Summary
Med hjälp av transgena fluorescerande möss beskrivs detaljerade protokoll för att bedöma axonal transport in vivo av signalendosomer och mitokondrier inom motoriska och sensoriska axoner av den intakta ischiasnerven hos levande djur.
Abstract
Axonal transport upprätthåller neuronal homeostas genom att möjliggöra dubbelriktad handel med olika organeller och laster. Störningar i axonala transporter har förödande konsekvenser för enskilda nervceller och deras nätverk och bidrar till en uppsjö av neurologiska störningar. Eftersom många av dessa tillstånd involverar både cellautonoma och icke-autonoma mekanismer, och ofta visar ett spektrum av patologi över neuronala subtyper, är metoder för att exakt identifiera och analysera neuronala delmängder absolut nödvändiga.
Detta dokument beskriver protokoll för att bedöma axonal transport in vivo av signalendosomer och mitokondrier i ischiasnerver hos bedövade möss. Stegvisa instruktioner ges för att 1) skilja motor från sensoriska neuroner in vivo, in situ och ex vivo genom att använda möss som selektivt uttrycker fluorescerande proteiner inom kolinerga motorneuroner; och 2) separat eller samtidigt bedöma in vivo axonal transport av signalendosomer och mitokondrier. Dessa kompletterande intravitala tillvägagångssätt underlättar samtidig avbildning av olika laster i distinkta perifera nervaxoner för att kvantitativt övervaka axonal transport vid hälsa och sjukdom.
Introduction
Det perifera nervsystemet (PNS) ansluter centrala nervsystemet (CNS) till dess distala mål, vilket gör att reläet av efferenta signaler kan utöva motorisk kontroll och afferenta signaler för att ge sensorisk återkoppling. Med hjälp av de många framstegen inom musgenetik har forskare utvecklat olika musmodeller för att undersöka många sjukdomar / syndrom som drabbar PNS 1,2,3. Eftersom de flesta neurodegenerativa patologier är multifaktoriella med cellautonoma och icke-autonoma bidrag 4,5, kan upplösning av cell- / neuronspecifika patologier ge avgörande, nya insikter om sjukdomsmekanismer.
För detta ändamål har utvecklingen av bakteriell artificiell kromosom (BAC) -transgena möss6 möjliggjort selektivt endogent uttryck av fluorescerande proteiner i riktade delmängder av neuroner. Till exempel finns BAC-transgena möss tillgängliga, som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) i kolinerga7 eller glycinerga neuroner8, eller en variant rött fluorescerande protein (tdTomato) i parvalbuminpositiva neuroner9. Alternativt kan selektivt neuronalt uttryck av fluorescerande proteiner uppnås via Cre-loxP-teknik 10. Till exempel kan musstammar som uttrycker Cre-rekombinas i delmängder av neuroner (t.ex. kolinacetyltransferas (ChAT)-Cre) födas upp med möss som uttrycker ett fluorescerande protein (t.ex. tdTomato eller GFP) från ett konstitutivt locus (t.ex. Gt (ROSA) 26Sor) under kontroll av en transkriptionell repressor flankerad av loxP-platser11 (t.ex. genererar möss som uttrycker tdTomato endast i kolinerga neuroner). Med hjälp av Cre-loxP-rekombination har transgena möss genererats som uttrycker gult fluorescerande protein i axoner i den fallande kortikospinalkanalen12.
Dessutom möjliggör de senaste framstegen inom CRISPR / Cas9-genredigering, såsom ORANGE, fluorescerande märkning av flera endogena neuronala proteiner, med uttryck som kan uppnås vid nanoskalaupplösning13. Dessutom, i kombination med Cre-uttryckande musstammar, kan ORANGE-CAKE användas för att märka flera endogena proteiner i enskilda neuroner13. Alternativt tillåter viralmedierad neuronal spårning också märkning av neuronala delmängder och kan uppnås med riktade kombinationer av virala serotyper och / eller cellspecifika promotorer 14,15,16,17.
Utöver de neuronala märkningsmetoderna har muslinjer också konstruerats för att uttrycka reporterproteiner riktade mot specifika organeller, såsom mitokondrier som uttrycker cyanfluorescerande protein (Mito.CFP)18 eller autofagosomer som uttrycker GFP (LC3.GFP)19. Dessutom har muslinjer konstruerats för att bedöma kalciumdynamik specifikt i nervceller (t.ex. Thy1.GCaMP)20,21. Sammantaget, med utvecklingen av sådana modeller, gör nya experimentella tillämpningar det möjligt för forskare att ställa mer exakta biologiska och patologiska frågor om CNS och PNS.
Huvudrollen för perifera motoriska nerver är att överföra elektriska signaler till skelettmuskulaturen för att framkalla rörelse. Dessutom, och förekommer över längre tidsskalor, passerar neurokemiska och fysiologiska meddelanden i form av olika organeller (t.ex. mitokondrier, endolysosomer, signalendosomer) cytoskelettnätverket på ett uni- eller dubbelriktat sätt för att upprätthålla neuronal homeostas 22,23,24. Försämringar i axonala transporter har katastrofala konsekvenser för neuronal hälsa och är kopplade till många neuroutvecklings- och neurodegenerativa sjukdomar25. På molekylär nivå kan försämringar i axonal transport störa fysiologiska händelser som reglerar synaptisk signalering och plasticitet, gentranskription och lokal översättning genom axon26,27. Även om det finns en mängd verktyg för att studera dessa händelser i odlade celler/neuroner28,29, krävs bedömning av axonal transportdynamik och axonalkopplade biologiska händelser in vivo för att bekräfta viktiga insikter om fysiologiska och patologiska processer30.
Under åren har Schiavo-laboratoriet optimerat protokoll för att ställa olika frågor om axonal transport 31,32,33,34,35,36. Dessa experiment har expanderat från upptäckten att ett fluorescerande märkt atoxiskt fragment av stelkrampsneurotoxin (HCT) internaliseras i axonterminaler i skelettmuskulaturen genom interaktioner med nidogens och polysialogangliosider37. När HCT har internaliserats transporteras det retrograd i Rab7-positiva, neurotrofininnehållande signalendosomer som är avsedda för cellkropparna i motoriska och sensoriska neuroner 38,39,40,41. Parallellt har framsteg inom bildteknik möjliggjort realtidsanalys av perifera nervbuntar och enskilda axoner i levande, sövda möss30. Den första razzian för att bedöma axonal transportdynamik in vivo i patologi avslöjade presymptomatiska försämringar vid transport av signalendosomer och mitokondrier i SOD1G93A-musmodellen av amyotrofisk lateralskleros (ALS)35. Det är viktigt att dessa defekter helt enkelt representerar sekundära konsekvenser av neurodegeneration, med tanke på upptäckten att motorneuronförlust kan uppstå i frånvaro av axonala transportstörningar i en musmodell av Kennedys sjukdom42 och en heterozygot mutant FUS-modell av ALS43. Sådana axonala transportunderskott kan åtgärdas hos ALS-möss med hjälp av hämmare av specifika kinaser33 eller tillväxtfaktorreceptorer34. Dessutom förändrar behandling av neuroner med en specifik histondeacetylasblockerare mitokondriell transport in vivo36. Senast rapporterar vi att den BDNF-beroende moduleringen av axonal transport är dysreglerad i distinkta motorneuronsubtyper hos ALS-möss44.
