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Neuroscience

एक्सोनल ट्रांसपोर्ट के इन विवो इमेजिंग के लिए टूलकिट का विस्तार करना

Published: December 23, 2021 doi: 10.3791/63471
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology, University College London, 2UCL Queen Square Motor Neuron Disease Centre, University College London, 3UK Dementia Research Institute, University College London

Summary

ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट चूहों का उपयोग करते हुए, विस्तृत प्रोटोकॉल जीवित जानवरों में बरकरार कटिस्नायुशूल तंत्रिका के मोटर और संवेदी अक्षतंतु के भीतर सिग्नलिंग एंडोसोम और माइटोकॉन्ड्रिया के विवो एक्सोनल परिवहन में आकलन करने के लिए वर्णित हैं।

Abstract

एक्सोनल परिवहन विभिन्न ऑर्गेनेल और कार्गो की द्विदिश तस्करी को सक्षम करके न्यूरोनल होमियोस्टेसिस को बनाए रखता है। अक्षीय परिवहन में व्यवधान व्यक्तिगत न्यूरॉन्स और उनके नेटवर्क के लिए विनाशकारी परिणाम हैं, और न्यूरोलॉजिकल विकारों की अधिकता में योगदान करते हैं। चूंकि इनमें से कई स्थितियों में सेल स्वायत्त और गैर-स्वायत्त तंत्र दोनों शामिल हैं, और अक्सर न्यूरोनल उपप्रकारों में पैथोलॉजी का एक स्पेक्ट्रम प्रदर्शित करते हैं, न्यूरोनल सबसेट को सटीक रूप से पहचानने और विश्लेषण करने के तरीके अनिवार्य हैं।

यह पेपर संवेदनाहारी चूहों के कटिस्नायुशूल तंत्रिकाओं में सिग्नलिंग एंडोसोम और माइटोकॉन्ड्रिया के विवो एक्सोनल परिवहन में आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल का विवरण देता है। चरणबद्ध निर्देश प्रदान किए जाते हैं 1) विवो में संवेदी न्यूरॉन्स से मोटर को अलग करें , सीटू में, और पूर्व विवो चूहों का उपयोग करके जो चुनिंदा कोलीनर्जिक मोटर न्यूरॉन्स के भीतर फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं; और 2) सिग्नलिंग एंडोसोम और माइटोकॉन्ड्रिया के विवो एक्सोनल परिवहन में अलग-अलग या समवर्ती मूल्यांकन करें। ये पूरक इंट्रावाइटल दृष्टिकोण स्वास्थ्य और बीमारी में अक्षीय परिवहन की मात्रात्मक निगरानी के लिए अलग-अलग परिधीय तंत्रिका अक्षतंतु में विभिन्न कार्गो की एक साथ इमेजिंग की सुविधा प्रदान करते हैं।

Introduction

परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएनएस) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को अपने डिस्टल लक्ष्यों से जोड़ता है, जिससे अपवाही संकेतों के रिले को संवेदी प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए मोटर नियंत्रण और अभिवाही संकेतों को लागू करने की अनुमति मिलती है। माउस आनुवंशिकी में प्रगति की भीड़ का उपयोग करते हुए, वैज्ञानिकों ने पीएनएस 1,2,3 को पीड़ित करने वाली कई बीमारियों / सिंड्रोमकी जांच करने के लिए विभिन्न माउस मॉडल विकसित किए हैं। चूंकि अधिकांश न्यूरोडीजेनेरेटिव विकृतियां सेल स्वायत्त और गैर-स्वायत्त योगदान 4,5 के साथ बहुआयामी हैं, इसलिए अनटैंगलिंग सेल-/ न्यूरॉन-विशिष्ट विकृतियां रोग तंत्र में महत्वपूर्ण, उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती हैं।

यह अंत करने के लिए, जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र (बीएसी) -ट्रांसजेनिक चूहों6 के विकास ने न्यूरॉन्स के लक्षित सबसेट में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की चयनात्मक अंतर्जात अभिव्यक्ति को सक्षम किया है। उदाहरण के लिए, बीएसी-ट्रांसजेनिक चूहे उपलब्ध हैं, जो कोलीनर्जिक7 या ग्लाइसिनर्जिक न्यूरॉन्स8 में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) या परवलबुमिन-पॉजिटिव न्यूरॉन्स9 में एक संस्करण लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (टीडीटोमैटो) व्यक्त करते हैं। वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की चयनात्मक न्यूरोनल अभिव्यक्ति क्रे-लॉक्सपी प्रौद्योगिकी10 के माध्यम से प्राप्त की जा सकती है। उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स के सबसेट में क्रे-रिकंबिनेज को व्यक्त करने वाले माउस उपभेदों (जैसे, कोलीन एसिटाइलट्रांसफेरेज़ (सीएचएटी) -क्रे) को चूहों के साथ नस्ल किया जा सकता है जो एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, टीडीटोमैटो या जीएफपी) को एक संवैधानिक स्थान (जैसे,जीटी ( आरओएसए) 26 सोर) से व्यक्त करते हैं। दरअसल, क्रे-लॉक्सपी पुनर्संयोजन का उपयोग करके, ट्रांसजेनिक चूहों को उत्पन्न किया गया है जो अवरोही कॉर्टिकोस्पाइनल ट्रैक्ट12 के अक्षतंतु में पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करते हैं।

कैस 9 जीन संपादन में हालिया प्रगति, जैसे ऑरेंज, नैनोस्केल रिज़ॉल्यूशन13 पर प्राप्त अभिव्यक्ति के साथ कई अंतर्जात न्यूरोनल प्रोटीन के फ्लोरोसेंट टैगिंग को सक्षम करती है। इसके अलावा, क्रे-एक्सप्रेसिंग माउस उपभेदों के साथ संयोजन में, ऑरेंज-केक का उपयोग व्यक्तिगत न्यूरॉन्स13 में कई अंतर्जात प्रोटीन को टैग करने के लिए किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, वायरल-मध्यस्थता न्यूरोनल ट्रेसिंग भी न्यूरोनल सबसेट के लेबलिंग की अनुमति देती है और वायरल सीरोटाइप और / या सेल-विशिष्ट प्रमोटरों 14,15,16,17 के लक्षित संयोजनों के साथ प्राप्त की जा सकती है।

न्यूरोनल लेबलिंग विधियों के अलावा, माउस लाइनों को विशिष्ट ऑर्गेनेल को लक्षित करने वाले रिपोर्टर प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए भी इंजीनियर किया गया है, जैसे कि माइटोकॉन्ड्रिया सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (माइटो.सीएफपी) 18 या जीएफपी (एलसी 3.जीएफपी) 19 व्यक्त करने वाले ऑटोफैगोसोम। इसके अलावा, माउस लाइनों को विशेष रूप से न्यूरॉन्स (जैसे, थाइ1.जीसीएएमपी) 20,21 में कैल्शियम गतिशीलता का आकलन करने के लिए इंजीनियर किया गया है। कुल मिलाकर, ऐसे मॉडलों की उन्नति के साथ, उपन्यास प्रयोगात्मक अनुप्रयोग वैज्ञानिकों को सीएनएस और पीएनएस के बारे में अधिक सटीक जैविक और रोग संबंधी प्रश्न पूछने में सक्षम बनाते हैं।

परिधीय मोटर नसों की मुख्य भूमिका आंदोलन को प्राप्त करने के लिए कंकाल की मांसपेशियों में विद्युत संकेतों को संचारित करना है। इसके अलावा, और लंबे समय तक होने वाले पैमानों पर होने वाले, विभिन्न ऑर्गेनेल (जैसे, माइटोकॉन्ड्रिया, एंडोलिसोसोम, सिग्नलिंग एंडोसोम) के रूप में न्यूरोकेमिकल और शारीरिक संदेश न्यूरोनल होमियोस्टेसिस22,23,24 को बनाए रखने में मदद करने के लिए एक यूनी- या द्वि-दिशात्मक तरीके से साइटोस्केलेटल नेटवर्क को पार करते हैं। एक्सोनल परिवहन में हानि के न्यूरोनल स्वास्थ्य के लिए विनाशकारी परिणाम हैं और कई न्यूरोडेवलपमेंटल और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों से जुड़ेहैं 25. आणविक स्तर पर, अक्षीय परिवहन में हानि सिनैप्टिक सिग्नलिंग और प्लास्टिसिटी, जीन प्रतिलेखन और अक्षतंतु26,27 में स्थानीय अनुवाद को विनियमित करने वाली शारीरिक घटनाओं को बाधित कर सकती है। न्यूरॉन्स28,29 में इन घटनाओं का अध्ययन करने के लिए उपकरणों की एक भीड़ है, विवो में अक्षतंतु परिवहन गतिशीलता और अक्षीय-लिंक्ड जैविक घटनाओं का आकलन शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है30.

