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Neuroscience

扩展轴突转运体内成像工具包

Published: December 23, 2021 doi: 10.3791/63471
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology, University College London, 2UCL Queen Square Motor Neuron Disease Centre, University College London, 3UK Dementia Research Institute, University College London

Summary

使用转基因荧光小鼠，描述了详细的方案，以评估活体动物完整坐骨神经的运动和感觉轴突内信号内体和线粒体的 体内 轴突转运。

Abstract

轴突转运通过实现各种细胞器和货物的双向运输来维持神经元稳态。轴突运输的中断对单个神经元及其网络具有破坏性后果，并导致过多的神经系统疾病。由于其中许多情况涉及细胞自主和非自主机制，并且通常显示跨神经元亚型的病理学谱，因此准确识别和分析神经元亚群的方法势在必行。

本文详细介绍了评估麻醉小鼠坐骨神经中信号内体和线粒体的 体内 轴突转运方案。提供逐步说明，以1）通过使用在胆碱能运动神经元内选择性表达荧光蛋白的小鼠， 在体内，原位 和 离体 区分运动神经元和感觉神经元;2）单独或同时评估信号内体和线粒体的 体内 轴突转运。这些互补的活体内方法有助于同时对不同周围神经轴突中的不同货物进行成像，以定量监测健康和疾病中的轴突转运。

Introduction

周围神经系统（PNS）将中枢神经系统（CNS）连接到其远端目标，允许传出信号的中继施加运动控制，传入信号提供感觉反馈。利用小鼠遗传学的大量进展，科学家们开发了不同的小鼠模型来研究折磨PNS1，2，3的许多疾病/综合征。由于大多数神经退行性疾病是多因素的，细胞自主和非自主贡献4，5，解开细胞/神经元特异性病理学可以为疾病机制提供关键的，新颖的见解。

为此，细菌人工染色体（BAC）转基因小鼠6 的发育使得荧光蛋白在神经元的靶向亚群中的选择性内源性表达成为可能。例如，BAC转基因小鼠可用，其在胆碱能7 或甘氨酸能神经元8中表达绿色荧光蛋白（GFP），或在小白蛋白阳性神经元9中表达变异红色荧光蛋白（tdTomato）。或者，荧光蛋白的选择性神经元表达可以通过Cre-loxP 技术10来实现。例如，在神经元亚群（例如，胆碱乙酰转移酶（ChAT）-Cre）中表达Cre-重组酶的小鼠菌株可以与表达荧光蛋白（例如，tdTomato或GFP）的小鼠一起繁殖，这些小鼠来自构成位点（例如，Gt（ROSA）26Sor），在loxP位点11 两侧的转录抑制因子的控制下（例如，产生仅在胆碱能神经元中表达tdTomato的小鼠）。事实上，使用Cre-loxP重组，已经产生了在下降皮质脊髓束12的轴突中表达黄色荧光蛋白的转基因小鼠。

此外，CRISPR / Cas9基因编辑的最新进展，如ORANGE，能够对多种内源性神经元蛋白进行荧光标记，其表达可以在纳米级分辨率13下实现。此外，与表达Cree的小鼠菌株结合使用，ORANGE-CAKE可用于标记单个神经元中的多种内源性蛋白质13。或者，病毒介导的神经元示踪也允许标记神经元亚群，并且可以通过病毒血清型和/或细胞特异性启动子14，15，16，17的靶向组合来实现。

除了神经元标记方法之外，小鼠品系还被设计成表达靶向特定细胞器的报告蛋白，例如表达青色荧光蛋白（Mito.CFP）18 的线粒体或表达GFP（LC3.GFP）19的自噬体。此外，已经设计了小鼠系来评估神经元中的钙动力学（例如， Thy1.GCaMP）20，21。总而言之，随着这些模型的进步，新的实验应用使科学家能够提出有关CNS和PNS的更精确的生物学和病理学问题。

周围运动神经的主要作用是将电信号传递到骨骼肌以引发运动。此外，并且以各种细胞器（例如，线粒体、内溶酶体、信号内体）的形式在较长的时间尺度上发生，神经化学和生理信息以单向或双向方式穿过细胞骨架网络，以帮助维持神经元稳态22、23、24。轴突转运的损伤对神经元健康具有灾难性后果，并且与许多神经发育和神经退行性疾病有关25.在分子水平上，轴突转运的损伤可以破坏调节突触信号传导和可塑性的生理事件，基因转录和整个轴突26，27的局部翻译。虽然有许多工具可以研究培养细胞/神经元中的这些事件28，29， 但需要评估 体内 轴突运输动力学和轴突相关的生物事件来确认对生理和病理过程的关键见解30。

