Descemet’s Stripping Only er en eksperimentell prosedyre der pasienter med sentral hornhinnen guttae som følge av Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy har Descemets membran strippet for perifere celler for å regenerere endotellaget. Vi presenterer ny metodikk som simulerer DSO i dystrofiske menneskelige hornhinner ex vivo med akselerert helbredelse stimulert av eFGF1 (NM141).
Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy (FECD) er et resultat av dysfunksjonelle hornhinnen endotelceller (CECs) og behandles for tiden ved transplantasjon av hele hornhinnen eller Descemets membran. Nyere utvikling i okulær kirurgi har etablert Descemet’s Stripping Only (DSO), en kirurgisk teknikk der en sentral sirkel av guttae-tett Descemets membran fjernes for å tillate migrering av CED-er på glatt stroma, gjenopprette funksjon og visjon til hornhinnen. Selv om dette potensielle behandlingsalternativet er av stor interesse for oftalmisk forskning, er det ikke etablert vellykkede ex vivo-modeller av DSO og kliniske data er begrenset. Dette arbeidet presenterer en ny sårhelingsmodell som simulerer DSO i humane donor corneas. Ved å bruke denne tilnærmingen til å evaluere effekten av den menneskekonstruerte FGF1 (NM141), fant vi at behandlingen akselererte helbredelse via stimulering av migrasjon og spredning av CED. Dette funnet ble bekreftet i 11 par humane hornhinner med tegn på dystrofi rapportert av øyebankene for å verifisere at disse resultatene kan replikeres hos pasienter med Fuchs dystrofi, som målpopulasjonen av DSO-prosedyren.
Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy (FECD) er en sykdom preget av tapt pumpefunksjon i hornhinnen endotelceller (CECs) og overdreven oppbygging av kollagen og andre ekstracellulære matriseproteiner på overflaten av Descemets membran, danner hornhinnen guttae1. Den eneste kjente behandlingen for FECD er endotel keratoplasty i forskjellige former, som alle har risiko for avvisning og endotelcelletap2. Mens fremskritt i oftalmisk kirurgi har gjort det mulig for disse prosedyrene å bli mindre invasive over tid, noen form for transplantasjon kommer med risikoen for avvisning og mulighet for livstid steroid bruk, en behandling med sine egne samtidige bivirkninger. Videre er den globale donorvevsmangelen slik at bare en donor hornhinne er tilgjengelig for hver 70 pasienter i nød3. Gitt disse utfordringene utforsker forskere og klinikere kirurgiske metoder som unngår behovet for donorvev helt. En av disse eksperimentelle teknikkene er Descemet’s Stripping Only (DSO) eller Descemetorhexis uten Endotelial Keratoplasty (DWEK), der FECD-pasienter med guttae lokalisert til midten av hornhinnen har en sentral 4 mm sirkel av Descemets membran strippet uten graftplassering. Fjerningen av guttae oppfordrer sunne perifere celler til å migrere innover og reformere endotelmonolayeren, til slutt reversere stromal ødem og forbedre synet. Konseptet ble opprinnelig beskrevet i en rekke casestudier der pasienter gjennomgikk kirurgi som ble komplisert ved løsrivelse av Descemets membran, men CEC-repopulering skjedde fortsatt 4,5,6,7. Selv om det er mange fordeler med denne metoden, er helbredelsesprosessen lang og inkonsekvent, da noen pasienter krever redningstransplantasjon hvis ingen helbredelse ses i månedene etter operasjonen8. Av disse grunnene kan et stoff som stimulerer raskere migrasjon og spredning av CPC-er være gunstig i gjenopprettingsprosessen til FECD-pasienter som har gjennomgått DSO.
Flere nyere studier har evaluert ROCK-hemmere som en supplerende behandling for pasienter som gjennomgår DSO, og fant at behandlede pasienter kom seg raskere og hadde høyere sentrale endotelcelletettheter (ECD) enn de i DSO bare gruppe 9,10,11. På grunn av små utvalgsstørrelser og forskjeller mellom doseringsregimer er det imidlertid nødvendig med mer data for å bedre forstå effekten av ROCK-hemmere i denne innstillingen.