Genom att använda en ständigt växande verktygslåda för att bedöma axonal transportdynamik28,29, beskriver detta videoprotokoll flera applikationer som möjliggör ytterligare insikter i olika biologiska och patologiska scenarier. För det första används transgena möss som selektivt uttrycker fluorescerande proteiner i kolinerga neuroner (dvs. motorneuroner) för att skilja mellan motoriska och sensoriska axoner både in vivo och ex vivo. Fluorescerande märkt HCT laddas sedan in i signalendosomer i tre transgena linjer för att differentiera axonal transportdynamik i distinkta perifera neuroner. Nästa experimentella protokoll beskriver en multiplex fluorescensmetod för att bedöma mitokondriell transport specifikt i motorneuroner genom att odla ChAT.tdTomato-möss med Mito-CFP-möss. Slutligen ges instruktioner om hur man samtidigt avbildar mitokondrier och signalerar endosomer inom samma axon in vivo.
Protocol
All mushantering och experiment utfördes i enlighet med Animals (Scientific Procedures) Act (1986) och godkändes av University College London - Queen Square Institute of Neurology Ethics Committee.
1. Djur
- Hys alla djur i individuellt ventilerade burar i en temperatur- och luftfuktighetskontrollerad miljö och håll dem på en 12 timmars ljus / mörk cykel med ad libitum tillgång till mat och vatten.
- Använd både han- och honmöss av följande transgena stammar: 1) heterozygota Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd-möss, kallade ChAT.eGFP-möss; 2) heterozygot B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J, kallad HB9. GFP-möss; och 3) heterozygot B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J, kallad Mito.CFP-möss.
- Generera ChAT.tdTomato-möss genom att korsa homozygota B6;129S6-Chat tm2(cre)Lowl/J, kallade ChAT.Cre-möss, med homozygota B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J, kallade Rosa26.tdTomato-möss.
- Generera ChAT.tdTomato::Mito.CFP-möss genom att korsa heterozygota ChAT.tdTomato-möss med heterozygota Mito.CFP-möss.
2. Intramuskulära injektioner av fluorescerande HCT
- Förberedelse före operation
- Express HCT (HCT441, rester 875-1315) smält till en förbättrad cysteinrik tagg i bakterier som ett glutation-S-transferas fusionsprotein per 45. Märk HCT med AlexaFlour555 C2 maleimid31, dialysera den i iskall dialysbuffert (10 mM HEPES-NaOH, 100 mM NaCl, pH 7,4), frys in den i flytande kväve och förvara den vid -80 °C. Innan du utför in vivo-experiment testar du först HCT in vitro för framgångsrikt upptag och transport i primära nervceller.
- Späd fluorescerande HCT (t.ex. HCT-555) till en slutlig och experimentellt konsekvent koncentration från 2,5 till 10 μg/μl i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i ett 0,2 ml rör. I detta steg, lägg till fler föreningar / faktorer till HCT-lösningen om det behövs (t.ex. hjärnhärledd neurotrofisk faktor).
OBS: Den slutliga volymen måste vara lämplig för storleken på de muskler som är av intresse. Förbered till exempel en injektionsvolym på 3-4 μl för tibialis främre (TA) muskeln och ~ 1 μL för den mindre soleusmuskeln. Håll arbetskoncentrationen av HCT mellan 2,5 och 10 μg/μl oavsett den slutliga volymen. - Blanda HCT-lösningen med en pipett eller virvel och snurra kort ner med låg hastighet med en stationär centrifug för att samla vätskan och ta bort stora bubblor. Skydda HCT från ljus och transport på is.
- Använd en mikropipett av pulled glass för optimala intramuskulära injektioner i mindre muskler (t.ex. soleus) eller för intrasciatiska nervinjektioner. Dra graderade glasmikropipetter (enligt 46) före operationen.
OBS: För att möjliggöra pipettering och begränsa flödet upp och ut på baksidan av mikropipetten, bryt försiktigt av en liten bit från den vassa spetsen med fina pincett under ett dissekeringsmikroskop. Var noga med att kasta den trasiga änden i lämplig soptunna. - Sterilisera och rengör alla kirurgiska verktyg före användning.
- Kirurgi-intramuskulära injektioner
- Förbered dig för operation genom att fästa ett sterilt kirurgiskt draperi på en värmematta inställd på 37 °C. Placera och fokusera operationsmikroskopet. För att operationen ska börja, packa upp på det kirurgiska draperiet de försteriliserade kirurgiska verktygen, kirurgisk tejp, sterila bomullspinnar, 70% (v / v) etanol i vatten, steril saltlösning, suturer och en Hamilton-nål eller dragna glasmikropipetter.
- Se till att anestesimaskinen har tillräckligt med syre och isofluran under hela det kirurgiska ingreppet. Rikta flödet av anestesi till induktionskammaren och slå på bedövningsmaskinen.
- Börja med att använda en syreflödeshastighet på 1-2 l / min och 5% isofluran. Placera musen i induktionskammaren för att initiera anestesi. När den korrigerande reflexen är frånvarande, minska anestesi till 2-3% isofluran, rikta anestesiflödet till munstycket och överför musen till munstycket i ett separat område i operationsutrymmet.
- Se till att både hornhinnan och pedaluttagsreflexerna är frånvarande innan du rakar pälsområdet som täcker muskeln /musklerna som ska injiceras. När du är klar tar du bort så mycket rakad päls från musen som möjligt med den klibbiga sidan av kirurgisk tejp och placerar musen på vågar för att registrera dess pre-kirurgiska vikt.
- Applicera försiktigt ögonsmörjmedel med en bomullspinne och överför musen och munstycket till det kirurgiska området.
OBS: Försök att begränsa mängden rakad päls som också överförs till det kirurgiska området. Använd kirurgisk tejp för att fästa huvudet i munstycket för att förhindra att musen glider ut. Använd en separat bomullspinne, applicera etanol på den rakade regionen för att sterilisera och minska pälsförorening. - Placera kroppen enligt muskeln som ska injiceras. Till exempel, för TA, placera musen på ryggen och sträck ut bakbenet vid ~ 10 ° från mittlinjen. Alternativt, för soleusinjektioner, placera djuret på sidan och förläng bakbenet vid ~ 45 ° från mittlinjen. När bakbenet är i rätt läge, använd kirurgisk tejp över foten för att förhindra oönskade rörelser under operationen.