多年来，Schiavo实验室优化了协议，以询问有关轴突运输31，32，33，34，35，36的各种问题。这些实验已经从发现荧光标记的破伤风神经毒素（HCT）的毒性片段通过与nidogens和多鞭毛胶苷脂的相互作用内化到骨骼肌的轴突末端37扩展。一旦内化，HCT逆行运输在Rab7阳性，含神经营养蛋白的信号内体中，这些内体被运往运动和感觉神经元的细胞体38，39，40，41。与此同时，成像技术的进步使得能够实时分析活的麻醉小鼠30中的周围神经束和单个轴突。首次尝试评估病理学中的体内轴突转运动力学，揭示了肌萎缩性侧索硬化症（ALS）35的SOD1G93A小鼠模型中信号内体和线粒体的转运的症状前损伤。重要的是，这些缺陷不太可能仅仅代表神经变性的次要后果，因为发现在肯尼迪病42的小鼠模型和ALS43的杂合突变FUS模型中，运动神经元丢失可以在没有轴突转运扰动的情况下发生。这种轴突转运缺陷可以使用特异性激酶33或生长因子受体34的抑制剂在ALS小鼠中补救。此外，用特定的组蛋白去乙酰化酶阻滞剂治疗神经元会改变体内线粒体转运36。最近，我们报告说，在ALS小鼠44的不同运动神经元亚型中，轴突转运的BDNF依赖性调节失调。

通过使用不断扩展的工具包来评估轴突传递动力学28，29，该视频协议概述了几个应用程序，这些应用程序将允许进一步了解不同的生物学和病理场景。首先，在胆碱能神经元（即运动神经元 ）中选择性表达荧光蛋白的转基因小鼠用于 区分体内 和 离体的运动和感觉轴突。然后将荧光标记的HCT加载到三个转基因系的信号内体中，以区分不同外周神经元中的轴突转运动力学。下一个实验方案详细介绍了一种多重荧光方法，该方法通过将ChAT.tdTomato小鼠与水母-CFP小鼠繁殖来评估运动神经元中的线粒体转运。最后，提供了有关如何 在体内同时对同一轴突内的线粒体和信号内体进行成像的说明。

Protocol

所有小鼠处理和实验均根据“动物（科学程序）法”（1986年）进行，并得到伦敦大学学院 - 皇后广场神经病学伦理委员会的批准。

1. 动物

  1. 将所有动物关在温度和湿度受控的环境中，将所有动物关在单独通风的笼子里，并保持它们处于12小时的光/暗循环中 ，随意 获得食物和水。
  2. 使用以下转基因菌株的雄性和雌性小鼠：1）杂合Tg（Chat-EGFP）GH293Gat / 母细胞小鼠，称为ChAT.eGFP小鼠;2）杂合子 B6.Cg-Tg（Hlxb9-GFP）1千兆焦耳/日，简称HB9。全氟化物小鼠;3）杂合子 B6.Cg-Tg（Thy1-CFP / COX8A）S2Lich / J，称为水户CFP小鼠。
  3. 通过将纯合子B6;129S6-Chat tm2（克雷）低/J（称为ChAT.Cre小鼠）与纯合子 B6.Cg-gt（ROSA）26或tm9（CAG-td多马托）Hze / J（称为罗莎26.td多马托小鼠）杂交来生成ChAT.td多马托小鼠。
  4. 通过将杂合子切阿托小鼠与杂合子水合子CFP小鼠杂交来生成咔嚓咔