Fibroblast vekstfaktorer har også vist seg å stimulere regenerering av hornhinnen endotel både in vitro med bovine CED, og in vivo i feline hornhinnen12,13. eFGF1 (NM141) er en konstruert versjon av FGF-1 som inneholder flere aminosyreerstatninger for å stabilisere molekylet, i motsetning til den innfødte FGF-1, som har en mye kortere halveringstid 14,15. Vi har tidligere demonstrert eFGF1 (NM141) evne til å stimulere spredning av CECs ex vivo i kvartalsvise humane hornhinner16. Denne studien forsøkte å forbedre dette arbeidet ved å etablere den første vellykkede ex vivo-modellen av DSO i både normale og dystrofiske hornhinner for å avgjøre om tilleggsbehandlinger som eFGF1 (NM141) akselererer helbredelse i denne applikasjonen.
Mange øyeleger har bekymringer for å anbefale DSO til sine pasienter av to hovedgrunner: 1) den lange helbredelsesprosessen, og 2) mangel på data (DSO er et nytt konsept innen oftalmisk kirurgi). Forskningen vi har presentert vil være til stor nytte for å lette begge disse bekymringene. Basert på data fra denne studien og andre, fda har godkjent en fase 2 klinisk studie der eFGF1 (NM141) vil bli administrert i varierende dosering tidsplaner til pasienter som gjennomgår DSO17.
Metoden beskrevet ovenfor ble modellert etter en studie utført av Soh et al., hvor hornhinnen endotelhelial helbredelse ble evaluert med og uten ROCK-hemmeren Y-27632 i både riper og skrellede sår18. Mens Y-27632 akselerert endotelregenerering med Descemets membran fortsatt intakt, ble det ikke funnet noen betydelig helbredelse i stripete sår selv med behandling. Ved hjelp av en lignende strippingsteknikk etterfulgt av behandling med eller uten eFGF1 (NM141), var observasjonene vi fant ikke i samsvar med Soh og kollegers. Fraværet av Trypan Blue farging i mange behandlede hornhinner på dag 14, og tilstedeværelsen av ZO-1 positive tette veikryss i det reformerte endotellaget hevder at en intakt barriere, en del av CECs naturlige funksjon, ble restaurert i både normale og dystrofiske hornhinner. Selv om det ikke kvantifiseres i denne studien, antyder tilstedeværelsen av EdU-positive celler i og rundt det stripete området også spredning som en helbredende mekanisme, en som vi tidligere har etablert, kan stimuleres av eFGF1 (NM141) i skadede hornhinnen16. Statistisk analyse viste at behandling med eFGF1 (NM141) resulterte i betydelig større helbredelse fra DSO, i gjennomsnitt over dobbelt så høy som kontroll corneas på 14 dagers tidspunkt. Selv om helbredelsesraten varierer moderat mellom individer – en typisk egenskap ved donor corneas-resultatenes replikerbarhet over store utvalgsstørrelser, viser også en svært målbar metode. Så vidt vi vet er det ingen andre eksempler på en ex vivo Descemets strippingsmodell i litteraturen.
Viktige komponenter i selve protokollen som vil tjene verdifullt for andre forskere som studerer DSO, er bruken av Trypan Blue for å oppdage bar stroma, og bildebehandlingsteknikken som brukes til å måle det fargede området. Trypan Blue brukes ofte i oftalmisk kirurgi, spesielt når du arbeider med Descemets membran for å oppdage ikke-levedyktige celler og hjelpe til med synligheten av vevet. Fargetidspunktene som er inkludert i denne protokollen tillot effektiv gjentatt farging uten over-eksponerende hornhinner til Trypan Blue, som det har vist seg å være giftig for CED ved høye konsentrasjoner19. Reduksjonen av farget område over 14 dager i alle hornhinner, bekreftet av Alizarin Red og immunohistokjemi som et resultat av migrerte CED-er, demonstrerer en enkel og reproduserbar metode for å måle helbredelse. Ved hjelp av ImageJs fargeterskelmeny samlet flere analytikere inn data med standardavvik konsekvent under 1 % (data vises ikke). Selv om alternative programmer kan fungere på samme måte, er ImageJ en programvare med åpen kildekode som er i stand til å produsere nøyaktige områdemålinger for å spore helbredelse.