इन वर्षों में, शियावो प्रयोगशाला ने एक्सोनल परिवहन 31,32,33,34,35,36 के बारे में विविध प्रश्न पूछने के लिए प्रोटोकॉल का अनुकूलन किया है। इन प्रयोगों ने इस खोज से विस्तार किया है कि टेटनस न्यूरोटॉक्सिन (एचसीटी) के एक फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एटॉक्सिक टुकड़े को कंकाल की मांसपेशियों में अक्षतंतु टर्मिनलों में निडोजेन और पॉलीसियालोगैंगलियोसाइड्स37 के साथ बातचीत के माध्यम से आंतरिक किया जाता है। एक बार आंतरिक होने के बाद,एचसीटीको प्रतिगामी रूप से रब 7-पॉजिटिव, न्यूरोट्रॉफिन युक्त सिग्नलिंग एंडोसोम में ले जाया जाता है जो मोटर और संवेदी न्यूरॉन्स 38,39,40,41 के सेल निकायों के लिए नियत होते हैं। समानांतर में, इमेजिंग प्रौद्योगिकी में प्रगति ने परिधीय तंत्रिका बंडलों और जीवित, संवेदनाहारी चूहों30 में व्यक्तिगत अक्षतंतु के वास्तविक समय विश्लेषण को सक्षम किया है। पैथोलॉजी में विवो एक्सोनल ट्रांसपोर्ट डायनेमिक्स में आकलन करने में पहले प्रयास से एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) 35 के एसओडी 1जी 9 3 ए माउस मॉडल में सिग्नलिंग एंडोसोम और माइटोकॉन्ड्रिया के परिवहन में प्रीसिम्प्टोमैटिक हानि का पता चला। महत्वपूर्ण रूप से, इन दोषों को न्यूरोडीजेनेरेशन के माध्यमिक परिणामों का प्रतिनिधित्व करने की संभावना नहीं है, यह देखते हुए कि मोटर न्यूरॉन हानि कैनेडी की बीमारी42 के माउस मॉडल में अक्षीय परिवहन गड़बड़ी की अनुपस्थिति में हो सकती है और एएलएस43 का एक विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती एफयूएस मॉडल। इस तरह के अक्षीय परिवहन घाटे को विशिष्ट किनेसेस33 या विकास कारक रिसेप्टर्स34 के अवरोधकों का उपयोग करके एएलएस चूहों में ठीक किया जा सकता है। इसके अलावा, एक विशिष्ट हिस्टोन डेसिटाइलेज अवरोधक के साथ न्यूरॉन्स का इलाज विवो36 में माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन को बदल देता है। हाल ही में, हम रिपोर्ट करते हैं कि अक्षतंतु परिवहन के बीडीएनएफ-निर्भर मॉडुलन को एएलएस चूहों44 में अलग-अलग मोटर न्यूरॉन उपप्रकारों में विनियमित किया जाता है।

एक्सोनल ट्रांसपोर्टडायनेमिक्स 28,29 का आकलन करने के लिए एक कभी-विस्तारित टूलकिट का उपयोग करके, यह वीडियो प्रोटोकॉल कई अनुप्रयोगों को रेखांकित करता है जो विभिन्न जैविक और रोग परिदृश्यों में आगे की अंतर्दृष्टि की अनुमति देंगे। सबसे पहले, ट्रांसजेनिक चूहों जो चुनिंदा रूप से कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स (यानी, मोटर न्यूरॉन्स) में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं, का उपयोग विवो और पूर्व विवो दोनों में मोटर और संवेदी अक्षतंतु के बीच भेदभाव करने के लिए किया जाता है। फ्लोरोसेंटली लेबलएचसीटीको तब अलग-अलग परिधीय न्यूरॉन्स में अक्षीय परिवहन गतिशीलता को अलग करने के लिए तीन ट्रांसजेनिक लाइनों में सिग्नलिंग एंडोसोम में लोड किया जाता है। अगले प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल मितो-सीएफपी चूहों के साथ ChAT.tdTomato चूहों प्रजनन द्वारा विशेष रूप से मोटर न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन का आकलन करने के लिए एक मल्टीप्लेक्स प्रतिदीप्ति दृष्टिकोण का विवरण देता है। अंत में, विवो में एक ही अक्षतंतु के भीतर माइटोकॉन्ड्रिया और सिग्नलिंग एंडोसोम को समवर्ती रूप से छवि देने के निर्देश दिए जाते हैं।

Protocol

सभी माउस हैंडलिंग और प्रयोगों को पशु (वैज्ञानिक प्रक्रियाएं) अधिनियम (1986) के अनुसार किया गया था और यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन - क्वीन स्क्वायर इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजी एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. जानवर

  1. तापमान- और आर्द्रता-नियंत्रित वातावरण में व्यक्तिगत रूप से हवादार पिंजरों में सभी जानवरों को घर दें और उन्हें भोजन और पानी तक विज्ञापन लिबिटम पहुंच के साथ 12 घंटे के प्रकाश /
  2. निम्नलिखित ट्रांसजेनिक उपभेदों के नर और मादा चूहों दोनों का उपयोग करें: 1) विषमयुग्मजी टीजी (चैट-ईजीएफपी) जीएच 293 जीसैट / 2) विषमयुग्मजी B6.Cg-टीजी (एचएलएक्सबी 9-जीएफपी) 1 टीएमजे / जीएफपी चूहों; और 3) विषमयुग्मजी B6.Cg-टीजी (थाइ 1-सीएफपी / सीओएक्स 8 ए) एस 2 एलिच / जे, जिसे मिटो.सीएफपी चूहों के रूप में जाना जाता है।
  3. जे को पार करके सीएचएटी.टीडीटोमैटो चूहों को उत्पन्न करें, जिसे सीएचएटी.क्रे चूहों के रूप में संदर्भित किया जाता है, समरूप B6.Cg-जीटी (आरओएसए) 26 सोरटीएम 9 (सीएजी-टीडीटोमैटो) एचजेडई / जे के साथ, जिसे रोजा 26.टीडीटोमैटो चूहों के रूप में जाना जाता है।
  4. विषमयुग्मजी मिटो.सीएफपी चूहों के साथ विषमयुग्मजी सीएचएटी.टीडीटोमैटो चूहों को पार करके एमआईटीओ.सीएफपी चूहों उत्पन्न करें।