OBS: Injektionsprocedurerna för TA-, gastrocnemius- och soleusmuskler har tidigare beskrivits32. - Innan du gör ett snitt, bekräfta att anestesin är tillräcklig genom att testa pedaluttagsreflexen. Övervaka anestesin kontinuerligt och behåll den under hela det kirurgiska ingreppet med regelbunden bedömning av andning och abstinensreflexen.
- Dra nu den fungerande HCT-lösningen i Hamilton-sprutan eller den dragna glasmikropipetten.
- Gör ett litet snitt över de muskler som är av intresse i det eller de områden som motsvarar motorns ändplattregioner 46,47,48. Pierce den yttre fascian på muskeln och injicera långsamt HCT enligt 32. Låt sprutan/mikropipetten stå på plats i 5-10 s innan den sakta dras ut.
- Stäng snitten med 1-2 suturer och överför musen till en isolerad återhämtningsbur. Övervaka musen efter operationen i minst 30 minuter innan du återför den till hemburen. När musen har återhämtat sig och övervakningen efter operationen är klar, återställ buret till normala bostadsförhållanden.
3. Axonal transport in vivo
- Exponera ischiasnerven
- Ställ in mikroskopets miljökammare på 37 °C minst 1 timme före avbildning.
- Förbered dig på att exponera ischiasnerven genom att ordna kirurgiskt draperi, verktyg, tejp, sterila bomullspinnar, 70% etanol och steril saltlösning runt det kirurgiska området. Se till att anestesimaskinen har tillräckliga lager av syre och isofluran i upp till 2 timmar per mus. Skapa en kil av parafilm eller osynlig tejp genom att klippa den i en smal rektangel (t.ex. ~ 1 cm bredd för större möss) med en vinklad spets och placera den under den exponerade ischiasnerven för att underlätta avbildningsprocessen. Placera induktionskammaren ovanpå en värmematta och ställ in den på kroppstemperatur.
OBS: Fyra timmar är gott om tid för HCT att ha tagits upp och retrograd transporterats från injektionsstället till ischiasnerven; därför kan en enda mus förberedas för återbedövning efter denna tid. - Rikta anestesiflödet in i induktionskammaren, slå på bedövningsmaskinen med en syreflödeshastighet på 1-2 L / min och 3-4% isofluran och placera musen i induktionskammaren för att initiera anestesi.
OBS: Eftersom axonaltransportexperimentet in vivo är en terminal procedur behöver du inte smörja ögonen. - När den rätande reflexen är frånvarande, minska anestesi till 2-3% isofluran, rikta anestesiflödet till munstycket och överför musen till munstycket. Använd kirurgisk tejp för att fästa huvudet i munstycket, förläng det riktade bakbenet vid ~ 45 ° från mittlinjen och använd kirurgisk tejp över foten för att bibehålla denna position.
OBS: Minskad anestesi är fördelaktig vid denna tidpunkt eftersom det kan begränsa effekten av andningsartefakter under bildprocessen. - Se till att hornhinne- och pedaluttagsreflexer saknas och använd sedan sax för att skära bort huden som ligger över ischiasnerven32 (dvs. ett stort område som sträcker sig från den centrala ryggmärgen till mitten av nedre bakbenet). Ta bort den överliggande biceps femoris-muskeln, liksom alla andra muskulatur- och bindväv som ligger nära ischiasnerven. Undvik att skada ischiasnerven och omgivande blodkärl, särskilt de som ligger nära den laterala aspekten av patella / proximal aspekt av det laterala gastrocnemiushuvudet.
- När den intakta ischiasnerven är tillräckligt exponerad, applicera förvärmd steril saltlösning på området runt ischiasnerven för att förhindra uttorkning. Använd böjda pincett för att störa den djupt liggande bindväven och placera den förberedda parafilmens "kil" under nerven. När du är klar placerar du saltlösningsindränkt bomullsull på det utsatta området och flyttar musen in i induktionskammaren placerad ovanpå värmemattan (inställd på 37 °C), som fortfarande ska fyllas med isofluran iO2.
- In vivo axonal avbildning
- Placera ett 22 x 64 mm täckglas på det anpassade mikroskopsteget och säkra dess position med tejp. Välj och applicera nedsänkningsolja på målet och anslut sedan mikroskopsteget till det inverterade mikroskopet. Höj långsamt det oljedränkta målet tills kontakt sker mellan oljan och täckglaset.
OBS: Antingen 40x, 1,3 numerisk bländare (NA) DIC Plan-Apochromat eller 63x, 1,4 NA DIC Plan-Apochromat oljedoppningsmål kan användas för att avbilda in vivo-transport i ischiasnerven. - Flytta anestesimunstycket till mikroskopstadiet och säkra anestesislangarna med tejp för att förhindra störningar i anestesin. Ta bort bomullsullen från ischiasnerven och överför musen från induktionskammaren till munstycket, med den exponerade nerven vänd mot täckglaset. Använd kirurgisk tejp för att säkerställa att musens huvud är fixerat på munstycket och upprätthålla den lägsta, effektiva anestesinivån. Lyft försiktigt musen i svansen och tillsätt steril saltlösning till täckglaset nära den exponerade ischiasnerven för att begränsa uttorkning och underlätta avbildning.
OBS: Stäng alla dörrar i miljökammaren för att säkerställa att området förblir vid kroppstemperatur. - Använd kikaren, lokalisera ischiasnerven, bestäm den optimala brännpunkten och välj ett intresseområde som innehåller rörliga axonala organeller.
OBS: En detaljerad förklaring av denna process har tidigare beskrivits32. - Byt till datorprogramvaran genom att klicka på knappen Förvärv (eller motsvarande) och välj ett intresseområde. Använd en digital zoom för att få totalt >80x förstoring och rotera det valda området för att horisontellt visualisera axonerna (t.ex. höger till vänster rörlig retrograd last och vänster-till-höger rörlig anterogradlast).
Riktningsparametrarna är användarberoende, men måste vara konsekventa under experimenten. - Optimera signalintensiteten genom att justera parametrar som laserintensitet (0,2 - 1%), hålöppning (1 AU - max), förstärkning (Master) (700 - 1000), digital offset (-50 - 0) och digital förstärkning (1,0 - 4,0). För att minska den potentiella påverkan av fototoxicitet, behåll laserintensiteten vid ≤ 1% där det är möjligt, med en maximal laserintensitet på 2%. Ändra alla andra parametrar innan du justerar laserintensiteten för optimal signaldetektering.
- Klicka på rutan Regioner (eller motsvarande), välj ett rektangulärt område av intresse och sedan i förvärvsläge (eller motsvarande), ställ in bildrutestorleken till minst 1024 x 1024 pixlar och påbörja time-lapse-förvärv av 100-1 000 bildrutor.