Det er imidlertid et aspekt av strippingsprotokollen som vi fant å være begge nødvendige for såroppretting, men likevel obstruktivt for den generelle helbredelsesprosessen. Ved å bruke en skarp, 30 G nål for å score Descemets membran langs merket som er igjen av biopsistansen, gjør det mulig å skape et glatt, sirkulært sår som er notert av klinikere for å støtte raskere helbredelse10. Samtidig er dette trinnet skadelig for hornhinnen, da det kan skape tårer i de stromale fibrene som forårsaker stromal celledød, hindrer migrering av endotelceller over sårkanten og induserer dannelsen av knuter som resulterer i mer vedvarende postoperativt ødem20. Klinikere som utfører DSO bruker vanligvis en omvendt Sinskey-krok for å starte såret, men uten noe intraokulært trykk som holder hornhinnen stram, er dette verktøyet mindre effektivt i ex vivo-modellen . Et alternativt verktøy som er i stand til å rive Descemets membran uten å skade den underliggende stromaen, vil forbedre protokollen, for eksempel vanning og aspirasjonshåndstykke anbefalt av Macsai og Shiloach10. Videre eksperimentering vil være nødvendig for å avgjøre om denne teknikken er kompatibel med ex vivo-modellen .
En utfordring som ser ut til å være iboende i ex vivo-modellen er den hyppige forekomsten av CEC-død i området perifer til såret, spesielt i dystrofiske hornhinnen. Dette tilslørte av og til mengden av sårområdet, siden nøyaktigheten av fargeterskelverktøyet blir mer begrenset etter hvert som det fargede området strekker seg utover sentrum av hornhinnen der krumningen resulterer i ujevn lysfordeling. Disse variable målingene forekom imidlertid hovedsakelig på tidligere tidspunkter før perifer farging gradvis trakk seg tilbake etter hvert som skadede CED-er ble tømt og nabocellene strakte seg, migrerte eller spredte seg for å erstatte dem. Ved det siste 14-dagers tidspunktet hadde det fargede området lokalisert tilbake til sentrum av hornhinnen, og alle bildene var målbare. En lignende observasjon ble gjort med sammenlignbar frekvens av Soh et al., hvor fem av 14 normale hornhinnen presenterte det de kalte ‘Premature Culture Failure’ (PCF) tidlig i kulturperioden18. Mens skaden snudde seg over tid i hornhinnene våre og likevel var permanent i deres tilfelle, kan dette tilskrives det faktum at deres metode krevde å såre et større område av hornhinnen. Observasjonen av mer utbredt perifer Trypan farging i dystrofiske hornhinnen kan indikere at dystrofiske hornhinnen er mer utsatt for endotelcelledød enn sunne hornhinnen. Selv om den eksakte årsaken til denne celledøden ennå ikke er belyst, tror vi det er usannsynlig at dette problemet vil være relevant for menneskelige hornhinnen in vivo. Skade på perifert endotel har ikke blitt rapportert i noen kliniske casestudier av DSO til vår kunnskap, noe som tyder på at dette fenomenet er unikt for donor hornhinnen dyrket ex vivo 6,8,10,11,21. Bortsett fra to tilfeller der bare kontroll hornhinnen farget, alle observasjoner av perifer farging ble parret, så det er usannsynlig at årsaken var eksponering for eFGF1 (NM141). Det er imidlertid mulig at behandling i disse tilfellene kan ha gitt en beskyttende effekt mot skaden som ellers ville ha forårsaket perifer farging i begge hornhinnene. Videre undersøkelser av denne hypotesen er nødvendig.