2. 肌内注射 荧光HCT

  1. 术前准备
    1. 表达HCT（HCT441，残基875-1315）在细菌中融合到改良的富含半胱氨酸的标签上，作为谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白，如45。用AlexaFlour555 C2马来酰亚胺31标记H CT，将其透析到冰冷透析缓冲液（10mM HEPES-NaOH，100mM NaCl，pH 7.4）中，将其冷冻在液氮中，并将其储存在-80°C。 在进行体内实验之前，首先在体外测试HCT，以便在原代神经元中成功摄取和转运。
    2. 将荧光 HCT（例如 HCT-555）稀释至最终且实验上一致的浓度，范围为 2.5 至 10 μg/μL，装在 0.2 mL 管中的无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。在此步骤中，如果需要，向HCT溶液中添加更多的化合物/因子（例如，脑源性神经营养因子）。
      注意：最终体积必须适合感兴趣的肌肉的大小。例如，为胫骨前肌（TA）准备3-4μL的注射体积，为较小的比目鱼肌准备〜1μL的注射量。无论最终体积如何，HCT的工作浓度保持在2.5至10μg/μL之间。
    3. 使用移液器或涡流混合HCT溶液，并使用台式离心机以低速短暂旋转以收集液体并除去大气泡。保护HCT免受光照并在冰上运输。
    4. 使用拉制的玻璃微量移液管，以最佳方式肌内注射到较小的肌肉（例如，负极子）或用于坐骨神经内注射。手术前拉式玻璃微量移液器（按 46）。
      注意：为了能够移液并限制从微量移液器背面向上和流出的流量，请在解剖显微镜下使用细镊子小心地从尖锐的尖端上脱落一小块。注意将破损的一端丢弃在适当的垃圾箱中。
    5. 使用前消毒并清洁所有手术工具。
  2. 手术-肌内注射
    1. 通过将无菌手术窗帘固定在设置为37°C的热垫上，为手术做准备。 定位和聚焦手术显微镜。要开始手术，请将预灭菌手术工具，手术胶带，无菌棉签，70%（v / v）乙醇在水中，无菌盐水，缝合线和汉密尔顿针或拉玻璃微量移液器打开到手术悬垂物上。
    2. 确保麻醉机在外科手术期间有足够的氧气和异氟醚。将麻醉液流引导至诱导室并打开麻醉机。
      1. 首先，使用1-2 L / min的氧气流速和5%异氟醚。将鼠标置于诱导室中以启动麻醉。当矫正反射消失时，将麻醉降低至2-3%异氟醚，将麻醉液流向烟嘴，并将鼠标转移到位于手术空间单独区域的烟嘴上。
    3. 在剃除覆盖要注射的肌肉的毛皮区域之前，确保角膜和踏板退出反射均不存在。完成后，使用手术胶带的粘性一面从鼠标中取出尽可能多的剃须毛皮，并将鼠标放在秤上以记录其手术前的重量。
    4. 使用棉签小心涂抹眼部润滑剂，并将鼠标和烟嘴转移到手术区域。
      注意：尽量限制也转移到手术区域的剃须毛皮的数量。使用手术胶带将头部固定在烟嘴上，以防止鼠标滑出。使用单独的棉签，将乙醇涂抹在剃须区域，以消毒并减少毛皮污染。
    5. 根据要注射的肌肉定位身体。例如，对于 TA，将鼠标放在其背面，并在距中线约 10° 处伸展后肢。或者，对于负鼠注射，将动物侧放，并从中线向后肢伸出约45°。当后肢处于正确位置时，在脚上使用手术胶带，以防止手术过程中不必要的移动。
      注意：TA，腓肠肌和足底肌的注射程序之前已经详细介绍过32。
    6. 在切口之前，通过测试踏板戒断反射来确认麻醉是否足够。持续监测麻醉并在整个外科手术过程中保持麻醉，并定期评估呼吸和戒断反射。
    7. 此时，将工作中的HCT溶液吸入汉密尔顿注射器或拉出的玻璃微量移液器中。
    8. 在与运动端板区域46，47，48相对应的区域的感兴趣肌肉上做一个小切口。刺穿肌肉上的外部筋膜，并按照32缓慢注射HCT。将注射器/微量移液器保持在原位5-10秒，然后慢慢取出。
    9. 用1-2个缝合线关闭切口，并将小鼠转移到隔离的恢复笼中。手术后监测小鼠至少30分钟，然后将其放回家中笼子。当小鼠成功恢复并且手术后监测完成后，将笼子恢复到正常的外壳状态。

