendateien , wählen Sie TIC anzeigen und zeigen Sie den Basispeak "Chromatogramm" (BPC) an. Doppelklicken Sie auf den kleinsten Peak, der mit dem Auge beobachtbar ist, um sein Massenspektrum anzuzeigen. Betrachten Sie den Rauschpegel in den Daten als etwa den des zweiten Isotops des Basispeaks in diesem Spektrum, und verwenden Sie denselben Wert für alle Intensitätsschwellenwerte in den folgenden Verarbeitungsschritten.
      HINWEIS: Die Daten wurden mittels Quadrupol-Isolierung erfasst und werden daher von MZmine als MS/MS betrachtet.
    2. Führen Sie die Massenerkennung mit Rohdatenmethoden | durch | zur Merkmalserkennung Massenerkennung. Verwenden Sie für Daten, die im Profilmodus erfasst werden, den Wavelet-Transformationsalgorithmus . Um die Parameter der Algorithmen in MZmine einzurichten, klicken Sie auf die Schaltfläche [...] neben dem Algorithmus und verwenden Sie die Option Vorschau anzeigen , um die Daten zu visualisieren und gleichzeitig die Parameter zu optimieren.
      HINWEIS: In diesem Stadium werden die vom Algorithmus ausgewählten Spitzen im Vorschaufenster rot angezeigt. Wenn der Wavelet-Transformationsalgorithmus für proprietäre RAW-Dateien verwendet wird, verwechselt MZmine manchmal die Profildatenpunkte mit zentrierten Peaks. Die Software zeigt eine Meldung an, die besagt, dass der Benutzer einen Profilalgorithmus für zentrierte Spektren ausführt: Ignorieren Sie diese Meldung und klicken Sie auf OK.
    3. Rekonstruieren Sie die extrahierten Ionenmobilitätsspektren (EIM) für jede Fragmentmasse mit Rohdatenmethoden | | zur Merkmalserkennung ADAP Chromatogram Builder auf der Massenliste "Massen", die durch den vorherigen Schritt generiert wurde. Da die M / Z-Toleranzeingabe in diesem Stadium eine Scan-zu-Scan-Toleranz ist, achten Sie darauf, sie mindestens 3-4-mal höher zu lassen als die insgesamt erwartete Genauigkeit.
    4. Da der vorherige Schritt keine Vorschauoption hat, überprüfen Sie die Qualität der Spitzenauswahl direkt mit der Feature-Liste , die im rechten Bereich des MZmine-Hauptfensters angezeigt wird. Öffnen Sie die Liste Feature, markieren Sie alle Zeilen, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Anzeigen/XIC (Dialogfeld). Klicken Sie auf Alle , um alle Ionen des Mobilitätsspektrums anzuzeigen. Überprüfen Sie die ausgewählten Peaks, die in Farbe erscheinen, um sicherzustellen, dass es keine offensichtlichen verpassten Peaks gibt.
    5. Trennen Sie die EIMs, um die m/z, die unterschiedliche Spitzen enthalten, in mehrere Features aufzuteilen. Verwenden von Featurelistenmethoden | | zur Merkmalserkennung Entfaltung des Chromatogramms und wählen Sie den Wavelets (ADAP)- Algorithmus. Optimieren Sie den Algorithmus für die Daten mit der Option Vorschau anzeigen und den folgenden Schlüsselparametern: S/N-Schwellenwert, Koeffizienten-/Flächenschwellenwert und RT-Waveletbereich.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, den Aspekt des dekonvolvierten Spektrums zu überprüfen. Verwenden Sie das Chromatogramm-Visualisierungstool, wie in Schritt 4.2.4 beschrieben. Die dekonvolvierten Peaks erscheinen in Farbe, und Peaks der gleichen Masse sollten geteilt werden, wie in Abbildung 6A dargestellt.
    6. Deisotopieren der dekonvolvierten EIMs mithilfe von Feature-Listenmethoden | Isotope | Isotopische Spitzen Zackenbarsch. Verwenden Sie die erwartete Genauigkeit des Instruments für den m/z-Toleranzwert und stellen Sie die Ankunftszeittoleranz auf 0,1 ms ein (in MZmine als Retentionszeittoleranz 0,1 min angezeigt), da Isotope während der IMS-Trennung nicht aufgelöst werden. Überprüfen Sie die Feature-Liste: Wenn Isotope übrig bleiben, erhöhen Sie die Toleranzwerte.
      HINWEIS: Obwohl die Deisotopierung theoretisch zu jedem Zeitpunkt der Feature-Listenverarbeitung durchgeführt werden kann, ist es wichtig, sie zuletzt durchzuführen, damit die Ladewerte exportiert werden können (die für die anderen Schritte verwendeten Algorithmen entfernen manchmal die Ladezustandsinformationen).
  3. Wenn Sie mehrere IMS/IMS-MS-Spektren verarbeiten, wiederholen Sie die Verarbeitung mit diesen optimierten Parametern. Behalten Sie die gleichen Parameter für alle Spektren bei.
  4. Im Falle mehrerer Spektren gruppieren Sie sie in einer einzigen Tabelle, um sie zu exportieren. Wenn nicht, fahren Sie direkt mit Schritt 4.5 fort. Um die Spektren zu gruppieren, verwenden Sie Feature-Listenmethoden | Ausrichtung | Aligner beitreten. Da das Ziel nicht darin besteht, die Spitzen tatsächlich auszurichten, verwenden Sie restriktive Toleranzwerte sowohl für m/z als auch für die Ankunftszeit. Geben Sie beiden Dimensionen das gleiche Gewicht.
  5. Exportieren Sie die endgültige Feature-Liste in eine *.csv-Datei . Verwenden von Featurelistenmethoden | | exportieren/importieren Exportieren Sie in eine CSV-Datei und exportieren Sie die folgenden Werte: Zeile m/z exportieren, Zeilenaufbewahrungszeit exportieren (die tatsächliche IMS-Ankunftszeit), Spitze m/z und Spitzenhöhe. Verwenden Sie ein Komma als Feldtrennzeichen.