2. फ्लोरोसेंट एचसीटी के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन

  1. प्री-सर्जरी की तैयारी
    1. एक्सप्रेसएचसीटी(एचसीटी 441, अवशेष 875-1315) 45 के अनुसार ग्लूटाथियोन-एस-ट्रांसफरेज फ्यूजन प्रोटीन के रूप में बैक्टीरिया में एक बेहतर सिस्टीन समृद्ध टैग से जुड़ा हुआ है। एलेक्साफ्लोर 555 सी2 मैलिमाइड31 केसाथ एचसी टीलेबल करें, इसे बर्फ-ठंडे डायलिसिस बफर (10 एमएम एचईपीईएस-एनएओएच, 100 एमएम एनएसीएल, पीएच 7.4) में डायलाइज़ करें, इसे तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें, और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। विवो प्रयोगों में प्रदर्शन करने से पहले, प्राथमिक न्यूरॉन्स में सफल तेज और परिवहन के लिए इन विट्रो में पहला परीक्षणएचसीटी।
    2. पतला फ्लोरोसेंट एचसीटी (जैसे, एचसीटी -555) एक अंतिम और प्रयोगात्मक रूप से सुसंगत एकाग्रता के लिए बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 2.5 से 10 μg / इस चरण में, यदि आवश्यक हो तोएचसीटीसमाधान में अधिक यौगिकों / कारकों को जोड़ें (उदाहरण के लिए, मस्तिष्क-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक)।
      नोट: अंतिम मात्रा ब्याज की मांसपेशियों (ओं) के आकार के लिए उपयुक्त होना चाहिए। उदाहरण के लिए, टिबियलिस पूर्वकाल (टीए) मांसपेशियों के लिए 3-4 μL और छोटे एकमात्र मांसपेशी के लिए ~ 1 μL की एक इंजेक्शन मात्रा तैयार करें। अंतिम आयतन की परवाह किए बिना 2.5 और 10 μg/μL के बीच एचसीटी की कार्यशील एकाग्रता रखें।
    3. एक पिपेट या भंवर का उपयोग कर एचसीटी समाधान मिलाएं, और संक्षेप में तरल इकट्ठा करने और बड़े बुलबुले को हटाने के लिए डेस्कटॉप अपकेंद्रित्र का उपयोग करके कम गति पर स्पिन करें। बर्फ पर प्रकाश और परिवहन सेएचसीटीकी रक्षा करें।
    4. छोटी मांसपेशियों (जैसे, सोलस) में इष्टतम इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के लिए या इंट्रासियटिक तंत्रिका इंजेक्शन के लिए खींचे गए ग्लास माइक्रोपिपेट का उपयोग करें। सर्जरी से पहले ग्रेडेड ग्लास माइक्रोपिपेट्स ( 46 के अनुसार) खींचें।
      नोट: पाइपिंग को सक्षम करने और माइक्रोपिपेट के पीछे प्रवाह को प्रतिबंधित करने के लिए, ध्यान से एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत ठीक संदंश का उपयोग कर तेज टिप से एक छोटा टुकड़ा तोड़ दें। उचित बिन में टूटे हुए अंत का निपटान करने का ध्यान रखें।
    5. उपयोग करने से पहले सभी सर्जिकल उपकरणों को निष्फल और साफ करें।
  2. सर्जरी-इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक गर्मी चटाई पर एक बाँझ सर्जिकल ड्रेप को सुरक्षित करके सर्जरी के लिए तैयार करें। ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप की स्थिति और ध्यान केंद्रित करें। सर्जरी शुरू करने के लिए, सर्जिकल ड्रेप पर प्रीस्टेरिलाइज्ड सर्जिकल टूल्स, सर्जिकल टेप, बाँझ कपास झाड़ू, पानी में 70% (वी / वी) इथेनॉल, बाँझ खारा, टांके, और एक हैमिल्टन सुई या खींचे गए ग्लास माइक्रोपिपेट्स को अनपैक करें।
    2. सुनिश्चित करें कि एनेस्थेटिक मशीन में सर्जिकल प्रक्रिया की अवधि के लिए पर्याप्त ऑक्सीजन और आइसोफ्लूरेन है। प्रेरण कक्ष में संज्ञाहरण के प्रवाह को निर्देशित करें और संवेदनाहारी मशीन पर स्विच करें।
      1. शुरू करने के लिए, 1-2 एल / मिनट और 5% आइसोफ्लूरेन की ऑक्सीजन प्रवाह दर का उपयोग करें। संज्ञाहरण शुरू करने के लिए प्रेरण कक्ष में माउस रखें। जब राइटिंग रिफ्लेक्स अनुपस्थित होता है, तो संज्ञाहरण को 2-3% आइसोफ्लूरेन तक कम करें, मुखपत्र में संज्ञाहरण के प्रवाह को निर्देशित करें, और माउस को सर्जिकल स्पेस के एक अलग क्षेत्र में स्थित मुखपत्र में स्थानांतरित करें।
    3. सुनिश्चित करें कि कॉर्नियल और पेडल निकासी सजगता दोनों मांसपेशियों (ओं) को कवर करने वाले फर के क्षेत्र को शेविंग करने से पहले अनुपस्थित हैं। पूरा होने पर, सर्जिकल टेप के चिपचिपा पक्ष का उपयोग करके माउस से जितना संभव हो उतना मुंडा फर निकालें, और माउस को अपने पूर्व-सर्जिकल वजन को रिकॉर्ड करने के लिए वजन तराजू पर रखें।
    4. सावधानी से एक कपास झाड़ू का उपयोग कर नेत्र स्नेहक लागू होते हैं और सर्जिकल क्षेत्र के लिए माउस और मुखपत्र हस्तांतरण।
      नोट: शल्य चिकित्सा क्षेत्र में भी स्थानांतरित किया जाता है कि मुंडा फर की मात्रा को सीमित करने का प्रयास करें। माउस को बाहर फिसलने से रोकने के लिए मुखपत्र के लिए सिर को सुरक्षित करने के लिए सर्जिकल टेप का प्रयोग करें। एक अलग कपास झाड़ू का उपयोग करके, फर संदूषण को निष्फल और कम करने के लिए मुंडा क्षेत्र में इथेनॉल लागू करें।
    5. इंजेक्शन लगाने के लिए मांसपेशियों के अनुसार शरीर को रखें। उदाहरण के लिए, टीए के लिए, माउस को अपनी पीठ पर रखें और मिडलाइन से ~ 10 ° पर हिंडलिंब को फैलाएं। वैकल्पिक रूप से, एकमात्र इंजेक्शन के लिए, जानवर को अपनी तरफ रखें और मिडलाइन से ~ 45 ° पर हिंदलिम्ब का विस्तार करें। जब हिंडलिंब सही स्थिति में हो, तो सर्जरी के दौरान अवांछित आंदोलन को रोकने के लिए पैर भर में सर्जिकल टेप का उपयोग करें।
      नोट: टीए, गैस्ट्रोनेमियस और सोलस मांसपेशियों के लिए इंजेक्शन प्रक्रियाओं को पहले विस्तृत किया गया है32.
    6. चीरा लगाने से पहले, पुष्टि करें कि पेडल निकासी पलटा का परीक्षण करके संज्ञाहरण पर्याप्त है। संज्ञाहरण की लगातार निगरानी करें और श्वास के नियमित मूल्यांकन और निकासी पलटा के साथ सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान इसे बनाए रखें।
    7. इस बिंदु पर, हैमिल्टन सिरिंज या खींचे गए ग्लास माइक्रोपिपेट में काम करने वालेएचसीटीसमाधान को आकर्षित करें।
    8. मोटर एंड प्लेट क्षेत्रों46,47,48 के अनुरूप क्षेत्र (ओं) में रुचि की मांसपेशियों (ओं) पर एक छोटा चीरा बनाएं। मांसपेशियों पर बाहरी प्रावरणी को पियर्स करें और धीरे-धीरे 32 के अनुसारएचसीटीइंजेक्ट करें। माइक्रोपिपेट को धीरे-धीरे वापस लेने से पहले 5-10 एस के लिए स्थिति में छोड़ दें।
    9. 1-2 टांके के साथ चीरों को बंद करें और माउस को एक पृथक वसूली पिंजरे में स्थानांतरित करें। घर पिंजरे में लौटने से पहले, कम से कम 30 मिनट के लिए माउस पोस्ट सर्जरी की निगरानी करें। जब माउस सफलतापूर्वक ठीक हो गया है और पोस्ट सर्जिकल निगरानी पूरी हो गई है, तो पिंजरे को सामान्य आवास स्थितियों में वापस कर दें।