En annen begrensning i denne metoden er sourcing donor corneas representant for FECD fenotype som DSO er ment for. Donor corneas av noe slag er knappe, derav behovet for en operasjon som unngår bruk av donorvev. For våre formål er de eneste hornhinnene som er tilgjengelige, de som avvises fra transplantasjon av ulike grunner. Øyebanker klassifiserer disse hornhinnene ytterligere som normale eller dystrofiske basert på kriterier som tilstedeværelse av guttae, lav eller ikke-målbar ECD og uregelmessig CEC-morfologi. Å bekrefte en dystrofisk diagnose før du godtar vev fra en øyebank er også nesten umulig, siden de fleste giveres medisinske historie ikke inkluderer tidligere okulær historie, og den eneste informasjonen som er gitt er ECD-verdien, teknikerens notater og i noen tilfeller et representativt spektrisk bilde. De dystrofiske hornhinnene som ble oppnådd for denne studien viste ikke sammenfallende sentrale guttae ved konfokal mikroskopi utført etter at kulturperioden var fullført, noe som tyder på at de kan representere “tidlige” stadier av FECD. Vi forventer ikke at dette vil ha en betydelig innvirkning på implikasjonene av studien, da formålet med DSO er å fjerne sammenfallende områder av guttae, slik at sunne perifere celler kan migrere innover.
Denne metoden gir en svært anvendelig og reproduserbar teknikk for å evaluere agenter som kan påvirke CEC-spredning og migrasjon. Modellen har flere funksjoner som gjør den mer fysiologisk relevant enn in vitro-modeller som involverer kultiverte CED-er, selv når de frøes på humant hornhinnen vev graft 22,23,24. For det første er CED-ene som skal stimuleres i en monolayer akkurat som de eksisterer i pasientens øye, og migrerer over hornhinnen stroma som de ville etter klinisk DSO. Det aktuelle stromaet er fra samme pasient som cecs, og kontrollerer dermed for potensielle FECD-relaterte stromale forskjeller. Det er ikke nødvendig å utvise, dissosiere og utvide kulturer på CED-er med tilhørende utfordringer og potensial for endotel til Mesenchymal Transition (EnMT) under kulturingsprosessen. Protokollen som er beskrevet er i seg selv svært lik den kliniske DSO-prosedyren. Mens den omgår kultur- og ekspansjonstrinnene, har denne metoden begrensningen at studievarigheten er begrenset av hornhinnen hevelse, da epitellaget ikke opprettholdes. Dette hemmer oss fra å undersøke morfologien til CED-er som har migrert for å dekke det stripete området, slik at det er uklart om de til slutt vil omorganisere seg til en sekskantet matrise i denne modellen. Garcin et al. har utviklet en potensiell løsning med sin aktive lagringsmaskin (ASM), en enhet som er vist å holde hornhinner i kultur i opptil 3 måneder med betydelig mindre ødem enn hornhinner opprettholdt i tradisjonell organkultur25. En slik enhet kan være nyttig for å replikere og utvide dette arbeidet.
Denne modellen har potensielt nytte i å teste andre sårhelingsterapier (f.eks. ROCK-hemmere), evaluere modifikasjoner på kirurgisk teknikk og sammenligne helbredelse på tvers av forskjellige donorpopulasjoner eller sykdomsstadier. Vi håper denne forskningen, sammen med kliniske studiedata når den kommer ut, oppfordrer klinikere til å vurdere DSO som et verdifullt behandlingsalternativ for sine kvalifiserte FECD-pasienter.
The authors have nothing to disclose.
Støtten til dette arbeidet ble støttet av Trefoil Therapeutics og NIH NCATS TRND CRADA #2016-04. Forfatterne vil takke Tony Wong for hanstopatologi råd og tjenester, Nikon Imaging Center ved UC San Diego for bruk av deres konfiskering mikroskop, og Drs. Natalie Afshari og Marian Macsai for deres råd om kirurgisk teknikk. I tillegg utvider forfatterne sin takknemlighet til donorer av øyne og øyebanker for å gi hornhinnene.