5. TWCCSN2 der fokussierten IMS/IMS-Spektren

HINWEIS: In diesem Protokoll wird eine logarithmische Fit-Kalibrierung25,26 verwendet, die tendenziell bessere Ergebnisse liefert als die lineare Kalibrierung und einfach in einer Tabellenkalkulation oder einem internen Verarbeitungsskript implementiert werden kann. Ein internes Skript (geschrieben in R) ist unter der in der Materialtabelle angegebenen URL verfügbar.

  1. Wählen Sie die Referenzwerte für die Ankunftszeit aus der Kalibrantenerfassung aus (siehe Schritt 2.3). Tun Sie dies manuell mit der Konstruktorsoftware (siehe Materialtabelle), um den Aspekt aller IMS-Kalibrantenpeaks zu überprüfen.
    1. Öffnen Sie im Fenster Chromatogramm die _dt. RAW-Datei , die dem Kalibrant entspricht.
    2. Generieren Sie für jeden Kalibrierpunkt den EIM mit dem Display | Massenoption .
    3. Überprüfen Sie das Profil der EIMs. Wenn einige schlecht definiert sind, glätten Sie sie mit dem Process | Option "Glätten" (da die besten Ergebnisse in der Regel mit dem Savitzky-Golay-Algorithmus erzielt werden, glätten Sie 2-mal über 3 Behälter). Melden Sie die Spitzenwerte in einer Tabelle.
      HINWEIS: Da die Referenzpunkte im Allgemeinen mit DTIMS-Geräten mit niedriger Auflösung erfasst werden, können einige multimodale Verteilungen in Cyclic IMS abhängig von den Kalibranten auftreten. Entfernen Sie alle Spitzen, die eine solche Verteilung aufweisen, aus der Kalibrierungsliste.
  2. Berechnen Sie die logarithmischen Anpassungsparameter aus den Kalibern.
    1. Berechnen Sie für alle Kalibrierpunkte Folgendes.
      1. Berechnen Sie die Driftzeit mit Eq (1):
        Equation 1 (1)
        mit td die Driftzeit, tA die gemessene Ankunftszeit und tinj die Zeit der Injektion in die IMS-Zelle (alle in ms).
        HINWEIS: Bei kleinen Molekülen, wie Oligosaccharidfragmenten, liegt die Totzeitvariation (Flugzeit zwischen dem Austritt aus der IMS-Zelle und dem Detektor) zwischen verschiedenen Massen im Fehlerbereich der CCS-Kalibrierung und kann ignoriert werden.
      2. Berechnen Sie die neutrale Masse der Ionen mit Eq (2):
        Equation 2 (2)
        mit z der Ladezustand des Ions und mion die Masse des Gegenions (in Da). Verwenden Sie exakte Massen, um Unsicherheit zu vermeiden. Wenn es einen Atomverlust anstelle eines Gegenions gibt, verwenden Sie negative Mionenwerte (z. B. für [M-H]-mneutral = (m/z) * |z| - (- 1,007276) = (m/z) * |z| + 1,007276). 
      3. Berechnen Sie den CCS-Parameter mit Eq (3):
        Equation 3 (3)
        mit CCS der Referenzdriftrohr DTCCSN2-Wert (in nm2) und mgas die Masse des Treibgases (in Da; z.B. für Stickstoff: mgas = 28,01 Da).
      4. Berechnen Sie den td'-Parameter mit Eq (4):
        Equation 4 (4)
        Mit D wird die Startverzögerung des Detektors experimentell verwendet, um die Totzeit (typischerweise ~ 1,5 ms) zu korrigieren.
      5. Berechnen Sie den Logarithmus der obigen Parameter:
        ln (CCS) und ln (t'd)
    2. Führen Sie eine lineare Regression durch, um den R2-Koeffizienten und die x- und y-Parameter der logarithmischen Anpassung (mit x der Steigung und ln(y) als Schnittpunkt) mit Eq (5) zu bestimmen:
      Equation 5 (5)
      HINWEIS: Der Benutzer kann die ln(CCS') vs ln(td') -Werte plotten, um die Ergebnisse der Kalibrierung visuell zu überprüfen, obwohl dies optional ist.
  3. Wenden Sie die Kalibrierung auf die experimentellen Daten an, um die von MZmine ausgewählten Spitzen für jedes IMS/IMS-Spektrum zu kalibrieren, das in die *.csv-Datei exportiert wird. Berechnen Sie für jeden Punkt Folgendes.
    1. Berechnen Sie die Driftzeit mit Eq (6):
      Equation 6 (6)
      mit tseq die Zeit vor der endgültigen IMS-Trennung (der in Schritt 3.4.6 notierte Wert 'Time Abs').
      HINWEIS: Wenn Sie mehrere IMS/IMS-Spektren kalibrieren, die mit unterschiedlichen Sequenzen aufgenommen wurden, überprüfen Sie die tseq-Werte sorgfältig.
    2. Berechnen Sie die neutrale Masse der Ionen mit Eq (7):
      Equation 7 (7)
    3. Berechnen Sie die Parameter td' und td'' mit Eq (8) und Eq (9):
      Equation 8 (8)
      Equation 9 (9)
    4. Berechnen Sie die endgültigen kalibrierten CCS-Werte (TWCCSN2 in nm2) mit Eq (10):
      Equation 10 (10)
      HINWEIS: Obwohl Schritt 5.2.2. gibt ln(y) als Intercept an, y muss verwendet werden, um den endgültigen CCS-Wert zu erhalten. Vergessen Sie nicht, eine Exponentialfunktion anzuwenden.
  4. Überprüfen Sie die Genauigkeit der Kalibrierung, indem Sie die Kalibrierung auf die zweite Akquisition der in Schritt 2.4 erworbenen Kalibrierlösung anwenden.
    HINWEIS: Die Kalibrierung sollte Ergebnisse mit einem Fehler von ~ 1-2% liefern.