3. विवो एक्सोनल परिवहन में

  1. कटिस्नायुशूल तंत्रिका को उजागर करना
    1. इमेजिंग से पहले कम से कम 1 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोस्कोप पर्यावरण कक्ष सेट करें।
    2. सर्जिकल ड्रेप, उपकरण, टेप, बाँझ कपास झाड़ू, 70% इथेनॉल, और सर्जिकल क्षेत्र के चारों ओर बाँझ खारा की व्यवस्था करके कटिस्नायुशूल तंत्रिका को उजागर करने के लिए तैयार करें। सुनिश्चित करें कि संवेदनाहारी मशीन में प्रति माउस 2 घंटे तक ऑक्सीजन और आइसोफ्लूरेन के पर्याप्त भंडार हैं। एक कोण टिप के साथ एक संकीर्ण आयत (उदाहरण के लिए, बड़े चूहों के लिए ~ 1 सेमी चौड़ाई) में काटकर पैराफिल्म या अदृश्य टेप से बाहर एक पच्चर बनाएं और इमेजिंग प्रक्रिया की सहायता के लिए इसे उजागर कटिस्नायुशूल तंत्रिका के नीचे रखें। एक गर्मी चटाई के शीर्ष पर प्रेरण कक्ष रखें और इसे शरीर के तापमान पर सेट करें।
      नोट:एचसीटीको लेने के लिए चार घंटे पर्याप्त समय है और इंजेक्शन की साइट से कटिस्नायुशूल तंत्रिका तक प्रतिगामी रूप से ले जाया गया है; इसलिए, इस समय के बाद फिर से संज्ञाहरण के लिए एक माउस को तैयार किया जा सकता है।
    3. प्रेरण कक्ष में संज्ञाहरण के प्रवाह को निर्देशित करें, 1-2 एल / मिनट और 3-4% आइसोफ्लूरेन की ऑक्सीजन प्रवाह दर के साथ संवेदनाहारी मशीन पर स्विच करें, और संज्ञाहरण शुरू करने के लिए प्रेरण कक्ष में माउस रखें।
      नोट: चूंकि विवो एक्सोनल परिवहन प्रयोग में एक टर्मिनल प्रक्रिया है, इसलिए आंखों को चिकनाई करने की कोई आवश्यकता नहीं है।
    4. जब राइटिंग रिफ्लेक्स अनुपस्थित होता है, तो संज्ञाहरण को 2-3% आइसोफ्लूरेन तक कम करें, मुखपत्र में संज्ञाहरण के प्रवाह को निर्देशित करें, और माउस को मुखपत्र में स्थानांतरित करें। मुखपत्र के लिए सिर को सुरक्षित करने के लिए सर्जिकल टेप का उपयोग करें, मिडलाइन से ~ 45 ° पर लक्षित हिंडलिंब का विस्तार करें, और इस स्थिति को बनाए रखने के लिए पैर पर सर्जिकल टेप का उपयोग करें।
      नोट: कम संज्ञाहरण इस बिंदु पर फायदेमंद है क्योंकि यह इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान श्वास कलाकृतियों के प्रभाव को सीमित कर सकता है।
    5. सुनिश्चित करें कि कॉर्नियल और पेडल निकासी सजगता अनुपस्थित हैं, और फिर कटिस्नायुशूल तंत्रिका32 (यानी, केंद्रीय रीढ़ की हड्डी से मध्य-निचले हिंदलिम्ब तक फैले एक बड़े क्षेत्र) को काटने के लिए कैंची का उपयोग करें। ओवरलाइंग बाइसेप्स फेमोरिस मांसपेशियों के साथ-साथ किसी भी अन्य मांसलता और संयोजी ऊतक को हटा दें जो कटिस्नायुशूल तंत्रिका के पास है। कटिस्नायुशूल तंत्रिका और आसपास के रक्त वाहिकाओं को नुकसान पहुंचाने से बचें, विशेष रूप से पार्श्व गैस्ट्रोनेमियस सिर के पेटेला /
    6. जब बरकरार कटिस्नायुशूल तंत्रिका पर्याप्त रूप से उजागर होती है, तो निर्जलीकरण को रोकने के लिए कटिस्नायुशूल तंत्रिका के आसपास के क्षेत्र में पूर्ववर्ती बाँझ खारा लागू करें। गहरी झूठ बोलने संयोजी ऊतक को बाधित करने के लिए घुमावदार संदंश का प्रयोग करें और तंत्रिका के नीचे पूर्व तैयार पैराफिल्म 'पच्चर' जगह। पूरा होने पर, उजागर क्षेत्र पर खारा-भिगोए हुए कपास ऊन रखें और माउस को गर्मी चटाई (37 डिग्री सेल्सियस पर सेट) के शीर्ष पर स्थित प्रेरण कक्ष में ले जाएं, जिसे अभी भी ओ2 में आइसोफ्लूरेन से भरा जाना चाहिए।
  2. In vivo एक्सोनल इमेजिंग
    1. अनुकूलित माइक्रोस्कोप चरण पर एक 22 x 64 मिमी कवरग्लास रखें और टेप के साथ अपनी स्थिति सुरक्षित करें। उद्देश्य के लिए विसर्जन तेल का चयन करें और लागू करें, और फिर माइक्रोस्कोप चरण को उल्टे माइक्रोस्कोप से कनेक्ट करें। धीरे-धीरे तेल-विसर्जित उद्देश्य को बढ़ाएं जब तक कि तेल और कवरग्लास के बीच संपर्क न हो जाए।
      नोट: या तो 40x, 1.3 संख्यात्मक एपर्चर (एनए) डीआईसी प्लान-एपोक्रोमैट या 63x, 1.4 एनए डीआईसी प्लान-एपोक्रोमैट तेल-विसर्जन उद्देश्यों का उपयोग कटिस्नायुशूल तंत्रिका में विवो परिवहन में छवि के लिए किया जा सकता है।
    2. माइक्रोस्कोप चरण पर संवेदनाहारी मुखपत्र ले जाएँ और संज्ञाहरण के लिए गड़बड़ी को रोकने के लिए टेप के साथ संज्ञाहरण नली सुरक्षित। कटिस्नायुशूल तंत्रिका से कपास ऊन निकालें और कवरग्लास का सामना करना पड़ उजागर तंत्रिका के साथ, प्रेरण कक्ष से मुखपत्र के लिए माउस हस्तांतरण। माउस के सिर मुखपत्र के लिए तय किया गया है और संज्ञाहरण के सबसे कम, प्रभावी स्तर को बनाए रखने के लिए सर्जिकल टेप का प्रयोग करें। धीरे अपनी पूंछ से माउस लिफ्ट और निर्जलीकरण और सहायता इमेजिंग को प्रतिबंधित करने के लिए उजागर कटिस्नायुशूल तंत्रिका के पास कवरस्लिप के लिए बाँझ खारा जोड़ें।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए पर्यावरण कक्ष के सभी दरवाजे बंद करें कि क्षेत्र शरीर के तापमान पर रहता है।
    3. ओकुलर का उपयोग करके, कटिस्नायुशूल तंत्रिका का पता लगाएं, इष्टतम केंद्र बिंदु निर्धारित करें, और मोटाइल एक्सोनल ऑर्गेनेल युक्त ब्याज के क्षेत्र का चयन करें।
      नोट: इस प्रक्रिया का एक विस्तृत विवरण पहले32 वर्णित किया गया है।
    4. अधिग्रहण बटन (या समकक्ष) पर क्लिक करके कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर पर स्विच करें, और रुचि के क्षेत्र का चयन करें। कुल >80x आवर्धन प्राप्त करने के लिए एक डिजिटल ज़ूम का उपयोग करें और अक्षतंतुओं को क्षैतिज रूप से कल्पना करने के लिए चयनित क्षेत्र को घुमाएं (उदाहरण के लिए, दाएं-से-बाएं चलती प्रतिगामी कार्गो और बाएं-से-दाएं चलती एंटरोग्रेड कार्गो)।
      नोट: दिशात्मकता पैरामीटर उपयोगकर्ता पर निर्भर हैं, लेकिन प्रयोगों के दौरान सुसंगत रहना चाहिए।
    5. लेजर तीव्रता (0.2 - 1%), पिनहोल एपर्चर (1 एयू - अधिकतम), लाभ (मास्टर) (700 - 1000), डिजिटल ऑफसेट (-50 - 0), और डिजिटल लाभ (1.0 - 4.0) जैसे मापदंडों को समायोजित करके सिग्नल तीव्रता का अनुकूलन करें। फोटोटॉक्सिसिटी के संभावित प्रभाव को कम करने के लिए, 2% की अधिकतम लेजर तीव्रता के साथ, जहां संभव हो, ≤ 1% पर लेजर तीव्रता बनाए रखें। इष्टतम संकेत का पता लगाने के लिए लेजर तीव्रता को समायोजित करने से पहले अन्य सभी मापदंडों को बदलें।
    6. क्षेत्र बॉक्स (या समतुल्य) पर क्लिक करें, ब्याज के आयताकार क्षेत्र का चयन करें, फिर अधिग्रहण मोड (या समतुल्य) में, फ्रेम आकार को न्यूनतम 1024 x 1024 पिक्सेल पर सेट करें, और 100-1,000 फ़्रेम्स का समय-चूक अधिग्रहण प्रारंभ करें।
      नोट: वांछित फ्रेम अधिग्रहण दर उपयोगकर्ता पर निर्भर है (उदाहरण के लिए, परिवहन का मूल्यांकन 0.1 और 6 एस के बीच फ्रेम दरों के साथ किया जा सकता है) और सॉफ्टवेयर मापदंडों के साथ समायोजित किया जा सकता है, जैसे कि ब्याज का क्षेत्र, स्कैन गति समय, अधिग्रहण औसत, और लेजर दिशात्मकता। उदाहरण के लिए, धीमी फ्रेम दर प्राप्त करने के लिए, ब्याज के क्षेत्र की ऊंचाई / चौड़ाई बढ़ाएं, धीमी स्कैन गति प्राप्त करें, अधिग्रहण औसत बढ़ाएं, और एकल लेजर दिशात्मकता का उपयोग करें, और इसके विपरीत तेज फ्रेम दर के लिए। फ्रेम अधिग्रहण दर तुलनीय डेटासेट में संगत रहना चाहिए क्योंकि विभिन्न आवृत्तियों पर इमेजिंग विसंगतियों का कारण बन सकती है। सिग्नलिंग एंडोसोम जैसे फास्ट कार्गो को माइटोकॉन्ड्रिया जैसे धीमे ऑर्गेनेल की तुलना में तेज फ्रेम दर (जैसे 0.1-3 एस) की आवश्यकता होती है, जिसका विश्लेषण धीमी दर (जैसे 2.5-6 एस) का उपयोग करके किया जा सकता है।
    7. माउस प्रति तीन अक्षतंतु की एक न्यूनतम से 10 गतिशील कार्गो की एक न्यूनतम पर कब्जा करने के लिए लक्ष्य।
      नोट: दो-नमूना के आधार पर, दो तरफा शक्ति गणना (0.8 (1−β) की मानक शक्ति और 5% (α) की प्रकार I त्रुटि दर के साथ), 6-8 के नमूना आकार जंगली प्रकार और रोग मॉडल35,43 के बीच अक्षीय परिवहन अंतर की पहचान करने के लिए पर्याप्त हैं।
    8. एक बार इमेजिंग पूरा हो जाने के बाद, संज्ञाहरण (जैसे, ग्रीवा अव्यवस्था) के तहत माउस को तुरंत इच्छामृत्यु दें। पोस्टमार्टम ऊतक, जैसे मांसपेशियों और कटिस्नायुशूल तंत्रिकाओं को भी आगे के विश्लेषण के लिए काटा जा सकता है।