3. 体内轴突转运

  1. 暴露坐骨神经
    1. 在成像前至少1小时将显微镜环境室设置为37°C。
    2. 通过在手术区域周围安排手术窗帘，工具，胶带，无菌棉签，70%乙醇和无菌盐水，准备暴露坐骨神经。确保麻醉机有足够的氧气和异氟醚储存，每只小鼠长达2小时。通过将石蜡膜或不可见的胶带切割成一个狭窄的矩形（例如，对于较大的小鼠，宽度约为1厘米），并带有倾斜的尖端并将其放置在暴露的坐骨神经下方以辅助成像过程，从而从石蜡膜或不可见的胶带中创建楔块。将感应室放在热垫的顶部，并将其设置为体温。
      注意：四个小时是HCT被吸收并逆行从注射部位输送到坐骨神经的足够时间;因此，在此时间之后，可以准备一只小鼠进行重新麻醉。
    3. 将麻醉液的流动引导到诱导室中，打开氧气流速为1-2 L / min和3-4%异氟醚的麻醉机，并将小鼠置于诱导室中以启动麻醉。
      注意：由于 体内 轴突转运实验是一个终端程序，因此不需要润滑眼睛。
    4. 当右转反射消失时，将麻醉降低至2-3%异氟醚，将麻醉液流向烟嘴，并将鼠标转移到烟嘴。使用手术胶带将头部固定在烟嘴上，将目标后肢从中线伸出约45°，并在脚上使用手术胶带以保持此位置。
      注意：此时减少麻醉是有利的，因为它可以限制成像过程中呼吸伪影的影响。
    5. 确保角膜和踏板的退出反射不存在，然后用剪刀切除坐骨神经32 上覆的皮肤（即，从中央脊髓延伸到后肢中下部的大面积）。切除上覆的股二头肌，以及坐骨神经附近的任何其他肌肉组织和结缔组织。避免损伤坐骨神经和周围血管，特别是那些位于腓肠外侧/腓肠肌外侧近端的血管。
    6. 当完整的坐骨神经充分暴露时，将预热的无菌盐水涂抹在坐骨神经周围的区域以防止干燥。使用弯曲的镊子破坏深部结缔组织，并将预先准备好的石蜡膜“楔子”置于神经下方。完成后，将盐水浸泡的棉絮放在暴露区域，并将鼠标移动到位于热垫顶部的感应室（设置为37°C），其仍应填充O2中的异氟醚。
  2. In vivo 轴突成像
    1. 将22 x 64 mm盖玻片放在定制的显微镜载物台上，并用胶带固定其位置。选择并将浸入油涂在物镜上，然后将显微镜载物台连接到倒置显微镜。慢慢抬起油浸式物镜，直到油和盖玻片接触。
      注意：40倍、1.3数值孔径（NA）DIC平复消色差或63倍、1.4 NA DIC平复消色差油浸式物镜都可用于对坐骨神经 中的体内 转运进行成像。
    2. 将麻醉吹嘴移动到显微镜载物台上，并用胶带固定麻醉软管，以防止对麻醉的干扰。从坐骨神经中取出棉絮，并将鼠标从感应室转移到吹嘴，暴露的神经朝向盖玻片。使用手术胶带确保将小鼠的头部固定在烟嘴上，并保持最低，有效的麻醉水平。轻轻抬起鼠标尾巴，向暴露的坐骨神经附近的盖玻片上加入无菌盐水，以限制干燥并帮助成像。
      注意：关闭环境室的所有门，以确保该区域保持在体温。
    3. 使用眼球，定位坐骨神经，确定最佳焦点，并选择含有运动轴突细胞器的感兴趣区域。
      注：此过程的详细说明已在前面32 中描述过。
    4. 通过单击“ 获取 ”按钮（或等效项）切换到计算机软件，然后选择感兴趣的区域。使用数字变焦获得总共>80倍的放大倍率，并旋转所选区域以水平显示轴突（例如，从右向左移动逆行货物和从左向右移动顺行货物）。
      注意：方向性参数取决于用户，但在整个实验过程中必须保持一致。
    5. 通过调整激光强度 （0.2 - 1%）、针孔孔径（1 AU - 最大值）、增益（主）（700 - 1000）、数字偏移 （-50 - 0） 和数字增益 （1.0 - 4.0） 等参数来优化信号强度。为了减少光毒性的潜在影响，请尽可能将激光强度保持在≤1%，最大激光强度为2%。在调整激光强度以获得最佳信号检测之前，请更改所有其他参数。
    6. 点按“ 区域 ”框（或等效区域），选择感兴趣的矩形区域，然后在 “采集模式 ”（或等效）中，将 帧大小 设置为最小 1024 x 1024 像素，然后开始对 100-1，000 帧进行延时采集。
      注意：所需的帧采集速率取决于用户（例如，传输速率可以在0.1到6秒之间进行评估），并且可以使用软件参数进行调整，例如 感兴趣区域、扫描速度时间、采集平均和 激光方向性。例如，要获得较慢的帧速率，请增加感兴趣区域的高度/宽度，获取较慢的扫描速度，增加采集平均值，并使用单激光定向性， 反之亦然 以获得更快的帧速率。 帧采集速率 必须在可比较数据集之间保持一致，因为不同频率的成像可能会导致不一致。快速货物（如信号内体）需要更快的帧速率（例如0.1-3 s），而较慢的细胞器（如线粒体）可以使用较慢的速率（例如2.5-6 s）进行分析。
    7. 目标是从每只小鼠至少三个轴突中捕获至少10个运动货物。
      注：根据双样本双侧幂计算（标准幂为0.8（1−β），I型错误率为5%（α）），样本数量6-8足以识别野生型和疾病模型35，43之间的轴突转运差异。
    8. 成像完成后，在麻醉下立即对小鼠实施安乐死（例如，颈椎脱位）。死后组织，如肌肉和坐骨神经，也可以被收集用于进一步分析。