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Representative Results

Ein Arabinoxylanpentasaccharid, XA2XX, wurde als Beispiel ausgewählt, um dieses Protokoll zu veranschaulichen. Diese Verbindung ist im Handel erhältlich, jedoch nur als Mischung mit einem anderen Arabinoxylanpentasaccharid, XA3XX (reines XA3XX ist auch im Handel erhältlich). Die Strukturen von XA2XX und XA3XX sind in Ergänzender Abbildung S1 dargestellt. Da das Verhältnis von XA2XX und XA3XX in der kommerziellen Mischung ~50:50 beträgt, wurde eine Lösung bei 20 μg/ml des Gemisches hergestellt, um eine XA2XX-Konzentration von ~10 μg/ml in 50:50 MeOH/H2O + 500 μM LiCl zu erreichen.

Zunächst wurde eine MS-Analyse des XA2XX + XA3XX Gemisches mit hochauflösendem MS durchgeführt. Da es sich bei den beiden Verbindungen um Isomere handelt, wurde ein einzelner Peak bei [M+Li]+m/z 685,24 beobachtet. Dieser MS-Peak wurde mit dem Quadrupol ausgewählt und das Auswahlfenster angepasst, um das Lithium-Isotop -1 Da zu entfernen, das durch Verarbeitungsalgorithmen fälschlicherweise als Monoisotopen-Peak verwechselt werden könnte (Abbildung 2).

Die [M+Li]+-Addukte der Pentasaccharide wurden dann der ersten Stufe der IMS-Trennung unterzogen: Nach 3 Durchgängen um die zyklische IMS-Zelle wurden 3 Peaks mit Ankunftszeiten von 83, 90 und 94 ms getrennt. Dieses Profil wurde mit dem von reinem XA3XX (infundiert bei 10 μg/ml) verglichen, was zeigt, dass die Peaks bei 83 und 90 ms XA3XX entsprachen, während der Peak bei 94 ms XA2XX entsprach (Abbildung 4A). Der Peak bei 94 ms wurde für die IMS/IMS-Analyse ausgewählt: Die zu XA3XX gehörenden Ionen wurden ausgestoßen (Abbildung 4B), und der Peak of Interest wurde an die Prearray-Speicherzelle gesendet. Nach der erneuten Injektion des Ions ohne Aktivierung wurde eine 3-Pass-Trennung durchgeführt, um sicherzustellen, dass nach der Auswahl nur noch der XA2XX-Peak übrig blieb (in Abbildung 4C bei 199 ms).