Representative Results

यह पेपर एक बहुमुखी प्रोटोकॉल का विवरण देता है जो कृंतक मॉडल में इन विवो एक्सोनल ट्रांसपोर्ट टूलकिट का विस्तार करता है। चित्रा 1 दर्शाता है कि मोटर न्यूरॉन अक्षतंतु को ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके संवेदी न्यूरॉन अक्षतंतु और श्वान कोशिकाओं दोनों से अलग किया जा सकता है। चित्रा 1 ए एक जीवित, संवेदनाहारी चैट.ईजीएफपी माउस से कोलीनर्जिक मोटर अक्षतंतु में ईजीएफपी अभिव्यक्ति को दर्शाता है। चित्रा 1 बी एक ताजा उत्पादित तंत्रिका (यानी, कोई अतिरिक्त ऊतक प्रसंस्करण) में टीडीटोमैटो अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए एक वैकल्पिक विधि का उपयोग करता है। इसलिए, ट्रांसजेनिक उपभेदों जैसे कि चैट.ईजीएफपी, सीएचएटी.टीडीटोमैटो या एचबी 9.जीएफपी का उपयोग विवो में मोटर अक्षतंतु-विशिष्ट लेबलिंग को सक्षम बनाता है।

वैकल्पिक रूप से, कंकाल की मांसपेशियों में ट्रेसर / मार्कर (जैसे,एचसीटी31,32 या ईजीएफपी15 को एन्कोडिंग करने वाले वायरस) को इंजेक्ट करके अक्षतंतु की पहचान की जा सकती है। चित्रा 2 इस तरह के एक आवेदन पर प्रकाश डाला गया है, जिसमें आठ मजबूत रूप से व्यक्त किए गए चैट.ईजीएफपी-पॉजिटिव अक्षतंतु को दर्शाया गया है जिसमें टीए मांसपेशियों में एचसीटी -555-पॉजिटिव सिग्नलिंग एंडोसोम (सफेद तीर), ~ 4 एच पोस्ट जांच इंजेक्शन शामिल हैं। इस प्रयोगात्मक डिजाइन का उपयोग करके, हम टीए-इनरवेटिंग α-मोटर न्यूरॉन्स की पहचान कर सकते हैं, जो मुख्य रूप से तेजी से वसायुक्त44 हैं। कम मजबूत ईजीएफपी अभिव्यक्ति (चित्रा 2 ए, नारंगी तारांकन) के साथ एक और पांच चैट.ईजीएफपी अक्षतंतु आंशिक रूप से फोकस से बाहर थे और कटिस्नायुशूल तंत्रिका के भीतर थोड़ा गहरा स्थित होने की संभावना थी।

इसके अलावा, हमने ईजीएफपी-नकारात्मक संवेदी अक्षतंतु (पीले तीर) में एचसीटी -555-पॉजिटिव सिग्नलिंग एंडोसोम की पहचान की। इस प्रकार, इस प्रयोगात्मक प्रतिमान का उपयोग करके, कोई विशेष रूप से विवो में मोटर बनाम संवेदी न्यूरॉन्स में सिग्नलिंग एंडोसोम के अक्षीय परिवहन का आकलन और तुलना कर सकता है । दरअसल, इस ट्रांसजेनिक रिपोर्टर तनाव का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि चैट.ईजीएफपी-पॉजिटिव मोटर अक्षतंतु में सिग्नलिंग एंडोसोम का परिवहन चैट.ईजीएफपी-नकारात्मक संवेदी अक्षतंतु की तुलना में तेज है, जिसे अक्षतंतु चौड़ाई43 का उपयोग करके मज़बूती से विभेदित किया जा सकता है।

हमने पहले विवो43 में चैट.ईजीएफपी माउस का उपयोग करके मोटर न्यूरॉन अक्षतंतु की पहचान की है। अब हम रिपोर्ट करते हैं कि एचबी 9। जीएफपी चूहों का उपयोग विवो में मोटर न्यूरॉन अक्षतंतु पहचान प्राप्त करने के लिए भी किया जा सकता है। दरअसल, चित्रा 3 एचबी 9 की समय-चूक छवियों की एक श्रृंखला प्रस्तुत करता है। जीएफपी अक्षतंतु जिसमें प्रतिगामी रूप से चलतीएचसीटी -555-पॉजिटिव सिग्नलिंग एंडोसोम होते हैं। ध्यान दें कि, चैट-संचालित अभिव्यक्ति के विपरीत, जीएफपी में एचबी 9 में अधिक पंचर / जीएफपी अक्षतंतु; इसका कारण स्पष्ट नहीं है।

हमने पहले वर्णित किया है कि माइटोकॉन्ड्रियल-टारगेटिंग डाई, टेट्रामेथिलरोडामाइन, एथिल एस्टर, परक्लोरेट (टीएमआरई) 32,36 के इंट्रास्कियटिक तंत्रिका इंजेक्शन के माध्यम से कटिस्नायुशूल तंत्रिकाओं में विवो माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता की निगरानी कैसे करें। मोटर बनाम संवेदी माइटोकॉन्ड्रिया को मज़बूती से अलग करने के लिए, माइटो.सीएफपी माउस, जो थाइ 1 प्रमोटर18 के तहत सीएफपी व्यक्त करता है, ट्रांसजेनिक चूहों के साथ पार किया जा सकता है जो विशिष्ट न्यूरोनल प्रकारों में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन व्यक्त करते हैं। दरअसल, चैट.टीडीटोमैटो चूहों (जिसे चैट.टीडीटोमैटो :: माइटो.सीएफपी के रूप में संदर्भित किया जाता है) के साथ माइटो.सीएफपी चूहों को प्रजनन करके, हम विशेष रूप से मोटर अक्षतंतु में माइटोकॉन्ड्रिया की कल्पना कर सकते हैं, जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है। इस लाइव मल्टीप्लेक्स उदाहरण में, पांच चैट.टीडीटो एक्सॉन की कल्पना की जा सकती है, जिनमें से चार में सीएफपी-पॉजिटिव माइटोकॉन्ड्रिया होता है। इसके अलावा, रणवीर (पैनल iii में सफेद तीर) के नोड की भी पहचान की जा सकती है। इसके अलावा, रणवीर के नोड्स सीएचएटी.ईजीएफपी, एचबी 9 में स्पष्ट रूप से पता लगाने योग्य हैं। जीएफपी और मिटो.सीएफपी चूहों (नहीं दिखाया गया है)। ये डबल-ट्रांसजेनिक उपभेद मोटर न्यूरॉन-विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री और अक्षीय परिवहन गतिशीलता की निगरानी के लिए जीवित, संवेदनाहारी चूहों के समय-चूक इंट्रावाइटल इमेजिंग को सक्षम करते हैं।

अंत में, सिग्नलिंग एंडोसोम और माइटोकॉन्ड्रिया को विवो में एक ही अक्षतंतु के भीतर समवर्ती रूप से मिटो.सीएफपी चूहों (चित्रा 5) की मांसपेशियों मेंएचसीटीइंजेक्शन लगाकर कल्पना की जा सकती है। एचसी टी-555 के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन इमेजिंग से पहले एक माइटो.सीएफपी माउस ~ 4 घंटे में टीए मांसपेशियों में किए गए थे। माइटोकॉन्ड्रिया (मैं पैनल) और सिग्नलिंग एंडोसोम (द्वितीय पैनल) दोनों को एक साथ मांसपेशियों-विशिष्ट अक्षतंतु (यानी, टीए को आंतरिक करने वाले अक्षतंतु) में देखा गया था। दरअसल, पूर्वगामी (पीले त्रिकोण) और प्रतिगामी (हरे त्रिकोण और सर्कल) चलती ऑर्गेनेल के साथ-साथ रुके हुए ऑर्गेनेल (नारंगी त्रिकोण और सर्कल) देखे जा सकते हैं। इस प्रयोगात्मक प्रतिमान का उपयोग करके, कोई भी विवो में एक्सोनल माइटोकॉन्ड्रिया और सिग्नलिंग एंडोसोम के बीच जटिल कार्यात्मक बातचीत का आकलन कर सकता है। कुल मिलाकर, हम सिग्नलिंग एंडोसोम और / या माइटोकॉन्ड्रिया के अक्षीय परिवहन का आकलन करने के लिए कई अलग-अलग प्रयोगात्मक दृष्टिकोण प्रदर्शित करते हैं, विशेष रूप से विवो में कोलीनर्जिक मोटर न्यूरॉन्स में।