0.2µm sterile 1000 mL filter units | VWR | 10040-440 | |
0.2µm sterile 250 mL filter units | VWR | 10040-464 | |
0.2µm sterile 500 mL filter units | VWR | 10040-436 | |
10mL syringe Luer-Lok Tip | Becton Dickinson | 302995 | |
12 well tissue culture treated plate | Corning | 3513 | |
15 mL conical Tubes | VWR | 89039-668 | |
16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
2mL aspirating pipette | VWR | 414004-265 | |
310 direct heat CO2 incubator | Forma Scientific | 13-998-082 | Set to 37°C, 6% CO2 |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-660 | |
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) | Thermo Scientific | C10337 | |
5mL, 10mL, 25mL and 50mL serological pipettes | VWR | 89130-896, -898, -900, -902 | |
6 well tissue culture treated plate | Corning | 3516 | |
70% ethanol | BDH | BDH1164-4LP | |
Alexa Fluor 488 azide | Thermo Scientific | A10266 | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | |
Analytical balance | Sartorious | R200D | |
Antibiotic & Antimycotic 100x (anti-anti) | Thermo Scientific | 15240-062 | |
Anti-magnetic stainless steel forceps | Excelta | 7-SA | |
Bottle top dispenser | Ward's Science | 470134-946 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | |
Calcium chloride (CaCl) | Amresco | 1B1110-500G | |
Chex-all II sterilzation pouches | Propperman | 24008 | |
Cirpofloxacin hydrochloride | Alfa Aesar | J61970 | |
Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4) | Sigma | 469130-50g | |
Dissecting microscope | Nikon | SMZ1270 | |
Dry vacuum pump | Welch | 2019B-01 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | A31606-01 | |
Frosted micro slides | VWR | 48311-703 | |
Galaxy miniStar microcentrifuge | VWR | C1413, VWR | |
Goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Scientific | A32727 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Haemo-Sol detergent | Haemo-Sol International LLC | 026-050 | |
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate | Thermo Scientific | H3570 | |
Hot plate/stirrer | Corning | PC-320 | |
Human corneas | Lions Eye Institute for Transplant and Research, Advancing Sight Network, Eversight Eye Bank, Lions Vision Gift, and Georgia Eye Bank | NA | |
Hydrochloric acid (HCl) | BDH | BDH7204 | |
ImageJ | National Institute of Health | Version 1.52a | |
Infinity 3s microscopy camera | Lumenera | 1URCAP2 | |
Infinity analyze software | Lumenera | Version 6.5.5 | |
Insulin transferrin selenium (ITS) | Corning | 41400-045 | |
Iris scissors, 11 cm | World Precision Instruments | 501264-G | |
L- Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | |
Manual single channel pipet | Rainin | 17014-392, -391, -382 | |
Needle PrecisionGlide 30G | Becton Dickinson | 305106 | |
N-Met141 TTHX1114 | Biopharmaceutical Development Program | NA | |
Opti-Mem I + GlutaMAX-1 (Opti-MEM) | Thermo Scientific | 51985-034 | |
Orion Star A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA211 | |
Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
Potassium chloride (KCl) | BDH | BDH9258-500G | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | VWR | 0781-500G | |
Powerpette plus pipet controller | VWR | 75856-456 | |
Precision water bath 188 | Precision Scientific Incorporated | WB05 | Set to 37°C |
Purifier Class II model biosafety cabinet | Labconco | 36213043726 | |
Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363212 | |
Scalpel size 22 stainless steel | Sklar | 446479 | |
Sodium chloride (NaCl) | VWR | 2041-2.5K | |
Sodium hosphate dibasic (Na2HPO4) | VWR | 0404-1KG | |
Standard shaker | VWR | 89032-092 | |
Standard solid refrigerator | VWR | 10820-402 | Set to 4°C |
Sterilmatic autoclave | Market Forge | STM-EL | |
Syringe filters | VWR | 28145-477 | |
Test tube rocker | Thermo Scientific | M48725Q | |
Tru-Punch disposable biopsy punch, 4 mm | Sklar | 96-1146 | |
Trypan Blue | Thermo Scientific | 15250-061 | |
Tween-20 | Sigma | P7949-100mL | |
Vibrance antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories Inc. | H-1800 | |
VistaVision cover glasses, no. 1 | VWR | 16004-098 | |
Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
ZO-1 monoclonal antibody (ZO1-1A12) | Thermo Scientific | 33-9100 |