Dann wurde das Ion bei der Reinjektion aus dem Wiederherstellungsbereich fragmentiert, und eine Single-Pass-IMS-Trennung wurde an allen Fragmenten durchgeführt. Es wurden zwei verschiedene Aktivierungen ausprobiert: Die maximale Einstellung der integrierten Wiederherstellungsaktivierungsfunktion wurde zuerst ausprobiert (Abbildung 5B,C); Der Vorläufer blieb jedoch der Basisgipfel des Spektrums. Dies ist nicht erwünscht, da für Referenzspektren typischerweise Fragmente unterhalb einer bestimmten Intensitätsschwelle entfernt würden. Daher wurde ein manuell definierter Pre-Array-Gradient → Pre-Array-Bias → Array-Offset-Spannungsgradienten gewählt (Abbildung 5D,E).

Die erzeugten IMS/IMS-MS-Daten wurden mit MZmine 2.51 unter Verwendung der Ankunftszeit und der m/z-Dimensionen (Abbildung 6A) entschlüsselt, um IMS/IMS-Spektren zu erhalten, die nur die Mobilitätsinformationen der Fragmente enthielten. Die Spitzen über 0,2% relativer Intensität wurden für die CCS-Kalibrierung exportiert (die detaillierten MZmine-Parameter sind in der Ergänzungstabelle S1 angegeben). Die CCS-Kalibrierung wurde unter Verwendung der Kalibrierlösung durchgeführt (R2 = 0,995, mittlere absolute Abweichung der Kontrolle = 1,63%, siehe Ergänzende Tabelle S3). Diese Verarbeitung ermöglichte schließlich ein zentriertes, CCS-kalibriertes IMS/IMS-Spektrum (Abbildung 6B).