Figure 1
चित्रा 1: कटिस्नायुशूल तंत्रिका मोटर अक्षतंतु (ए) एक चैट.ईजीएफपी माउस से विवो में प्राप्त ईजीएफपी-पॉजिटिव मोटर अक्षतंतु की प्रतिनिधि एकल-विमान छवि। (बी) एक सीएचएटी.टीडीटोमैटो माउस से एक एक्साइज्ड कटिस्नायुशूल तंत्रिका में टीडीटोमैटो-पॉजिटिव मोटर अक्षतंतु की प्रतिनिधि एकल-विमान छवि। एक्सोन कैलिबर में भेद माउस उम्र और आकार में अंतर के परिणामस्वरूप होता है। स्केल सलाखों = 50 μm. संक्षिप्त नाम: ईजीएफपी = बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; सीएटी = कोलीन एसिटाइलट्रांसफेरेज़। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: लाइव कटिस्नायुशूल तंत्रिका मोटर और सीएचएटी.ईजीएफपी माउस के संवेदी न्यूरॉन्स में सिग्नलिंग एंडोसोम के विवो एक्सोनल परिवहन में ( ए-सी ) ईजीएफपी (ए) को व्यक्त करने वाले कोलीनर्जिक अक्षतंतु की प्रतिनिधि छवियां और एचसीटी -555-पॉजिटिव सिग्नलिंग एंडोसोम (बी), और मर्ज (सी)। सफेद तीर एक ईजीएफपी-पॉजिटिव मोटर अक्षतंतु को उजागर करते हैं जिसमें एचसीटी -555-पॉजिटिव सिग्नलिंग एंडोसोम होते हैं, सियान तीरएचसीटी-555-पॉजिटिव सिग्नलिंग एंडोसोम की कमी वाले मोटर अक्षतंतु की पहचान करते हैं, और पीले तीर एक ईजीएफपी-नकारात्मक संवेदी अक्षतंतु को उजागर करते हैं जोएचसीटी -555-पॉजिटिव सिग्नलिंग एंडोसोम को परिवहन करता है। ऑरेंज तारांकन कमजोर ईजीएफपी अभिव्यक्ति के साथ मोटर अक्षतंतु की पहचान करते हैं। स्केल बार = 25 μm। संक्षिप्त नाम: ईजीएफपी = बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; सीएचएटी = कोलीन एसिटाइलट्रांसफेरेज़; एचसीटी -555 = टेटनस विष-बाध्यकारी डोमेन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एक एचबी 9 के लाइव मोटर न्यूरॉन्स में सिग्नलिंग एंडोसोम के विवो एक्सोनल परिवहन में प्रतिनिधित्व करने वाली समय-चूक छवि श्रृंखला। जीएफपी माउस। (ए-डी) हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (i) को व्यक्त करने वाले मोटर न्यूरॉन अक्षतंतु को दर्शाते हुए हर 3 एस ली गई समय-चूक छवियां और एचसीटी -555-पॉजिटिव सिग्नलिंग एंडोसोम (ii), और मर्ज (iii) युक्त। एक ही रंग का प्रत्येक चक्र विभिन्न फ्रेमों में एक ही चलती एंडोसोम की पहचान करता है। प्रतिगामी आंदोलन दाएं से बाएं है। स्केल बार = 10 μm। संक्षिप्त नाम: जीएफपी = ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एचसीटी -555 = टेटनस विष-बाध्यकारी डोमेन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एक चैट.टीडीटोमैटो के जीवित कटिस्नायुशूल तंत्रिका मोटर न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रिया के विवो एक्सोनल परिवहन में:: माइटो.सीएफपी: माउस( ए-सी) टीडीटोमैटो-पॉजिटिव मोटर एक्सॉन (ए) की प्रतिनिधि छवियां, जिसमें सीएफपी-पॉजिटिव माइटोकॉन्ड्रिया (बी), और मर्ज (सी) शामिल हैं। इनसेट छवियों मैं-iii प्रत्येक पैनल से एक उच्च आवर्धन होते हैं। सफेद तीर रणवीर के एक संदिग्ध नोड का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल सलाखों = 25 (ए-सी) और 10 μm (मैं-iii)। संक्षिप्त नाम: चैट = कोलीन एसिटाइलट्रांसफेरेज़; सीएफपी = सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: माइटोकॉन्ड्रिया के विवो एक्सोनल परिवहन में समवर्ती का प्रतिनिधित्व करने वाली समय-चूक छवि श्रृंखला और माइटो.सीएफपी माउस के लाइव कटिस्नायुशूल तंत्रिका मोटर न्यूरॉन्स में सिग्नलिंग एंडोसोम। (ए-सी) माइटोकॉन्ड्रिया (i) और सिग्नलिंग एंडोसोम (ii) दोनों के अक्षतंतु परिवहन को दर्शाते हुए प्रत्येक 3 एस में ली गई समय-चूक छवियां एक ही कटिस्नायुशूल तंत्रिका अक्षतंतु (iii) के भीतर होती हैं। पीले त्रिकोण पूर्वगामी रूप से चलने वाले कार्गो की पहचान करते हैं, हरे वृत्त / त्रिकोण प्रतिगामी रूप से चलने वाले कार्गो की पहचान करते हैं, और नारंगी सर्कल / त्रिकोण स्थिर कार्गो की पहचान करते हैं। एंटरोग्रेड आंदोलन बाएं से दाएं है, जबकि प्रतिगामी आंदोलन विपरीत दिशा में है। स्केल बार = 10 μm. संक्षिप्त नाम: एचसीटी -555 = टेटनस विष-बाध्यकारी डोमेन; सीएफपी = सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यह प्रोटोकॉल माउस कटिस्नायुशूल तंत्रिका के बरकरार अक्षतंतु में सिग्नलिंग एंडोसोम और माइटोकॉन्ड्रिया के विवो एक्सोनल परिवहन में आकलन करने के लिए चरणों का विवरण देता है। दरअसल, एक प्रयोगात्मक सेटअप प्रदान किया जाता है जो उपयोगकर्ताओं को सक्षम बनाता है 1) मोटर न्यूरॉन्स में संवेदी न्यूरॉन्स से मोटर को अलग करता है विवो में, सीटू में, और पूर्व विवो में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन को व्यक्त करने वाले चूहों का उपयोग करके चुनिंदा मोटर न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है; 2) विशेष रूप से तीन अलग-अलग ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके मोटर न्यूरॉन अक्षतंतु में सिग्नलिंग एंडोसोम के विवो एक्सोनल परिवहन में आकलन करें; 3) विशेष रूप से मोटर न्यूरॉन अक्षतंतु में माइटोकॉन्ड्रिया के विवो एक्सोनल परिवहन में जांच करें; और 4) एक ही अक्षतंतु के भीतर सिग्नलिंग एंडोसोम और माइटोकॉन्ड्रिया की विवो परिवहन गतिशीलता में समवर्ती मूल्यांकन करें। इस दृष्टिकोण में बेसल स्थितियों में अक्षीय परिवहन की जांच करने की विशाल क्षमता है और इसका उपयोग परिधीय मोटर और संवेदी तंत्रिकाओं को प्रभावित करने वाले विभिन्न रोगों में रोग संबंधी गड़बड़ी का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

नींव31,32 के रूप में पिछले प्रयोगात्मक प्रतिमानों का उपयोग करते हुए, यहां हमारे पास ट्रांसजेनिक रिपोर्टर चूहों का उपयोग करके मोटर बनाम संवेदी न्यूरॉन्स में होने वाले अक्षीय परिवहन को अलग करने के विस्तृत उपन्यास, मजबूत तरीके हैं। सीएफपी माउस का उपयोग करते हुए, इस दृष्टिकोण को टीएमआरई36 के इंट्रासाइटिक तंत्रिका इंजेक्शन से परहेज करके विवो माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन में आकलन करने के लिए विकसित किया गया है। यह जांच के इंट्रानेर्व इंजेक्शन के कारण एक्सोनल परिवहन में संभावित तंत्रिका क्षति और गड़बड़ी को दरकिनार करता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल मोटर अक्षतंतु में कई ऑर्गेनेल के अक्षीय परिवहन के दृश्य की अनुमति देता है जो अलग-अलग शारीरिक गुणों (जैसे, फास्ट-ट्विच फैटिगेबल मांसपेशियों बनाम धीमी-चिकोटी थकान प्रतिरोधी मांसपेशियों) के साथ मांसपेशियों को आंतरिक बनाता है। जैसे, सिग्नलिंग एंडोसोम और / या माइटोकॉन्ड्रियल एक्सोनल ट्रांसपोर्ट डायनेमिक्स का मूल्यांकन α-मोटर न्यूरॉन्स44 के विभिन्न सबसेट में किया जा सकता है। इसके अलावा, पैथोलॉजिकल सेटिंग्स में उन ऑर्गेनेल के अक्षीय परिवहन का मूल्यांकन विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों 1,2,3 के माउस मॉडल के साथ क्रॉसब्रीडिंग के माध्यम से भी किया जा सकता है।

एक्सोनल ट्रांसपोर्ट टूलकिट लगातार28,29 का विस्तार कर रहा है, और पूर्व विवो प्रोटोकॉल सुसंस्कृत माउस वेंट्रल हॉर्न एक्सप्लांट्स49 या एक्साइज्ड माउस तंत्रिका-मांसपेशियों की तैयारी50 का उपयोग करके परिवहन गतिशीलता का आकलन करने के लिए विकसित किया गया है। इसके अलावा, प्रेरित मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) -व्युत्पन्न कॉर्टिकल51 न्यूरॉन्स या एचआईपीएससी-व्युत्पन्न रीढ़ की हड्डी मोटर न्यूरॉन्स52 में अक्षीय परिवहन का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल के विकास ने रोग पैदा करने वाले उत्परिवर्तन के साथ मानव न्यूरॉन्स की जांच को सक्षम किया है। माउस ऊतक और मानव कोशिकाओं में इस तरह के अत्याधुनिक प्रोटोकॉल न्यूरोनल फ़ंक्शन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग मॉडल में उपन्यास रोग तंत्र की खोज की सुविधा प्रदान कर सकते हैं, और चिकित्सीय अणुओं और रणनीतियों का परीक्षण करने के लिए उपयोग किए जा सकते हैं।