OBS: Den önskade bildförvärvshastigheten är användarberoende (t.ex. transport kan bedömas med bildhastigheter mellan 0,1 och 6 s) och kan justeras med programvaruparametrar, såsom intresseområde, skanningshastighetstid, förvärvsmedelvärde och laserriktning. Till exempel, för att få en långsammare bildhastighet, öka höjden / bredden på det intressanta området, få långsammare skanningshastigheter, öka förvärvsgenomsnittet och använd en enda laserriktning och vice versa för en snabbare bildhastighet. Bildruteinsamlingshastigheten måste vara konsekvent i jämförbara datauppsättningar eftersom avbildning vid olika frekvenser kan orsaka inkonsekvenser. Snabba laster som signalendosomer kräver en snabbare bildhastighet (t.ex. 0,1-3 s) jämfört med långsammare organeller som mitokondrier som kan analyseras med en långsammare hastighet (t.ex. 2,5-6 s). - Sikta på att fånga minst 10 rörliga laster från minst tre axoner per mus.
OBS: Baserat på tvåprov, dubbelsidiga effektberäkningar (med standardeffekt på 0,8 (1−β) och typ I-felfrekvens på 5% (α)) är provstorlekar på 6-8 tillräckliga för att identifiera axonala transportskillnader mellan vildtyp och sjukdomsmodeller35,43. - När avbildning är klar, avliva musen omedelbart under anestesi (t.ex. cervikal dislokation). Post mortem vävnad, såsom muskler och ischiasnerver, kan också skördas för vidare analys.
- Placera ett 22 x 64 mm täckglas på det anpassade mikroskopsteget och säkra dess position med tejp. Välj och applicera nedsänkningsolja på målet och anslut sedan mikroskopsteget till det inverterade mikroskopet. Höj långsamt det oljedränkta målet tills kontakt sker mellan oljan och täckglaset.
Representative Results
Detta dokument beskriver ett mångsidigt protokoll som utökar in vivo axonal transportverktygssats i gnagaremodeller. Figur 1 visar att motorneuronaxoner kan differentieras från både sensoriska neuronaxoner och Schwann-celler genom att använda transgena möss. Figur 1A visar eGFP-uttryck i kolinerga motoraxoner från en levande, bedövad ChAT.eGFP-mus. Figur 1B använder en alternativ metod för att uppnå tdTomato-uttryck i en nyligen utskuren nerv (dvs. ingen ytterligare vävnadsbehandling) från en ChAT.tdTomato-mus. Därför möjliggör användning av transgena stammar som ChAT.eGFP, ChAT.tdTomato eller Hb9.GFP motoraxonspecifik märkning in vivo.
Alternativt kan axoner också identifieras genom att injicera spårämnen/markörer (t.ex. HCT31,32 eller virus som kodar för eGFP15) i skelettmusklerna. Figur 2 belyser en sådan applikation, som visar åtta robust uttryckande ChAT.eGFP-positiva axoner som innehåller HCT-555-positiva signalendosomer (vita pilar), ~ 4 h efter sondinjektion i TA-muskeln. Med hjälp av denna experimentella design kunde vi identifiera TA-innerverande α motoriska neuroner, som övervägande är snabbuttröttbara44. Ytterligare fem ChAT.eGFP-axoner med mindre robust eGFP-uttryck (figur 2A, orange asterisker) var delvis ur fokus och befann sig sannolikt något djupare i ischiasnerven.
Dessutom identifierade vi HCT-555-positiva signalendosomer i eGFP-negativa sensoriska axoner (gula pilar). Som sådan kan man med hjälp av detta experimentella paradigm specifikt bedöma och jämföra den axonala transporten av signalendosomer i motoriska kontra sensoriska neuroner in vivo. Med hjälp av denna transgena reporterstam upptäckte vi faktiskt att transport av signalendosomer i ChAT.eGFP-positiva motoraxoner är snabbare än i ChAT.eGFP-negativa sensoriska axoner, som på ett tillförlitligt sätt kan differentieras med axonbredder43.
Vi har tidigare identifierat motorneuronaxoner med hjälp av ChAT.eGFP-musen in vivo43. Vi rapporterar nu att HB9. GFP-möss kan också användas för att uppnå identifiering av motorneuronaxon in vivo. Faktum är att figur 3 presenterar en serie tidsfördröjningsbilder av HB9. GFP-axoner som innehåller retrogradt rörliga HCT-555-positiva signalendosomer. Observera att GFP, till skillnad från ChAT-drivet uttryck, har ett mer punkterat/granulärt mönster i HB9. GFP-axoner; orsaken till detta är oklar.
Vi har tidigare beskrivit hur man kan övervaka mitokondriell dynamik in vivo i ischiasnerver via intrasciatiska nervinjektioner av det mitokondriellt riktade färgämnet, tetrametylrhodamin, etylester, perklorat (TMRE)32,36. För att på ett tillförlitligt sätt skilja motoriska kontra sensoriska mitokondrier kan Mito.CFP-musen, som uttrycker CFP under Thy1-promotorn 18, korsas med transgena möss som uttrycker en fluorescerande reportergen i specifika neuronala typer. Genom att avla mito.CFP-möss med ChAT.tdTomato-möss (kallade ChAT.tdTomato::Mito.CFP) kunde vi visualisera mitokondrier specifikt i motoraxoner, som visas i figur 4. I detta levande multiplexexempel kan fem ChAT.tdTomato-axoner visualiseras, varav fyra innehåller CFP-positiva mitokondrier. Dessutom kunde noden i Ranvier (vit pil i panel iii) också identifieras. Dessutom är noderna i Ranvier tydligt detekterbara i ChAT.eGFP, HB9. GFP- och Mito.CFP-möss (visas inte). Dessa dubbeltransgena stammar möjliggör intravital avbildning av levande, sövda möss för att övervaka motorneuronspecifikt mitokondriellt innehåll och axonal transportdynamik.
Slutligen kan signaleringsendosomer och mitokondrier samtidigt visualiseras inom samma axoner in vivo genom att injicera HCT i musklerna hos Mito.CFP-möss (figur 5). Intramuskulära injektioner av HCT-555 utfördes i TA-muskeln i en Mito.CFP-mus ~ 4 timmar före avbildning. Både mitokondrier (i-paneler) och signalendosomer (ii-paneler) visualiserades samtidigt i muskelspecifika axoner (dvs axoner som innerverar TA). Faktum är att anterogradly (gula trianglar) och retrograd (gröna trianglar och cirklar) rörliga organeller såväl som stallade organeller (orange trianglar och cirklar) kan observeras. Med hjälp av detta experimentella paradigm kan man bedöma de komplexa funktionella interaktionerna mellan axonala mitokondrier och signalendosomer in vivo. Sammantaget demonstrerar vi flera olika experimentella metoder för att bedöma axonal transport av signalendosomer och / eller mitokondrier, specifikt i kolinerga motorneuroner in vivo.