Representative Results

本文详细介绍了一种多功能方案，该协议扩展了啮齿动物模型中的 体内 轴突运输工具包。 图1 表明，通过使用转基因小鼠，运动神经元轴突可以与感觉神经元轴突和施万细胞区分开来。 图1A 描绘了来自活的麻醉ChAT.eGFP小鼠的胆碱能运动轴突中的eGFP表达。 图1B 使用另一种方法从ChAT.tdtomato小鼠获得在新切除的神经中（即没有额外的组织处理）的tdTomato表达。因此，使用转基因菌株如恰特细胞增多糖、切阿特沙托或Hb9.GFP可以在 体内进行运动轴突特异性标记。

或者，也可以通过将示踪剂/标志物（例如，HCT31，32 或编码eGFP15的病毒）注射到骨骼肌中来识别轴突。 图2 突出显示了这样的应用，描绘了8个强烈表达ChAT.eGFP阳性轴突，其中包含HCT-555阳性信号内体（白色箭头），在探针注射到TA肌肉后约4小时。使用这种实验设计，我们可以识别TA支配α运动神经元，这些神经元主要是快速疲劳的44。另外五个eGFP表达不太健壮的ChAT.eGFP轴突（图2A，橙色星号）部分失焦，可能位于坐骨神经内稍深的地方。

此外，我们在eGFP阴性感觉轴突（黄色箭头）中鉴定出HCT-555阳性信号内体。因此，使用这种实验范式，可以专门评估和比较运动中信号内体的轴突转运与体内感觉神经元的轴突转 运。 事实上， 使用这种转基因报告菌株，我们发现ChAT.eGFP阳性运动轴突中信号内体的转运速度比ChAT.eGFP阴性感觉轴突更快，后者可以使用轴突宽度43可靠地区分。

我们之前已经使用ChAT.eGFP小鼠 在体内43中鉴定了运动神经元轴突。我们现在报告HB9。GFP小鼠也可用于 在体内实现运动神经元轴突鉴定。实际上， 图3 显示了HB9的一系列延时图像。GFP轴突含有逆行移动的HCT-555阳性信号内体。请注意，与 ChAT 驱动的表达不同，GFP 在 HB9 中具有更标点/更精细的模式。重力复合物轴突;原因尚不清楚。

我们之前已经描述了如何通过坐骨神经内注射线粒体靶向染料，四甲基罗丹明，乙酯，高氯酸盐（TMRE）32，36来监测坐骨神经的体内线粒体动力学。为了可靠地区分运动线粒体与感觉线粒体，在Thy1启动子18下表达CFP的Mito.CFP小鼠可以与在特定神经元类型中表达荧光报告基因的转基因小鼠杂交。事实上，通过将水道.CFP小鼠与ChAT.tdtomato小鼠（称为ChAT.tdtomato：：Mito.CFP）杂交，我们可以可视化运动轴突中的线粒体，如图4所示。在这个活的多重例子中，可以观察到五个ChAT.tdTomato轴突，其中四个含有CFP阳性线粒体。此外，还可以识别兰维尔节点（图iii中的白色箭头）。 此外，兰维尔的节点在ChAT.eGFP，HB9中可以清楚地检测到。全氟化物和水户丙种胶小鼠（未显示）。这些双转基因菌株能够对活的麻醉小鼠进行延时活体活体成像，以监测运动神经元特异性线粒体含量和轴突转运动力学。

最后，通过将HCT注射到Mito.CFP小鼠的肌肉中，可以在体内的相同轴突内同时可视化信号内体和线粒体（图5）。在成像前约4小时，在Mito.CFP小鼠的TA肌肉中进行肌内注射H C T-555。线粒体（i组）和信号内体（ii组）在肌肉特异性轴突（即支配TA的轴突）中同时可视化。事实上，可以观察到顺行（黄色三角形）和逆行（绿色三角形和圆形）移动的细胞器以及停滞的细胞器（橙色三角形和圆形）。使用这种实验范式，可以评估轴突线粒体和体内信号内体之间的复杂功能相互作用。总体而言，我们展示了几种不同的实验方法来评估信号内体和/或线粒体的轴突转运，特别是在体内胆碱能运动神经元中。