Figure 1
Abbildung 1: Überblick über den IMS/IMS-Datengenerierungsprozess. Abkürzungen: IMS = Ionenmobilitätsspektrometrie; IMS/IMS = Tandem-IMS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Isotopenmuster einer XA3XX + XA2XX Arabinoxylanpentasaccharidmischung. (A) Gesättigtes Signal ohne DRE; (B) Signalkorrektur mittels DRE mit einer Ionenübertragung von 5 % (d. h. 95 % Dämpfung); und (C) Profil nach Quadrupolauswahl, um den -1 Da Peak zu entfernen, der einem Lithiumisotop entspricht. In Lila: Die Region, in der Artefaktspitzen aufgrund von Sättigung auftreten können, wird 6-mal vergrößert. Abkürzungen: DRE = Dynamic Range Enhancement; MS = Massenspektrometrie; MSMS = Tandem-MS; LM Res = Low-Mass Auflösung; HM Res = hohe Massenauflösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Übersicht über das Steuerelementfenster Cyclic IMS, in dem der Benutzer die IMS/IMS-Sequenz definiert. Die angezeigte Sequenz zeigt, wie die Qualität der Isolierung in IMS/IMS mit einer Auswahl von XA2XX nach 3 Durchgängen überprüft wird (das angezeigte Spektrum entspricht der Einstellung der Selektionsereignisse nach der ersten Trennungsstufe). Die Sequenz besteht darin, eine erste 3-Pass-IMS-Trennung über 58 ms auszuführen, dann die beiden schnelleren Isoformen aus der IMS-Zelle (Segment 3) auszuwerfen, die langsamere Isoform (ATD zwischen 92 und 96 ms) in der Vorratseinheit (Segment 4) auszustoßen, sie ohne Aktivierung wieder in die IMS-Zelle einzuschleusen (Segment 6), so dass die Ionen eine weitere 3-Pass-Trennung (58 ms) (Segment 7) durchlaufen können. dann das Auswerfen von Ionen aus der IMS-Zelle und das Erfassen von Daten (Segment 8). Abkürzungen: IMS = Ionenmobilitätsspektrometrie; cIMS = zyklisches IMS; IMS/IMS = Tandem-IMS; ADC = Analog-Digital-Wandler; TW = Wanderwelle; PE = potentielle Energie; ATD = Verteilung der Ankunftszeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Auswahl von XA2XX aus der Mischung von XA2XX und XA3XX. (A) Abtrennung der Arabinoxylanpentasaccharide, XA3XX und XA2XX, nach 3 Durchgängen (entsprechend einer auf 58 ms festgelegten Abscheidezeit) um die zyklische IMS-Zelle. (B) Bruchteil, der direkt nach der ersten Stufe der IMS-Trennung ausgeworfen wird. (C) Für IMS/IMS gewählte Fraktion, bei der nach der Reinjektion eine weitere 3-Gang-Trennung durchgeführt wurde. Der XA2XX Peak of Interest ist grau hervorgehoben. Die Ionenmobilitätsspektren werden in Datenbehältern dargestellt und mit ihrer Ankunftszeit (ms) annotiert. Abkürzungen: IMS = Ionenmobilitätsspektrometrie; IMS/IMS = Tandem-IMS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Prinzipien der kollisionsinduzierten Dissoziation unter Verwendung des Prearray-Speicherbereichs. (A) Schaltpläne des Multifunktions-Array-Bereichs mit Angabe der wichtigsten Spannungen (in rot), die für die Auswahl, die Reinjektion und die Aktivierung während IMS/IMS-Experimenten verwendet werden. Die blauen Pfeile zeigen die Richtung der Wanderwelle im Multifunktionsarray an. (B, C) IMS/IMS- und MS/MS-Spektren, die für XA2XX mit der integrierten Wiederherstellungsaktivierungsfunktion (+150 V) erhalten wurden. Der Farbbalken stellt die Ionenintensitätsskala dar (blau = niedrig; rot = hoch). (D, E) IMS/IMS- und MS/MS-Spektren für XA2XX mit manueller Optimierung der Spannungen (Prearray-Gradient 195 V, Prearray-Bias 180 V, Array-Offset -10 V). Vorläuferionen sind durch Sternchen auf den Spektren gekennzeichnet. Die Ionenmobilitätsspektren werden in Datenbehältern dargestellt und mit ihrer Ankunftszeit (ms) annotiert. Abkürzungen: IMS = Ionenmobilitätsspektrometrie; IMS/IMS = Tandem-IMS; TOF = Flugzeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Darstellung der Verarbeitungsschritte. Ergebnisse von (A) der MZmine Peak Picking und (B) der CCS-Kalibrierung von Arabinoxylanpentasaccharid XA2XX. A zeigt die Massenentfaltung des IMS/IMS-Spektrums durch einen Farbcode. B zeigt das endgültige IMS/IMS-Spektrum nach dem Zentroiden und der CCS-Kalibrierung. Abkürzungen: IMS = Ionenmobilitätsspektrometrie; IMS/IMS = Tandem-IMS; CCS = Kollisionsquerschnitt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Ein Vergleich zweier IMS/IMS-Spektren von XA2XX veranschaulicht die Reproduzierbarkeit der Methode. Das endgültige kalibrierte Spektrum aus diesem Artikel (oben) wird mit dem Spektrum aus der Arbeit von Ollivier et al. verglichen. 21 (unten, umgedreht). Abkürzungen: IMS = Ionenmobilitätsspektrometrie; IMS/IMS = Tandem-IMS; CCS = Kollisionsquerschnitt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung S1: Strukturen der Arabinoxylanpentasaccharide XA2XX und XA3XX. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Bewertung der Interday-Wiederholbarkeit mit XA2XX. IMS/IMS-Akquisitionen wurden an Tag 1 (oben) und Tag 95 (unten) wiederholt. Abkürzungen: IMS = Ionenmobilitätsspektrometrie; IMS/IMS = Tandem-IMS. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S1: Detaillierte MZmine-Parameter. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S2: Geräteparameter geändert, um die Reproduzierbarkeit zu bewerten. Abkürzung: ESI = electrospray ionization. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S3: Steuerung der CCS-Kalibrierung mittels einer zweiten Erfassung der Kalibrierlösung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Das zyklische IMS der SELECT-SERIE ist ein leistungsstarkes Werkzeug, mit dem eine definierte Ionenpopulation – einer gegebenen m/z- und Ionenmobilität – ausgewählt werden kann, ohne dass eine chromatographische Trennung im Vorfeld erforderlich ist. Das Instrument bietet die Möglichkeit, eine zweidimensionale Fragmentierungskarte dieser Ionenpopulation zu erzeugen, aus der sowohl MS/MS- als auch IMS/IMS-Spektren extrahiert werden können. Der Benutzer muss jedoch mehrere kritische Punkte beachten, die während des experimentellen Prozesses Aufmerksamkeit erfordern.

Zunächst sollte der Benutzer das MS-Isolationsfenster sorgfältig auf das Vorhandensein möglicher isobarer Verunreinigungen überprüfen. Tatsächlich ist das Isolationsfenster eines Quadrupols relativ breit, und die Kenntnis von Ionen eines etwas anderen m / z, die im Quadrupol koselektiert werden können, wird dem Benutzer helfen, den Höhepunkt des Interesses an der Ionenmobilität richtig zuzuordnen.