Figur 1: Ischiasnervmotoraxoner (A) Representativ enplansbild av eGFP-positiva motoraxoner erhållna in vivo från en ChAT.eGFP-mus. (B) Representativ enplansbild av tdTomato-positiva motoraxoner i en utskuren ischiasnerv från en ChAT.tdTomato-mus. Skillnader i axonkaliber beror på skillnader i musens ålder och storlek. Skalstänger = 50 μm. Förkortningar: eGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein; ChAT = kolinacetyltransferas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: In vivo axonal transport av signalendosomer i levande ischiasnervmotoriska och sensoriska neuroner hos en ChAT.eGFP-mus (A-C) Representativa bilder av kolinerga axoner som uttrycker eGFP (A) och innehåller HCT-555-positiva signalendosomer (B) och sammanslagningen (C). De vita pilarna markerar en eGFP-positiv motoraxon som innehåller HCT-555-positiva signalendosomer, cyanpilarna identifierar en motoraxon som saknar HCT-555-positiva signalendosomer och de gula pilarna markerar en eGFP-negativ sensorisk axon som transporterar HCT-555-positiva signalendosomer. Orange asterisker identifierar motoraxoner med svagare eGFP-uttryck. Skalstreck = 25 μm. Förkortningar: eGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein; ChAT = kolinacetyltransferas; HCT-555 = tetanustoxinbindande domän. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Time-lapse-bildserier som representerar axonal transport in vivo av signalendosomer i levande motorneuroner i en HB9. GFP-mus. (A-D) Time-lapse-bilder tagna var 3: e s som visar motorneuronaxoner som uttrycker grönt fluorescerande protein (i) och innehåller HCT-555-positiva signalendosomer (ii) och sammanslagningen (iii). Varje cirkel med samma färg identifierar samma rörliga endosom över olika ramar. Retrograd rörelse är från höger till vänster. Skalstreck = 10 μm. Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; HCT-555 = tetanustoxinbindande domän. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: In vivo axonal transport av mitokondrier i levande ischiasnervmotoriska neuroner hos en ChAT.tdTomato:: Mito.CFP: mus. Infällda bilder i-iii innehåller en högre förstoring från varje panel. Den vita pilen representerar en misstänkt nod av Ranvier. Skalstaplar = 25 (A-C) och 10 μm (i-iii). Förkortningar: ChAT = kolinacetyltransferas; CFP = cyan fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Time-lapse-bildserier som representerar samtidig in vivo axonal transport av mitokondrier och signalerar endosomer i levande ischiasnervmotoriska neuroner hos en Mito.CFP-mus. (A-C) Time-lapse-bilder tagna var 3: e s som visar axonal transport av både mitokondrier (i) och signalendosomer (ii) inom samma ischiasnervaxon (iii). De gula trianglarna identifierar anterogradiskt rörliga laster, de gröna cirklarna/trianglarna identifierar bakåtsträvande rörliga laster och de orange cirklarna/trianglarna identifierar stationära laster. Anterograd rörelse är från vänster till höger, medan retrograd rörelse är i motsatt riktning. Skalstreck = 10 μm. Förkortningar: HCT-555 = stelkrampstoxinbindande domän; CFP = cyan fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Detta protokoll beskriver steg för att bedöma axonal transport in vivo av signalendosomer och mitokondrier i intakta axoner i musens ischiasnerv. Faktum är att en experimentell installation tillhandahålls som gör det möjligt för användare att 1) skilja motor från sensoriska neuroner in vivo, in situ och ex vivo genom att använda möss som uttrycker fluorescerande reporterproteiner selektivt uttryckta i motorneuroner; 2) bedöma in vivo axonal transport av signalendosomer specifikt i motorneuronaxoner med användning av tre olika transgena möss; 3) undersöka in vivo axonal transport av mitokondrier specifikt i motorneuronaxoner; och 4) samtidigt bedöma in vivo transportdynamik av signaleringsendosomer och mitokondrier inom samma axon. Detta tillvägagångssätt har stor potential för att undersöka axonal transport vid basala förhållanden och kan användas för att bedöma patologiska störningar i olika sjukdomar som påverkar perifera motoriska och sensoriska nerver.
Med hjälp av tidigare experimentella paradigmer som grund31,32 har vi här detaljerade nya, robusta sätt att differentiera axonal transport som förekommer i motoriska kontra sensoriska neuroner med hjälp av transgena reportermöss. Med hjälp av Mito.CFP-musen har detta tillvägagångssätt vidareutvecklats för att bedöma mitokondriell transport in vivo genom att undvika intrasciatiska nervinjektioner av TMRE36. Detta kringgår eventuella neurala skador och störningar i axonal transport orsakad av sondens intranerveinjektion. Dessutom möjliggör detta protokoll visualisering av axonal transport av flera organeller i motoraxoner som innerverar muskler med distinkta fysiologiska egenskaper (t.ex. snabba uttröttbara muskler kontra långsamma trötthetsresistenta muskler). Som sådan kan signalendosom och / eller mitokondriell axonal transportdynamik bedömas i olika delmängder av α-motoriska neuroner44. Dessutom kan den axonala transporten av dessa organeller i patologiska miljöer också bedömas genom korsning med musmodeller av olika neurodegenerativa sjukdomar 1,2,3.
Den axonala transportverktygssatsen expanderar kontinuerligt 28,29, och ex vivo-protokoll har utvecklats för att bedöma transportdynamiken med hjälp av odlade mus ventrala hornexplants49 eller utskurna musnervmuskelpreparat50. Vidare har utvecklingen av protokoll för att bedöma axonal transport i inducerade humana pluripotenta stamceller (hiPSC) -härledda kortikala51 neuroner eller hiPSC-härledda ryggradsmotoriska neuroner52 möjliggjort undersökning av mänskliga neuroner med sjukdomsframkallande mutationer. Sådana banbrytande protokoll i musvävnad och mänskliga celler kan ge kritiska insikter om neuronal funktion, underlätta nya patomekanistiska upptäckter i neurodegenerativa sjukdomsmodeller och användas för att testa terapeutiska molekyler och strategier.
Flera kritiska steg måste följas för en framgångsrik implementering av dessa tekniker, och några viktiga anteckningar har tillhandahållits i protokollavsnittet. De viktigaste kraven för intravital avbildning är det inverterade konfokalmikroskopet med anpassad sceninsats och utrustningen för att upprätthålla anestesi och optimal temperatur. Faktum är att ett specialiserat mobilt anestesisystem behövs för 1) induktion av anestesi, 2) dissektion / vävnadsbehandling (dvs. exponering av ischiasnerven) och 3) upprätthållande av anestesi under intravital avbildning (som tidigare beskrivits i 31,32). Speciellt när du använder högre förstoringsmål (t.ex. 40x eller 63x) kan anestesidjupet påverka bildkvaliteten, eftersom djupare anestesi inducerar stora "gaspy" andetag som resulterar i frekventa skiftningar i fokus. Sådana stora rörelser kommer utan tvekan att påverka transportanalyser efter avbildning (t.ex. spårning av laster med Hjälp av Fiji-plugins TrackMate53 eller KymoAnalyzer54) eftersom andningsrörelserna producerar artefakter i time-lapse-videor som kan göra dem olämpliga för automatiserad spårning eller kräva mer tidskrävande bedömning. Dessutom har vi också observerat bildartefakter orsakade av pulserande artärer i ischiasnerven, som bara kan lösas genom att välja en annan bildregion. Mikroskopet måste vara utrustat med en miljökammare som kan upprätthålla konstant kroppstemperatur, eftersom temperatur och pH påverkar axonal transport55. Dessutom bör applicering av smärtstillande medel efter operationen undvikas, eftersom de kan förändra transportdynamiken56. Om den experimentella konstruktionen är longitudinell och kräver upprepad avbildning (t.ex.57) måste dissektionsprotokollen justeras på lämpligt sätt för att vara minimalt invasiva och kan kräva ytterligare etiskt/licensgodkännande.