Figure 1
图1：坐骨神经运动轴突 （A）从ChAT.eGFP小鼠 体内 获得的eGFP阳性运动轴突的代表单平面图像。（B）来自ChAT.td多马托小鼠的切除坐骨神经中tdtomato阳性运动轴突的代表性单平面图像。轴突口径的差异是由小鼠年龄和大小的差异引起的。比例尺 = 50 μm。缩写：eGFP =增强型绿色荧光蛋白;ChAT = 胆碱乙酰转移酶. 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图2：ChAT.eGFP小鼠活坐骨神经运动和感觉神经元中信号内体的体内轴突转运（A-C）表达eGFP（A）并含有HCT-555阳性信号内体（B）的胆碱能轴突的代表性图像，以及合并（C）。白色箭头突出显示含有 HCT-555 阳性信号内体的 eGFP 正运动轴突，青色箭头标识缺乏 HCT-555 阳性信号内体的运动轴突，黄色箭头突出显示运输 HCT-555 阳性信号内体的 eGFP 负感觉轴突。橙色星号表示 eGFP 表达较弱的运动轴突。比例尺 = 25 μm。缩写：eGFP =增强型绿色荧光蛋白;ChAT = 胆碱乙酰转移酶;HCT-555 = 破伤风毒素结合结构域。请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图3：代表HB9的活运动神经元中信号内体的体内轴突转运的延时图像系列。通用防空导弹。（原-德）每3秒拍摄的延时图像描绘了表达绿色荧光蛋白（i）并含有HCT-555阳性信号内体（ii）的运动神经元轴突，以及合并（iii）。每个相同颜色的圆圈在不同的帧中识别相同的移动内体。逆行运动是从右到左。比例尺 = 10 μm。缩写：GFP = 绿色荧光蛋白;HCT-555 = 破伤风毒素结合结构域。请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图4：在ChAT.td的活坐骨神经运动神经元中线粒体的体内轴突转运：： Mito.CFP：小鼠（A-C）td多马托阳性运动轴突（A）的代表性图像，含有CFP阳性线粒体（B）和合并（C）。插图 i-iii 包含来自每个面板的较高放大倍率。白色箭头表示兰维尔的疑似节点。比例尺 = 25 （A-C） 和 10 μm （i-iii）。缩写： ChAT = 胆碱乙酰转移酶;CFP = 青色荧光蛋白。请点击此处查看此图的大图。

Figure 5
图5：延时图像系列，代表线粒体的并发 体内 轴突转运和Mito.CFP小鼠活坐骨神经运动神经元中的信号内体。 （自动对照）每3秒拍摄的延时图像描绘了同一坐骨神经轴突（iii）内线粒体（i）和信号内体的轴突运输。黄色三角形表示顺行移动的货物，绿色圆圈/三角形表示逆行移动的货物，橙色圆圈/三角形表示静止的货物。顺行运动是从左到右，而逆行运动是相反的方向。比例尺 = 10 μm. 缩写： HCT-555 = 破伤风毒素结合域;CFP = 青色荧光蛋白。 请点击此处查看此图的大图。

Discussion

该协议详细说明了在小鼠坐骨神经的完整轴突中评估信号内体和线粒体的 体内 轴突转运的步骤。实际上，提供了一种实验装置，使用户能够通过使用表达在运动神经元中选择性表达的荧光报告蛋白的小鼠， 在体内，原位和 离体 中区分运动神经元和感觉神经元;2）使用三种不同的转基因小鼠在运动神经元轴突中评估信号内体的 体内 轴突转运;3）研究线粒体的 体内 轴突转运，特别是在运动神经元轴突中;4）同时评估同一轴突内信号体和线粒体的 体内 转运动力学。这种方法在研究基础疾病中的轴突转运方面具有巨大的潜力，可用于评估影响周围运动和感觉神经的不同疾病的病理扰动。

使用以前的实验范例作为基础31，32，在这里，我们有详细的新颖，稳健的方法来区分运动中发生的轴突转运与使用转基因报告小鼠的感觉神经元。使用Mito.CFP小鼠，这种方法已被进一步发展，通过避免坐骨神经内注射TMRE36来评估体内线粒体转运。这避免了由神经内注射探针引起的轴突转运中可能的神经损伤和扰动。此外，该协议允许可视化运动轴突中多个细胞器的轴突转运，这些轴突支配具有不同生理特性的肌肉（例如，快速抽搐的疲劳性肌肉与缓慢抽搐的抗疲劳肌肉）。因此，可以在α运动神经元的不同亚群中评估信号内体和/或线粒体轴突转运动力学44。此外，这些细胞器在病理环境中的轴突转运也可以通过与不同神经退行性疾病的小鼠模型杂交来评估1，2，3。

轴突转运工具包不断扩展28，29，并且已经开发 出离体 方案，以使用培养的小鼠腹角外植体49 或切除的小鼠神经肌肉制剂50来评估转运动力学。此外，开发用于评估诱导的人多能干细胞（hiPSC）衍生的皮质51 神经元或hiPSC衍生的脊髓运动神经元52 中的轴突转运的方案，使得能够研究具有致病突变的人类神经元。小鼠组织和人类细胞中的这种尖端方案可以提供对神经元功能的关键见解，促进神经退行性疾病模型中的新病理机制发现，并用于测试治疗分子和策略。