Zweitens muss der Benutzer bei der Durchführung der anfänglichen Trennung sicherstellen, dass alle Ionen die gleiche Anzahl von Durchgängen um die zyklische Ionenmobilitätszelle durchlaufen. Dies ist ein wichtiger und kniffliger Aspekt der Trennung der Ionenmobilität in einem zyklischen Gerät. Eine fehlerhafte Bewertung der Anzahl der Durchgänge für ein gegebenes Ion kann zu einer unsachgemäßen Identifizierung und Interpretation der Peaks führen. Die Kontrolle der Anzahl der Durchgänge verschiedener Ionenpopulationen kann aufgrund der relativ kurzen Einzeldurchgangslänge (~ 1 m) schwierig sein, und Arten mit sehr unterschiedlichen Beweglichkeiten können sich schnell überlappen.

Insbesondere kann sich ein Peak zwischen zwei verschiedenen Durchgängen aufteilen, wenn das Array die Richtung wechselt, wenn diese Ionenpopulation durchläuft (dies ist relativ einfach zu identifizieren: Der Split-Peak erscheint mit einer Population gleich zu Beginn des Eject and Acquiring-Ereignisses schärfer ). Um die Anzahl der Durchläufe richtig einzustellen, sollte der Benutzer mit einer kurzen Trennungszeit (1-5 ms) beginnen, die das 1-Pass-Profil ergibt. Dann sollte der Benutzer die Trennungszeit schrittweise erhöhen, bis die gesamte Bevölkerung zu höheren Ankunftszeiten übergegangen ist, was das 2-Pass-Profil ergibt. Das 2-Pass-Profil sollte dem 1-Pass-Profil ähneln, jedoch mit besser aufgelösten Spitzen. Die Zeit, die eine gegebene Ionenpopulation benötigt, um einen Durchgang um die zyklische Zelle zu machen, ist eine Konstante, die der Benutzer verwenden kann, um die Anzahl der Durchgänge als Funktion der Trennzeit zu berechnen. Wenn es beispielsweise einen Unterschied von 10 ms zwischen dem ersten und zweiten Durchgang gibt, gibt es auch einen Unterschied von 10 ms zwischen dem zweiten und dem dritten.

Drittens sollte der Benutzer während der IMS-Auswahlphase die Qualität der Isolierung sorgfältig überprüfen, wie in Abbildung 4 dargestellt. Es ist besonders wichtig, das reinjizierte Profil zu überprüfen, da der Auswurf der anderen Populationen möglicherweise nicht vollständig ist, wenn die TW-Höhen- und Geschwindigkeitseinstellungen zu niedrig sind. Fortgeschrittene Benutzer können dies korrigieren, indem sie die Driftcell RF-Hochfrequenzspannung auf der Registerkarte RF der Tune-Seite einstellen.

Viertens sollte der Benutzer bei der Erzeugung des Fragmentierungsspektrums und insbesondere bei der Auswahl der geeigneten Kollisionsenergie vorsichtig sein, insbesondere wenn die Spannungen manuell eingestellt werden. In der Tat kann eine übermäßige Senkung der Array-Offset-Spannung die Gesamtionenintensität negativ beeinflussen, indem sie die Reinjektion behindert. Darüber hinaus können sich der Vorläufer und die Fragmente über eine breite Palette von Mobilitäten erstrecken. Daher durchlaufen sie schnell eine unterschiedliche Anzahl von Durchgängen, wenn die endgültige Trennungszeit hoch ist, daher ist es wichtig, ein separates Ereignis von 1 ms beizubehalten, wie in Protokollschritt 2.3.3 erläutert. Dies ist eine große Einschränkung, da die Single-Pass-Länge relativ kurz ist und das Single-Pass-Auflösungsvermögen für Oligosaccharide27 auf ~ 100 begrenzt. In dieser Hinsicht wäre eine erhöhte Weglänge in einem einzigen Durchgang von Vorteil (d.h. die TWIMS-basierten Strukturen für verlustfreie Ionenmanipulation oder SLIM, mit einer Weglänge von 13 m28). Das SLIM-Setup wurde erst vor kurzem kommerziell eingeführt29.

Schließlich sollte der Benutzer bei der Definition des endgültigen Erfassungsmobilitätsbereichs mit dem Befehl Pushes per bin vorsichtig sein, insbesondere wenn er an mehrfach geladenen Ionen arbeitet. Die Ionenmobilität ist in der Tat eine Funktion der Ladung12, und beispielsweise sind einzeln geladene Fragmente, die aus einem doppelt geladenen Vorläufer erzeugt werden, wahrscheinlich langsamer als der Vorläufer (obwohl es sich um kleinere Verbindungen handelt).