Vissa experimentella överväganden måste hållas i åtanke. För det första involverar de flesta protokoll som beskrivs häri användningen av transgena möss som har fluorescerande reporterproteiner i mitokondrier eller motorneuronaxoner. Var och en av dessa muslinjer bör avlas och avbildas som hemi-/heterozygot. Undantagen är dock muslinjerna ChAT.Cre och Rosa26.tdTomato som kan bibehållas separat som homozygoter, med den resulterande hemizygotavkomman som möjliggör tdTomato-uttryck i kolinerga neuroner efter Cre-loxP-rekombination . Vid korsning av transgena hemi-/heterozygotmöss (t.ex. Mito.CFP) med andra transgena hemi-/heterozygotmöss (t.ex. ChAT.eGFP) måste man noga överväga avelsstrategin, eftersom det kan vara tidskrävande att erhålla önskat antal dubbelmutantavkomma. Dessutom, när man odlar F1-generationen av ChAT.Cre och Rosa26.tdTomato-möss (dvs ChAT.tdTomato) med ytterligare transgena stammar (t.ex. Mito.CFP), bör man förvänta sig ännu färre möss som bär de önskade trippeltransgenerna. Dessutom måste man också överväga den potentiella fluoroforöverlappningen vid uppfödning av tvåreportermöss med närliggande våglängdsegenskaper (t.ex. Mito-CFP-excitation: 435 nm, emission: 485 nm, uppfödd med ChAT.eGFP-excitation: 488 nm, emission: 510 nm), även om det kan vara möjligt att övervinna detta problem med spektral unmixing58.
Denna teknik har vissa begränsningar att överväga. I detta arbete och våra tidigare protokoll 31,32 har vi visat hur flera genetiskt kodade markörer och olika färgningsmetoder kan användas för att märka och spåra distinkta organeller in vivo. Emellertid är inte alla sonder lämpliga för detta experimentella tillvägagångssätt. Vi utvärderade injektioner i antingen TA- eller soleusmuskeln av koleratoxin beta-subenhet (CTB)-488 (0,5-1,5 μg/μl ~4 h före avbildning), en sond som rutinmässigt används för att märka motorneuroncellkroppar i in vivo retrograda spårämnesexperiment59,60. Men när den injicerades ensam eller injicerades tillsammans med HCT-555 var CTB-488-märkningen dålig trots att man använde koncentrationer som liknar dem som används för framgångsrik retrograd motorisk neuronspårning. Således drar vi slutsatsen att, trots att CTB är en utmärkt in vitro-markör för signalering av endosomer i neuronala kulturer61, förblir HCT guldstandardsonden för att identifiera signalendosomer in vivo i ischiasnervaxoner.
Med hjälp av olika vägar testade vi också sonder som rutinmässigt används för att märka lysosomer, såsom LysoTracker grön DND-26, och markörer för aktiva lysosomala hydrolaser, såsom BODIPY-FL-pepstatin A för Cathepsin D62 och Magic Red för Cathepsin B, men utan framgång. Vi försökte intramuskulär leverans av BODIPY-FL-pepstatin A (2,5 μg i TA ~ 4 h före avbildning), samt intrasciatisk nervinjektion av 2 μL LysoTracker (10 μM), BODIPY-FL-pepstatin A (10 μM) eller Magic Red (1/10) 30-60 min före avbildning. Trots att dessa sonder belyser nerven kunde vi inte hitta tydligt märkta organeller. Sonderna ackumulerades runt axoner och behölls sannolikt av Schwann-celler. Därför kan den misslyckade märkningen av lysosomer bero på bristfällig sondleverans till neuroner, även om förekomsten av mer lämpliga koncentrationer inte kan uteslutas. Med tanke på att TMRE-märkning fungerar under liknande förhållanden (dvs. intrasciatiska nervinjektioner) kan märkningsintensiteten vara färgämnesberoende och måste testas för varje markör oberoende. Vi drar dock slutsatsen att det inte är möjligt att rikta in lysosomer in vivo med dessa sonder vid de koncentrationer som anges ovan.
Anestesimetoder kan förändra distinkta fysiologiska avläsningar (t.ex. cochleafunktion63 och kortikal elektrofysiologi64); huruvida anestesi påverkar axonal transport in vivo i ischiasnerven är dock för närvarande okänt. Med tanke på den reducerade neuromuskulära aktiviteten under isofluraninducerad anestesi är det möjligt att transportkinetiken skiljer sig jämfört med det vakna tillståndet. Den enda in vivo-studien som direkt har undersökt detta avslöjade dock att transport av täta kärnblåsor i thalamokortiska projektioner inte skiljer sig mellan sövda och vakna möss65. Eftersom skillnader i transport mellan vildtyps- och sjukdomsmöss kan detekteras under anestesi35,43, är det dessutom uppenbart att exponering för isofluran inte hindrar identifiering av störningar vid signalering av endosom eller mitokondriell handel.
Detta protokoll har andra potentiella applikationer, som har beskrivits nedan. Uppfödning av de transgena möss som beskrivs i detta protokoll (t.ex. Mito.CFP, ChAT.eGFP) med neurodegenerativa sjukdomsmusmodeller 1,2,3 kommer att möjliggöra neuronsubtyp- och / eller lastspecifika undersökningar. Dessutom skulle nyligen utvecklade mus Cre-linjer66 också tillåta visualisering av fluorescerande reporterproteiner i distinkta sensoriska axonpopulationer. Till exempel kan Rosa26.tdTomato-möss korsas med en neuropeptid Y-receptor-2-uttryckande (Npy2r). Cre mus för att möjliggöra tdTomato fluorescens i myeliniserade A-fiber nociceptorer67. Dessutom kan tidsbestämning också uppnås genom att använda inducerbara Cre-system (t.ex. tamoxifen)68. En annan potentiell applikation är beroende av tillgången på transgena möss som uttrycker fluorescerande reporterproteiner i Schwann-celler. Faktum är att S100-GFP69 och PLP-GFP70-möss möjliggör in vivo- och / eller in situ-avbildning av Schwann-celler och har varit i framkant av forskning som är involverad i Schwann-cellmigration under perifer nervregenerering.