इन तकनीकों के सफल कार्यान्वयन के लिए कई महत्वपूर्ण चरणों का पालन करने की आवश्यकता है, और प्रोटोकॉल अनुभाग में कुछ महत्वपूर्ण नोट्स प्रदान किए गए हैं। इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए प्रमुख आवश्यकताएं अनुकूलित चरण डालने के साथ उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और संज्ञाहरण और इष्टतम तापमान बनाए रखने के लिए उपकरण हैं। दरअसल, 1) संज्ञाहरण के प्रेरण के लिए एक विशेष मोबाइल संवेदनाहारी प्रणाली की आवश्यकता होती है, 2) विच्छेदन / ऊतक प्रसंस्करण (यानी, कटिस्नायुशूल तंत्रिका को उजागर करना), और 3) इंट्रावाइटल इमेजिंग के दौरान संज्ञाहरण बनाए रखना (जैसा कि पहले 31,32 में विस्तृत है)। विशेष रूप से उच्च आवर्धन उद्देश्यों (जैसे, 40x या 63x) का उपयोग करते समय, संज्ञाहरण की गहराई छवि की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकती है, क्योंकि गहरी संज्ञाहरण बड़ी 'गैसी' सांसों को प्रेरित करती है जिसके परिणामस्वरूप फोकस में लगातार बदलाव होता है। इस तरह के बड़े आंदोलननिश्चित रूप से पोस्ट इमेजिंग परिवहन विश्लेषण (जैसे, फिजी प्लगइन्स ट्रैकमेट53 या किमोएनालाइज़र54 का उपयोग करके कार्गो को ट्रैक करना) को प्रभावित करेंगे क्योंकि श्वास आंदोलन समय-चूक वीडियो में कलाकृतियों का उत्पादन करते हैं जो उन्हें स्वचालित ट्रैकिंग के लिए अनुपयुक्त प्रदान कर सकते हैं या अधिक समय लेने वाले मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, हमने कटिस्नायुशूल तंत्रिका के भीतर स्पंदित धमनियों के कारण इमेजिंग कलाकृतियों को भी देखा है, जिसे केवल एक अलग इमेजिंग क्षेत्र चुनकर हल किया जा सकता है। माइक्रोस्कोप को निरंतर शरीर के तापमान को बनाए रखने में सक्षम एक पर्यावरणीय कक्ष से सुसज्जित किया जाना चाहिए, क्योंकि तापमान और पीएच प्रभाव अक्षीय परिवहन55। इसके अलावा, सर्जरी के बाद एनाल्जेसिक के आवेदन से बचा जाना चाहिए, क्योंकि वे परिवहन गतिशीलता56 को बदल सकते हैं। यदि प्रयोगात्मक डिजाइन अनुदैर्ध्य है और बार-बार इमेजिंग (जैसे, 57) की आवश्यकता होती है, तो विच्छेदन प्रोटोकॉल को न्यूनतम इनवेसिव होने के लिए उचित रूप से समायोजित करने की आवश्यकता होती है और अतिरिक्त नैतिक /

कुछ प्रायोगिक विचारों को ध्यान में रखने की आवश्यकता है। सबसे पहले, यहां विस्तृत अधिकांश प्रोटोकॉल में ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग शामिल है जो माइटोकॉन्ड्रिया या मोटर न्यूरॉन अक्षतंतु में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन रखते हैं। इन माउस लाइनों में से प्रत्येक को हेमी-/ विषमयुग्मजी के रूप में नस्ल और चित्रित किया जाना चाहिए। अपवाद, हालांकि, चैट.क्रे और रोसा 26.टीडीटोमैटो माउस लाइनें हैं जिन्हें अलग से होमोजाइगोट्स के रूप में बनाए रखा जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप हेमिजाइगोट संतानों ने क्रे-लॉक्सपी पुनर्संयोजन के बाद कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स में टीडीटोमैटो अभिव्यक्ति को सक्षम किया है। विषमयुग्मजी चूहों (जैसे, चैट.ईजीएफपी) के साथ क्रॉस-ब्रीडिंग ट्रांसजेनिक हेमी-/ विषमयुग्मजी चूहों (जैसे, माइटो.सीएफपी), किसी को प्रजनन रणनीति पर सावधानीपूर्वक विचार करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि डबल-उत्परिवर्ती संतान की वांछित संख्या प्राप्त करना समय लेने वाला हो सकता है। इसके अलावा, अतिरिक्त ट्रांसजेनिक उपभेदों (जैसे, माइटो.सीएफपी) के साथ चैट.क्रे और रोजा 26.टीडीटोमैटो चूहों (यानी, सीएचएटी.टीडीटोमैटो) की एफ 1 पीढ़ी का प्रजनन करते समय, किसी को वांछित ट्रिपल ट्रांसजीन ले जाने वाले कम चूहों की उम्मीद करनी चाहिए। इसके अलावा, किसी को पास के तरंग दैर्ध्य गुणों के साथ दो-रिपोर्टर चूहों को प्रजनन करते समय संभावित फ्लोरोफोर ओवरलैप पर भी विचार करना चाहिए (उदाहरण के लिए, मितो-सीएफपी-उत्तेजना: 435 एनएम, उत्सर्जन: 485 एनएम, चैट.ईजीएफपी-उत्तेजना के साथ नस्ल: 488 एनएम, उत्सर्जन: 510 एनएम), हालांकि वर्णक्रमीय अनमिक्सिंग58 के साथ इस समस्या को दूर करना संभव हो सकता है।

इस तकनीक की कुछ सीमाएं हैं जिन पर विचार किया जाना चाहिए। इस काम और हमारे पिछले प्रोटोकॉल31,32 में, हमने दिखाया है कि विवो में अलग-अलग ऑर्गेनेल को लेबल और ट्रैक करने के लिए कई आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड मार्करों और विभिन्न धुंधला तरीकों का उपयोग कैसे किया जा सकता है। हालांकि, सभी जांच इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त नहीं हैं। हमने हैजा विष बीटा सबयूनिट (सीटीबी) -488 (इमेजिंग से पहले 0.5-1.5 μg / μL ~ 4 घंटे) के टीए या सोलस मांसपेशियों में इंजेक्शन का आकलन किया, एक जांच नियमित रूप से विवो प्रतिगामी अनुरेखक प्रयोगों59,60 में मोटर न्यूरॉन सेल निकायों को लेबल करने के लिए उपयोग की जाती है। हालांकि, जब अकेले इंजेक्शन दिया जाता है याएचसीटी -555 के साथ सह-इंजेक्शन दिया जाता है, तो सफल प्रतिगामी मोटर न्यूरॉन ट्रेसिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले सांद्रता के समान सांद्रता का उपयोग करने के बावजूद सीटीबी -488 लेबलिंग खराब थी। इस प्रकार, हम निष्कर्ष निकालते हैं कि, सीटीबी न्यूरोनल संस्कृतियों61 में सिग्नलिंग एंडोसोम के इन विट्रो मार्कर में एक उत्कृष्ट होने के बावजूद,एचसीटीकटिस्नायुशूल तंत्रिका अक्षतंतु में विवो में सिग्नलिंग एंडोसोम की पहचान करने के लिए स्वर्ण-मानक जांच बनी हुई है।

विभिन्न मार्गों का उपयोग करते हुए, हमने लाइसोसोम को लेबलिंग के लिए नियमित रूप से उपयोग की जाने वाली जांच का भी परीक्षण किया, जैसे कि लाइसोट्रैकर ग्रीन डीएनडी -26, और सक्रिय लाइसोसोमल हाइड्रोलेज़ के मार्कर, जैसे कैथेप्सिन डी62 के लिए बीओडीआईपीवाई-एफएल-पेप्स्टेटिन ए और कैथेप्सिन बी के लिए मैजिक रेड, लेकिन कोई सफलता नहीं मिली। हमने इमेजिंग से पहले टीए ~ 4 घंटे में 2.5 μg) के इंट्रामस्क्युलर डिलीवरी की कोशिश की, साथ ही इमेजिंग से पहले लाइसोट्रैकर (10 μM), BODIPY-FL-पेप्स्टेटिन ए (10 μM) या मैजिक रेड (1/10) 30-60 मिनट के इंट्रास्कुलेटिक तंत्रिका इंजेक्शन। तंत्रिका को उजागर करने वाली इन जांचों के बावजूद, हम स्पष्ट रूप से लेबल वाले ऑर्गेनेल खोजने में असमर्थ थे। जांच अक्षतंतु के आसपास जमा हुई, संभवतः श्वान कोशिकाओं द्वारा बनाए रखा जा रहा है। इसलिए, लाइसोसोम की असफल लेबलिंग न्यूरॉन्स में जांच वितरण की कमी के कारण हो सकती है, हालांकि अधिक उपयुक्त सांद्रता के अस्तित्व से इनकार नहीं किया जा सकता है। यह देखते हुए कि टीएमआरई लेबलिंग समान परिस्थितियों (यानी, इंट्रासियटिक तंत्रिका इंजेक्शन) के तहत काम करती है, लेबलिंग तीव्रता डाई-निर्भर हो सकती है और प्रत्येक मार्कर के लिए स्वतंत्र रूप से परीक्षण किया जाना चाहिए। हालांकि, हम निष्कर्ष निकालते हैं कि इन जांचों के साथ विवो में लाइसोसोम को लक्षित करना ऊपर बताई गई सांद्रता पर संभव नहीं है।