Eine wesentliche Einschränkung der ausschließlichen Verwendung von MS- und IMS-Trennungen zur Auswahl des Vorläufers (und nicht beispielsweise eines vorgelagerten Schritts der Chromatographie) besteht darin, dass ein gegebenes m/z mehrere Peaks in IMS ergeben kann und dass mehrere Peaks von derselben Verbindung stammen können. Dies wird durch die Verteilungen von m/z 685.2 sowohl für das XA2XX+XA3XX-Gemisch als auch für das reine XA3XX in Abbildung 4A veranschaulicht. Multimodale IMS-Verteilungen eines einzelnen m/z ergeben sich aus unterschiedlichen Gasphasenkonformationen. Bei Spezies, die als Kationenaddukte (im positiven Modus) analysiert werden, ergeben sich die unterschiedlichen Konformationen möglicherweise aus Unterschieden in der Koordination mit dem Gegenion30,31,32.

Für Oligosaccharide können sie auch aus der Trennung von Reducing-End-Anomeren entstehen, obwohl die Trennung von Reducing-End-Anomeren typischerweise ein höheres IMS-Auflösungsvermögen erfordert als das, was hier verwendet wird33,34,35. Im vorliegenden Fall ergibt sich die multimodale IMS-Verteilung in Abbildung 4A zum Teil aus den einzelnen Beiträgen von XA2XX und XA3XX. Es ist jedoch bemerkenswert, dass XA3XX zwei Peaks liefert, die wahrscheinlich Kationenkoordinationskonformisten sind. Es war leicht zu identifizieren, welcher Peak XA2XX entsprach (d.h. die Art von Interesse), da reines XA3XX im Handel erhältlich ist und sein Mobilitätsprofil separat aufgezeichnet werden konnte. Um an komplexen Gemischen wie biologischen Medien zu arbeiten, kann es wichtig sein, die Zugabe einer chromatographischen Trennstufe in Betracht zu ziehen.

Zwei Punkte müssen in Bezug auf den Verarbeitungsworkflow beachtet werden, der verwendet wird, um massenzerklüftete IMS / IMS-Spektren zu erhalten. Erstens wird in diesem Protokoll vorgeschlagen, MZmine 224 zu verwenden, um das IMS/IMS-Spektrum unter Verwendung der MS-Dimension zu dekonvolvieren, und insbesondere den ADAP-Algorithmus36 zu verwenden, um die EIMs in verschiedene Spitzen aufzuteilen. Obwohl er recht gute Ergebnisse liefert, wie in Abbildung 6 dargestellt, wurde der ADAP-Algorithmus für chromatographische Analysen entwickelt und berücksichtigt somit Asymmetriefaktoren, die der Flüssigphasenchromatographie innewohnen, wie z. B. Peak-Tailing. Daher kann der ADAP-Algorithmus dazu führen, dass einige der Features nicht identifiziert werden, wenn er auf IMS-Spitzen (z. B. Schultern) angewendet wird. Im Wesentlichen sind IMS-Daten einfacher als chromatographische Daten: Da es keine chemische Wechselwirkung der Verbindungen mit einer Spalte gibt, wird erwartet, dass IMS-Daten, die unter geeigneten Bedingungen (d. h. ohne Sättigung der IMS-Zelle) erfasst werden, Gauß-Verteilungen folgen37,38. Im Idealfall sollte der ADAP-Dekonvolutionsschritt am besten durch eine Gaußsche Anpassungsfunktion ersetzt werden, wie sie von für IMS bestimmte Software wie CUISuite 239 verwendet wird. So wie es aussieht, wurde die Gaußsche Dekonvolution jedoch nicht direkt an die vollständige Behandlungskette angepasst, die in diesem Protokoll beschrieben wird. Daher schien die Verwendung der kostenlosen Open-Source-Software MZmine ein guter Kompromiss für Endbenutzer zu sein.

Der zweite Teil der Verarbeitung, der eine Diskussion rechtfertigt, ist die CCS-Kalibrierung. Dieses Protokoll schlägt die Verwendung einer logarithmischen Passungskalibrierung25,26 und einer handelsüblichen Kalibrantmischung vom selben Anbieter wie das Spektrometer vor (siehe Materialtabelle). Dieses Verfahren ist am einfachsten im Labor zu implementieren. In Bezug auf die Wahl der Kalibrantenmischung sollte der Benutzer berücksichtigen, dass, wie in mehreren Studien erwähnt, die Genauigkeit der CCS-Kalibrierung verbessert wird, wenn Kalibranten derselben molekularen Klasse und desselben Ladungszustands wie der Analyt verwendet werden26,40,41. Der Fehler, der bei der Kalibrierung mit relativ ähnlichen Arten von Verbindungen (z. B. Kohlenhydrate vs. Peptide) auftritt, ist moderat. Es wird jedoch empfohlen, bei der Messung von Kohlenhydraten keine sehr unterschiedlichen Ionen zu verwenden, wie z.B. die Verwendung von Salzclustern als Kalibranten41. In Bezug auf die Wahl der Kalibrierungsmethode berichteten Richardson et al.42 kürzlich über eine neue Kalibriermethode, die die Physik von TWIMS berücksichtigt, um die Genauigkeit der Kalibrierung zu verbessern (mit einer mitgelieferten Software). Der Ansatz erfordert jedoch die Bewertung hochspezifischer Parameter durch die Analyse verschiedener Arten von Verbindungen - von Metaboliten bis hin zu nativen Proteinen. Da keine Mischung einer solchen Vielfalt von Verbindungen kommerziell gefunden werden kann, wurde diese Methode im vorliegenden Protokoll nicht implementiert.