Förutom dessa applikationer och som kompletterar Mito.CFP-musen är tillgången på flera transgena muslinjer som uttrycker fluorescerande proteiner i distinkta organeller, såsom mitokondrier och autofagosomer. Till exempel kan det vara möjligt att undersöka mitokondriell transport in vivo med mito::mKate2-musen71 eller den fotokonverterbara mitoDendra-musen57. Dessutom kan in vivo mitophagosomtransport vara möjlig med hjälp av den pH-känsliga mito-Keima-musen72 och mito-QC-musen73 för mitophagyanalyser. Dessutom kan de lysosomala märkningssvårigheterna vi stött på övervinnas genom att använda möss som uttrycker LAMP1-GFP, med förbehållet att LAMP1 också finns i endocytiska organeller som skiljer sig från lysosomer74.
Sammanfattningsvis har vi tillhandahållit nya sätt att bedöma axonal transport in vivo av flera organeller i specifika perifera nervaxoner från olika transgena möss. Samtidig avbildning av olika organeller kommer att vara särskilt viktig, med tanke på de senaste resultaten av axonala interaktioner och samtidig handel med organeller som mitokondrier och endosomer75,76. Vi tror att de presenterade metoderna kommer att vara användbara för att förbättra förståelsen av axonernas basala fysiologi in vivo och reda ut viktiga patomekanismer som driver neurodegeneration av perifera nerver.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill tacka Robert M. Brownstone (Queen Square Institute of Neurology, University College London) för att ha delat ChAT-eGFP, ChAT.Cre och Rosa26.tdTomato möss, och Pietro Fratta (Queen Square Institute of Neurology, University College London) för att dela HB9. GFP-mus. Vi vill tacka Elena R. Rhymes, Charlotte J.P. Kremers och Qiuhan Lang (Queen Square Institute of Neurology, University College London) för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av ett Junior Non-Clinical Fellowship från Motor Neuron Disease Association (Storbritannien) (Tosolini / Oct20/973-799) (APT), Wellcome Trust Senior Investigator Awards (107116 / Z / 15 / Z och 223022 / Z / 21 / Z) (GS), en UK Dementia Research Institute Foundation Award (GS); och ett medical research council career development award (MR/S006990/1) (JNS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR tube | |||
| 70% (v/v) ethanol in distilled water | |||
| AlexaFlour555 C2 maleimide | ThermoFisher Scientific | A-20346 | Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J | Jackson Laboratory | 7909 | Rosa26.tdTomato mice |
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice | Jackson Laboratory | 5029 | HB9.GFP mice |
| B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice | Jackson Laboratory | 7967 | Mito.CFP mice |
| B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice | Jackson Laboratory | 6410 | ChAT.Cre mice |
| Computer with microscope control and image acquisition software | Zeiss | Zen | |
| Cotton swab | |||
| Desktop centrifuge | |||
| Dissecting microscope | |||
| Eye lubricant | |||
| Fine curved forceps | Dumont | ||
| Fine straight forceps | Dumont | ||
| Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1) | |||
| Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | |
| Hair clippers | |||
| Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) | Merck | 20779 | |
| HcT-441 | N/A | N/A | See Restani et al., 2012 for more details |
| Heating pad | |||
| Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C | |||
| Inverted confocal microscope with environmental chamber | Zeiss | LSM 780 | Most inverted confocals should be adaptable |
| Isoflurane | |||
| Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer | |||
| Magic tape | invisible tape | ||
| Micropipette puller | |||
| Parafilm | Parafilm | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4 | |||
| Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | BDNF that can be co-injected with HcT-555 |
| Saline | |||
| Scalpel blade | Dumont | ||
| Small spring scissors | Dumont | ||
| Surgery/operating microscope | |||
| Surgical drape | |||
| Surgical suture | |||
| Surgical tape | |||
| Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice | MMRRC | 000296-UCD | ChAT.eGFP |
| Vortex mixer |
References
- Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Disease Models & Mechanisms. 4 (4), 457-467 (2011).
- De Giorgio, F., Maduro, C., Fisher, E. M. C., Acevedo-Arozena, A. Transgenic and physiological mouse models give insights into different aspects of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037424 (2019).
- Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. The Journal of Cell Biology. 187 (6), 761-772 (2009).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic lateral sclerosis. The New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiological Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
- Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 482 (2), 123-141 (2005).
- Kaiser, T., Ting, J. T., Monteiro, P., Feng, G. Transgenic labeling of parvalbumin-expressing neurons with tdTomato. Neuroscience. 321, 236-245 (2016).
- Zheng, B., Sage, M., Sheppeard, E. A., Jurecic, V., Bradley, A. Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP: range, efficiency, and somatic applications. Molecular and Cellular Biology. 20 (2), 648-655 (2000).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Bareyre, F. M., Kerschensteiner, M., Misgeld, T., Sanes, J. R. Transgenic labeling of the corticospinal tract for monitoring axonal responses to spinal cord injury. Nature Medicine. 11 (12), 1355-1360 (2005).
- Willems, J., et al. A CRISPR/Cas9-based genome editing toolbox for epitope tagging of endogenous proteins in neurons. PLoS Biology. 18 (4), 3000665 (2020).
- Huh, Y., Oh, M. S., Leblanc, P., Kim, K. -S. Gene transfer in the nervous system and implications for transsynaptic neuronal tracing. Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (5), 763-772 (2010).
- Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting motor end plates for delivery of adenoviruses: an approach to maximize uptake and transduction of spinal cord motor neurons. Scientific Reports. 6, 33058 (2016).
- Andrews, M. R. Gene therapy in the CNS-one size does not fit all. Gene Therapy. 28 (7-8), 393-395 (2021).
- Kügler, S. Tissue-specific promoters in the CNS. Methods in Molecular Biology. 1382, 81-91 (2016).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Dana, H., et al. Thy1-GCaMP6 transgenic mice for neuronal population imaging in vivo. PLoS One. 9 (9), 108697 (2014).
- Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
- Maday, S., Twelvetrees, A. E., Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. F. Axonal transport: cargo-specific mechanisms of motility and regulation. Neuron. 84 (2), 292-309 (2014).
- Terenzio, M., Schiavo, G., Fainzilber, M. Compartmentalized signaling in neurons: from cell biology to neuroscience. Neuron. 96 (3), 667-679 (2017).
- Abouward, R., Schiavo, G. Walking the line: mechanisms underlying directional mRNA transport and localisation in neurons and beyond. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2665-2681 (2021).
- Sleigh, J. N., Rossor, A. M., Fellows, A. D., Tosolini, A. P., Schiavo, G. Axonal transport and neurological disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (12), 691-703 (2019).
- Bronfman, F. C., Moya-Alvarado, G. BDNF/TrkB signaling endosomes mediate long-distance dendritic growth by activating CREB/PI3K-mTOR-dependent translation in neuronal cell bodies. BioRxiv. , (2020).
- Nagano, S., Araki, T. Axonal Transport and Local Translation of mRNA in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 697973 (2021).