要成功实现这些技术，需要遵循几个关键步骤，协议部分提供了一些重要的说明。活体成像的主要要求是带有定制载物台插入物台的倒置共聚焦显微镜以及保持麻醉和最佳温度的设备。事实上，需要一个专门的移动麻醉系统来1）诱导麻醉，2）解剖/组织处理（即暴露坐骨神经），以及3）在活体成像期间保持麻醉（如先前详述的31，32）。特别是当使用更高的放大倍率物镜（例如，40x或63x）时，麻醉深度会影响图像质量，因为更深的麻醉会引起大的“气”呼吸，导致焦点频繁偏移。这种较大的运动无疑会影响成像后运输分析（例如，使用斐济插件TrackMate53或KymoAnalyzer54跟踪货物），因为呼吸运动在延时视频中产生伪影，使它们不适合自动跟踪或需要更耗时的评估。此外，我们还观察到由坐骨神经内脉动动脉引起的成像伪影，这只能通过选择不同的成像区域来解决。显微镜必须配备能够保持恒定体温的环境室，因为温度和pH值影响轴突转运55。此外，应避免在手术后使用镇痛药，因为它们可以改变运输动力学56。如果实验设计是纵向的，需要重复成像（例如，57），则需要适当调整解剖方案以达到微创，并且可能需要额外的伦理/许可批准。

需要牢记某些 实验注意事项 。首先，本文详述的大多数方案涉及使用在线粒体或运动神经元轴突中具有荧光报告蛋白的转基因小鼠。这些小鼠品系中的每一个都应该被培育和成像为半合子/杂合子。然而，例外的是ChAT.Cre和Rosa26.tdTomato小鼠品系，它们可以单独维持为纯合子，由此产生的半合子后代能够在Cre-loxP 重组后在胆碱能神经元中表达tdTomato。当转基因半合子/杂合子小鼠（例如Mito.CFP）与其他转基因半合子/杂合子小鼠（例如ChAT.eGFP）杂交时，需要仔细考虑育种策略，因为获得所需数量的双突变后代可能非常耗时。此外，当用额外的转基因菌株（例如，水母细胞）繁殖F1代ChAT.Cre和Rosa26.tdtomato小鼠（即ChAT.tdTomato）时，应该期望携带所需三重转基因的小鼠更少。此外，在繁殖具有附近波长特性的两只报告小鼠时，还必须考虑潜在的荧光团重叠（例如，Mito-CFP激发：435nm，发射：485nm，用ChAT.eGFP激发：488nm，发射：510nm）繁殖，尽管有可能通过光谱不混合58来克服这个问题。

此技术有一些需要考虑的局限性。在这项工作和我们之前的实验方案31，32中，我们已经展示了如何使用几种遗传编码的标记和不同的染色方法来标记和跟踪体内不同的细胞器。然而，并非所有探头都适合这种实验方法。我们评估了向TA或比目鱼肌中注射霍乱毒素β亚基（CTB）-488（成像前0.5-1.5μg/ μL〜4小时），该探针常规用于标记体内逆行示踪剂实验中的运动神经元细胞体59，60。然而，当单独注射或与HCT-555共同注射时，CTB-488标记很差，尽管使用的浓度类似于用于成功逆行运动神经元追踪的浓度。因此，我们得出结论，尽管CTB是神经元培养物61中信号内体信号传导的优秀体外标志物，但HCT仍然是在坐骨神经轴突中识别体内信号内体的金标准探针。

使用不同的途径，我们还测试了常规用于标记溶酶体的探针，如LysoTracker绿色DND-26，以及活性溶酶水解酶的标志物，如组织蛋白酶D62 的BODIPY-FL-胃抑素A和组织蛋白酶B的Magic Red，但没有成功。我们尝试肌内注射BODY-FL-肽抑素A（成像前2.5μg进入TA〜4小时），以及在成像前30-60分钟注射2μLLysoTracker（10μM），BODIPY-FL-肽抑素A（10μM）或魔术红（1/10）。尽管这些探针突出了神经，但我们无法找到明确标记的细胞器。探针积聚在轴突周围，可能被施万细胞保留。因此，溶酶体标记不成功可能是由于向神经元的探针递送不足，尽管不能排除存在更合适的浓度。鉴于TMRE标记在类似条件下起作用（即坐骨神经内注射），标记强度可能是染料依赖性的，必须针对每个标记物独立测试。然而，我们得出结论，在上述浓度下，用这些探针 靶向体内 溶酶体是不可行的。

麻醉方法可以改变不同的生理读数（例如，耳蜗功能63 和皮质电生理学64）;然而，麻醉是否影响坐骨神经 中的体内 轴突转运目前尚不清楚。鉴于异氟醚诱导的麻醉下神经肌肉活性降低，与清醒状态相比，运输动力学可能不同。然而，唯一直接研究这一点的 体内 研究表明，在丘脑皮质投影中密集的核心囊泡的运输在麻醉小鼠和清醒小鼠65之间没有差异。此外，由于在麻醉35，43下可以检测到野生型和疾病模型小鼠之间的运输区别，因此很明显，异氟醚暴露不会阻止识别信号内体或线粒体运输中的扰动。