Um schließlich die Reproduzierbarkeit der Methode zu bewerten, bewerteten wir die Reproduzierbarkeit zwischen den Tagen, indem wir die IMS/IMS-MS-Erfassung an Tag 1 und Tag 95 wiederholten (Ergänzende Abbildung S2). Das Experiment zeigte, dass IMS/IMS-MS-Daten in hohem Maße reproduzierbar sind, ohne dass sich der IMS-Spitzen über diesen längeren Zeitraum um mehr als 0,2 ms verschiebt. Das IMS/IMS-Spektrum, das in dieser Arbeit erzeugt wurde, wurde weiter mit einem anderen Spektrum von XA2XX verglichen, das unter anderen Bedingungen für frühere Arbeiten zur Ionenmobilitäts-molekularen Vernetzung21 aufgenommen wurde. Einige instrumentelle Parameter, die sich auf die Ionenstruktur und das Ionenmobilitätsprofil auswirken können13, wurden absichtlich geändert – die Quellparameter und der Aktivierungsspannungsgradient (ein Vergleich der unterschiedlichen instrumentellen Bedingungen ist in der Ergänzenden Tabelle S2 enthalten). Dann wurden die beiden Spektren unter Verwendung des Kosinus-Ähnlichkeitswerts – der für den Vergleich von MS/MS-Spektren in der Metabolomik beliebt ist – auf der BSPS-Plattform5 verglichen (CCS-Toleranz für übereinstimmende Fragmente = 0,015 nm2).

Der Vergleich ergab einen Kosinus-Ähnlichkeitswert von 0,87 (Abbildung 7), der in Bezug auf die wichtigen instrumentellen Variationen als hoch angesehen werden kann. Dies führt zu der Idee, dass IMS/IMS-Spektralbibliotheken verwendet werden könnten, um Glykane in komplexen Gemischen mit einem hohen Maß an Konfidenzgrad zu deplizieren, was bei MS/MS-Spektren nicht der Fall wäre. Beachten Sie, dass, obwohl der aktuelle Ansatz nur die CCS-Dimension des Fragmentierungsspektrums verwendet, die IMS/IMS-MS-Daten auch MS-Informationen enthalten, die mit dem CCS nicht redundant sind. Um die dereplizierbare Leistungsfähigkeit von IMS/IMS zu optimieren, muss ein zweidimensionales Scoring-System entwickelt werden.

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Disclosures

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Acknowledgments

S.O. dankt der französischen National Research Agency für die Finanzierung seines Ph.D. (Grant ANR-18-CE29-0006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-α-L- plus 23-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XAXXMIX XA2XX + XA3XX mixture
33-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX) Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XA3XX Pure XA3XX standard
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes Eppendorf, Hamburg, Germany 0030120086 Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution
FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm Corning Science México S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico 352070 Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl
Lithium Chloride (ACS reagent, ≥99 %) Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France 310468 Used to dope the sample with lithium
Major Mix IMS/Tof Calibration Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 186008113 Calibration solution for MS and IMS
MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9) Waters Corp., Wilmslow, UK 721022377 Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing
Methanol for HPLC PLUS Gradient grade Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France 412383 High-purity solvent
MS Leucine Enkephaline Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 700002456 Reference compound used for tuning of the mass spectrometer
SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US 218012458 Used to prepare the solution of 500 µM LiCl in 50:50 MeOH/Water
SELECT SERIES Cyclic IMS Waters Corp., Wilmslow, UK 186009432 Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell
Website: http://mzmine.github.io/ MZmine Development Team - Link to download the MZmine software
Website: https://github.com/siollivier/IM-MN INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France - Link to an in-house R script containing a CCS calibration function

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Chemie Ausgabe 179
Verwendung eines zyklischen Ionenmobilitätsspektrometers für Tandemionen-Mobilitätsexperimente
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Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments. J. Vis. Exp. (179), e63451, doi:10.3791/63451 (2022).

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