- Boecker, C. A., Olenick, M. A., Gallagher, E. R., Ward, M. E., Holzbaur, E. L. F. ToolBox: Live Imaging of intracellular organelle transport in induced pluripotent stem cell-derived neurons. Traffic. 21 (1), 138-155 (2020).
- Surana, S., et al. The evolution of the axonal transport toolkit. Traffic. 21 (1), 13-33 (2020).
- Sleigh, J. N., Vagnoni, A., Twelvetrees, A. E., Schiavo, G. Methodological advances in imaging intravital axonal transport. F1000Research. 6, 200 (2017).
- Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
- Sleigh, J. N., Tosolini, A. P., Schiavo, G. In vivo imaging of anterograde and retrograde axonal transport in rodent peripheral nerves. Methods in Molecular Biology. 2143, 271-292 (2020).
- Gibbs, K. L., et al. Inhibiting p38 MAPK alpha rescues axonal retrograde transport defects in a mouse model of ALS. Cell Death & Disease. 9 (6), 596 (2018).
- Fellows, A. D., Rhymes, E. R., Gibbs, K. L., Greensmith, L., Schiavo, G. IGF1R regulates retrograde axonal transport of signalling endosomes in motor neurons. EMBO Reports. 21 (3), 49129 (2020).
- Bilsland, L. G., Sahai, E., Kelly, G., Golding, M., Greensmith, L., Schiavo, G. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (47), 20523-20528 (2010).
- Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. The Journal of Cell Biology. 218 (6), 1871-1890 (2019).
- Bercsenyi, K., et al. Tetanus toxin entry. Nidogens are therapeutic targets for the prevention of tetanus. Science. 346 (6213), 1118-1123 (2014).
- Deinhardt, K., et al. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293-305 (2006).
- Debaisieux, S., Encheva, V., Chakravarty, P., Snijders, A. P., Schiavo, G. Analysis of signaling endosome composition and dynamics using SILAC in embryonic stem cell-derived neurons. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 542-557 (2016).
- Surana, S., et al. The travel diaries of tetanus and botulinum neurotoxins. Toxicon. 147, 58-67 (2018).
- Villarroel-Campos, D., Schiavo, G., Lazo, O. M. The many disguises of the signalling endosome. FEBS Letters. 592 (21), 3615-3632 (2018).
- Malik, B., et al. Absence of disturbed axonal transport in spinal and bulbar muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 20 (9), 1776-1786 (2011).
- Sleigh, J. N., et al. Mice carrying ALS mutant TDP-43, but not mutant FUS, display in vivo defects in axonal transport of signaling endosomes. Cell Reports. 30 (11), 3655-3662 (2020).
- Tosolini, A. P., Sleigh, J. N., Surana, S., Rhymes, E. R., Cahalan, S. D., Schiavo, G. modulation of axonal transport is selectively impaired in ALS. BioRxiv. , (2021).
- Restani, L., et al. Botulinum neurotoxins A and E undergo retrograde axonal transport in primary motor neurons. PLoS Pathogens. 8 (12), 1003087 (2012).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52846 (2015).
- Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Frontiers in Neurology. 4, 58 (2013).
- Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neuroscience. 274, 318-330 (2014).
- Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60993 (2020).
- Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., Brown, A. Imaging and analysis of neurofilament transport in excised mouse tibial nerve. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61264 (2020).
- Mou, Y., Mukte, S., Chai, E., Dein, J., Li, X. -J. Analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60548 (2020).
- Stoklund Dittlau, K., et al. Generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), e62959 (2021).
- Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Bohnert, S., Schiavo, G. Tetanus toxin is transported in a novel neuronal compartment characterized by a specialized pH regulation. The Journal of Biological Chemistry. 280 (51), 42336-42344 (2005).
- Kanai, A., et al. Low-concentration lidocaine rapidly inhibits axonal transport in cultured mouse dorsal root ganglion neurons. Anesthesiology. 95 (3), 675-680 (2001).
- Bolea, I., Gan, W. -B., Manfedi, G., Magrané, J. Imaging of mitochondrial dynamics in motor and sensory axons of living mice. Methods in Enzymology. , 97-110 (2014).
- Cohen, S., Valm, A. M., Lippincott-Schwartz, J. Multispectral live-cell imaging. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 46 (2018).
- Blum, J. A., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the adult mouse spinal cord reveals molecular diversity of autonomic and skeletal motor neurons. Nature Neuroscience. 24 (4), 572-583 (2021).
- Xu, J., et al. An approach to maximize retrograde transport based on the spatial distribution of motor endplates in mouse hindlimb muscles. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 707982 (2021).
- Wang, T., et al. Flux of signalling endosomes undergoing axonal retrograde transport is encoded by presynaptic activity and TrkB. Nature Communications. 7, 12976 (2016).
- Chen, C. S., Chen, W. N., Zhou, M., Arttamangkul, S., Haugland, R. P. Probing the cathepsin D using a BODIPY FL-pepstatin A: applications in fluorescence polarization and microscopy. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 42 (3), 137-151 (2000).
- Cederholm, J. M. E., et al. Differential actions of isoflurane and ketamine-based anaesthetics on cochlear function in the mouse. Hearing Research. 292 (1-2), 71-79 (2012).
- Michelson, N. J., Kozai, T. D. Y. Isoflurane and ketamine differentially influence spontaneous and evoked laminar electrophysiology in mouse V1. Journal of Neurophysiology. 120 (5), 2232-2245 (2018).
- Knabbe, J., Nassal, J. P., Verhage, M., Kuner, T. Secretory vesicle trafficking in awake and anaesthetized mice: differential speeds in axons versus synapses. The Journal of Physiology. 596 (16), 3759-3773 (2018).
- Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).
- Arcourt, A., et al. Touch receptor-derived sensory information alleviates acute pain signaling and fine-tunes nociceptive reflex coordination. Neuron. 93 (1), 179-193 (2017).
- Valny, M., Honsa, P., Kirdajova, D., Kamenik, Z., Anderova, M. Tamoxifen in the mouse brain: implications for fate-mapping studies using the tamoxifen-inducible Cre-loxP system. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 243 (2016).
- Hayashi, A., et al. A double-transgenic mouse used to track migrating Schwann cells and regenerating axons following engraftment of injured nerves. Experimental Neurology. 207 (1), 128-138 (2007).
- Chen, B., Chen, Q., Parkinson, D. B., Dun, X. -P. Analysis of schwann cell migration and axon regeneration following nerve injury in the sciatic nerve bridge. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 308 (2019).
- Barrasso, A. P., Tong, X., Poché, R. A. The mito::mKate2 mouse: A far-red fluorescent reporter mouse line for tracking mitochondrial dynamics in vivo. Genesis. 56 (2), (2018).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. The Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
- Cheng, X. -T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. The Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
- Cioni, J. -M., Lin, J. Q., et al. Late Endosomes Act as mRNA Translation Platforms and Sustain Mitochondria in Axons. Cell. 176 (12), 56 (2019).
- Liao, Y. -C., Fernandopulle, M. S., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179 (1), (2019).