该协议还有其他 潜在的应用，如下所述。将本方案中概述的转基因小鼠（例如，Mito.CFP，ChAT.eGFP）与神经退行性疾病小鼠模型1，2，3 的育种将实现神经元亚型和/或货物特异性研究。此外，最近开发的小鼠Cre系66 还允许在不同的感觉轴突群体中可视化荧光报告蛋白。例如，罗莎26.td多马托小鼠可以与神经肽Y受体-2表达（Npy2r）杂交。Cre鼠标使tdTomato荧光在有髓鞘A纤维伤害感受器67中。此外，时间控制也可以通过使用诱导Cre系统（例如，他莫昔芬）68来实现。另一个潜在的应用依赖于在施万细胞中表达荧光报告蛋白的转基因小鼠的可用性。事实上，S100-GFP69 和PLP-GFP70 小鼠能够对施万细胞进行 体内 和/或 原位 成像，并且一直处于周围神经再生期间施旺细胞迁移研究的最前沿。

除了这些应用和补充Mito.CFP小鼠之外，还有几种转基因小鼠品系的可用性，这些小鼠系在不同细胞器（如线粒体和自噬体）中表达荧光蛋白。例如，研究体内线粒体转运可能是可能的有丝分裂：：mKate2小鼠71或光可转换有丝分裂小鼠57。此外，使用pH敏感的丝裂凯马小鼠72和丝线肌QC小鼠73进行有丝分裂自噬分析，可以进行体内有丝分裂噬体转运。此外，通过使用表达LAMP1-GFP的小鼠可以克服我们遇到的溶酶体标记困难，但需要注意的是，LAMP1也存在于与溶酶体74不同的内吞细胞器中。

总之，我们提供了新的方法来评估来自不同转基因小鼠的特定周围神经轴突中几种细胞器的 体内 轴突转运。鉴于最近发现的轴突相互作用和细胞器（如线粒体和内体75，76）的共同运输，不同细胞器的同步成像将特别重要。我们认为，所提出的方法将有助于提高对 体内 轴突基础生理学的理解，并解开驱动周围神经变性的重要病理机制。

Disclosures

作者没有利益冲突。

Acknowledgments

我们要感谢罗伯特·布朗斯通（伦敦大学学院皇后广场神经病学研究所）分享ChAT-eGFP，ChAT.Cre和Rosa26.tdTomato小鼠，以及彼得罗·弗拉塔（伦敦大学学院皇后广场神经病学研究所）分享HB9。通用防空导弹。我们要感谢Elena R. Rhymes，夏洛特J.P.克雷默斯和邱汉朗（伦敦大学学院皇后广场神经病学研究所）对手稿的批判性阅读。这项工作得到了运动神经元疾病协会（英国）（Tosolini/Oct20/973-799）（APT）的初级非临床奖学金，威康信托基金高级研究员奖（107116/Z/15/Z和223022/Z/21/Z）（GS）的支持，英国痴呆症研究所基金会奖（GS）;和医学研究委员会职业发展奖（MR / S006990 / 1）（JNS）。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tube
70% (v/v) ethanol in distilled water
AlexaFlour555 C2 maleimide ThermoFisher Scientific A-20346 Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J Jackson Laboratory 7909 Rosa26.tdTomato mice
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice Jackson Laboratory 5029 HB9.GFP mice
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice Jackson Laboratory 7967 Mito.CFP mice
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice Jackson Laboratory 6410 ChAT.Cre mice
Computer with microscope control and image acquisition software Zeiss Zen
Cotton swab
Desktop centrifuge
Dissecting microscope
Eye lubricant
Fine curved forceps Dumont
Fine straight forceps Dumont
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1)
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger Drummond Scientific 5-000-1001-X10
Hair clippers
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) Merck 20779
HcT-441 N/A N/A See Restani et al., 2012 for more details
Heating pad
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C
Inverted confocal microscope with environmental chamber Zeiss LSM 780 Most inverted confocals should be adaptable
Isoflurane
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer
Magic tape invisible tape
Micropipette puller
Parafilm Parafilm
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02 BDNF that can be co-injected with HcT-555
Saline
Scalpel blade Dumont
Small spring scissors Dumont
Surgery/operating microscope
Surgical drape
Surgical suture
Surgical tape
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice MMRRC 000296-UCD ChAT.eGFP
Vortex mixer

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神经科学，第178期，
扩展轴突转运<em>体内成像工具包</em>
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