संज्ञाहरण के तरीके अलग-अलग शारीरिक रीडआउट को बदल सकते हैं (उदाहरण के लिए, कोक्लीआ फ़ंक्शन63 और कॉर्टिकल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी64); हालाँकि, क्या कटिस्नायुशूल तंत्रिका में विवो एक्सोनल परिवहन में संज्ञाहरण प्रभाव वर्तमान में अज्ञात है। आइसोफ्लूरेन-प्रेरित संज्ञाहरण के तहत कम न्यूरोमस्कुलर गतिविधि को देखते हुए, यह संभव है कि परिवहन कैनेटीक्स जागृत अवस्था की तुलना में भिन्न हो। हालांकि, एकमात्र इन विवो अध्ययन जिसने सीधे इसकी जांच की है, से पता चला है कि थैलेमोकोर्टिकल अनुमानों में घने कोर पुटिकाओं का परिवहन संवेदनाहारी और जागृत चूहों65 के बीच भिन्न नहीं होता है। इसके अलावा, क्योंकि जंगली प्रकार और रोग मॉडल चूहों के बीच परिवहन में अंतर संज्ञाहरण35,43 के तहत पता लगाने योग्य हैं, यह स्पष्ट है कि आइसोफ्लूरेन एक्सपोजर एंडोसोम या माइटोकॉन्ड्रियल तस्करी के संकेत में गड़बड़ी की पहचान को नहीं रोकता है।

इस प्रोटोकॉल में अन्य संभावित अनुप्रयोग हैं, जिन्हें नीचे वर्णित किया गया है। न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग माउस मॉडल 1,2,3 के साथ इस प्रोटोकॉल (जैसे, माइटो.सीएफपी, सीएचएटी.ईजीएफपी) में उल्लिखित ट्रांसजेनिक चूहों का प्रजनन न्यूरॉन उपप्रकार- और / इसके अलावा, हाल ही में विकसित माउस क्रे लाइनें66 अलग-अलग संवेदी अक्षतंतु आबादी में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के दृश्य की भी अनुमति देगी। उदाहरण के लिए, रोसा 26.टीडीटोमैटो चूहों को न्यूरोपेप्टाइड वाई रिसेप्टर -2-एक्सप्रेसिंग (एनपीवाई 2 आर) के साथ पार किया जा सकता है। माइलिनेटेड ए-फाइबर नोसिसेप्टर्स67 में टीडीटोमैटो प्रतिदीप्ति को सक्षम करने के लिए क्रे माउस। इसके अलावा, अस्थायी नियंत्रण भी उत्प्रेरणीय क्रे सिस्टम (जैसे, टैमोक्सीफेन)68 का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। एक अन्य संभावित अनुप्रयोग श्वान कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक चूहों की उपलब्धता पर निर्भर करता है। दरअसल, एस 100-जीएफपी69 और पीएलपी-जीएफपी70 चूहों को विवो और / या श्वान कोशिकाओं के सीटू इमेजिंग में सक्षम बनाया गया है और परिधीय तंत्रिका उत्थान के दौरान श्वान सेल माइग्रेशन में शामिल अनुसंधान में सबसे आगे रहे हैं।

इन अनुप्रयोगों के अलावा और माइटो.सीएफपी माउस के पूरक कई ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की उपलब्धता है जो माइटोकॉन्ड्रिया और ऑटोफैगोसोम जैसे अलग-अलग ऑर्गेनेल में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते हैं। उदाहरण के लिए, विवो माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन में जांच माइटो :: एमकेटीई 2 माउस71 या फोटोकनवर्टिबल माइटोडेंड्रा माउस57 के साथ संभव हो सकती है। इसके अलावा, विवो माइटोफैगोसोम परिवहन में पीएच-संवेदनशील माइटो-कीमा माउस72 और माइटोफैगी विश्लेषण के लिए माइटो-क्यूसी माउस73 का उपयोग करके संभव हो सकता है। इसके अलावा, हमारे द्वारा सामना की जाने वाली लाइसोसोमल लेबलिंग कठिनाइयों को लैंप 1-जीएफपी व्यक्त करने वाले चूहों का उपयोग करके दूर किया जा सकता है, इस चेतावनी के साथ कि एलएएमपी 1 लाइसोसोम74 से अलग एंडोसाइटिक ऑर्गेनेल में भी मौजूद है।

संक्षेप में, हमने विविध ट्रांसजेनिक चूहों से विशिष्ट परिधीय तंत्रिका अक्षतंतु में कई ऑर्गेनेल के विवो एक्सोनल परिवहन में आकलन करने के लिए उपन्यास तरीके प्रदान किए हैं। माइटोकॉन्ड्रिया और एंडोसोम75,76 जैसे ऑर्गेनेल के एक्सोनल इंटरैक्शन और सह-तस्करी के हालिया निष्कर्षों को देखते हुए विभिन्न ऑर्गेनेल की समवर्ती इमेजिंग विशेष रूप से महत्वपूर्ण होगी। हमारा मानना है कि प्रस्तुत विधियां विवो में अक्षतंतु के बेसल शरीर विज्ञान की समझ में सुधार करने और परिधीय तंत्रिकाओं के न्यूरोडीजेनेरेशन को चलाने वाले महत्वपूर्ण पैथोमैकेनिज्म को खोलने के लिए उपयोगी होंगी।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

ब्राउनस्टोन (क्वीन स्क्वायर इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजी, यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन) को एचबी 9 साझा करने के लिए चैट-ईजीएफपी, सीएचएटी.क्रे और रोसा 26.टीडीटोमैटो चूहों, और पिएत्रो फ्रैटा (क्वीन स्क्वायर इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजी, यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन) को साझा करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। जीएफपी माउस। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए ऐलेना आर राइम्स, शार्लोट जेपी क्रेमर्स और किउहान लैंग (क्वीन स्क्वायर इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजी, यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन) को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को मोटर न्यूरॉन रोग एसोसिएशन (यूके) (टोसोलिनी / अक्टूबर 20 / 973-799) (एपीटी), वेलकम ट्रस्ट सीनियर इन्वेस्टिगेटर अवार्ड्स (107116 / जेड / 15 / जेड और 223022 / जेड / 21 / जेड) (जीएस), यूके डिमेंशिया रिसर्च इंस्टीट्यूट फाउंडेशन अवार्ड (जीएस) से जूनियर नॉन-क्लिनिकल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था; और एक मेडिकल रिसर्च काउंसिल कैरियर डेवलपमेंट अवार्ड (एमआर / एस 006990/1) (जेएनएस)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tube
70% (v/v) ethanol in distilled water
AlexaFlour555 C2 maleimide ThermoFisher Scientific A-20346 Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J Jackson Laboratory 7909 Rosa26.tdTomato mice
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice Jackson Laboratory 5029 HB9.GFP mice
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice Jackson Laboratory 7967 Mito.CFP mice
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice Jackson Laboratory 6410 ChAT.Cre mice
Computer with microscope control and image acquisition software Zeiss Zen
Cotton swab
Desktop centrifuge
Dissecting microscope
Eye lubricant
Fine curved forceps Dumont
Fine straight forceps Dumont
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1)
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger Drummond Scientific 5-000-1001-X10
Hair clippers
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) Merck 20779
HcT-441 N/A N/A See Restani et al., 2012 for more details
Heating pad
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C
Inverted confocal microscope with environmental chamber Zeiss LSM 780 Most inverted confocals should be adaptable
Isoflurane
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer
Magic tape invisible tape
Micropipette puller
Parafilm Parafilm
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02 BDNF that can be co-injected with HcT-555
Saline
Scalpel blade Dumont
Small spring scissors Dumont
Surgery/operating microscope
Surgical drape
Surgical suture
Surgical tape
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice MMRRC 000296-UCD ChAT.eGFP
Vortex mixer

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तंत्रिका विज्ञान अंक 178
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Tosolini, A. P., Villarroel-Campos,… More

Tosolini, A. P., Villarroel-Campos, D., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport. J. Vis. Exp. (178), e63471, doi:10.3791/63471 (2021).

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