Diese Studie verwendet Durchflusszytometrie und zwei verschiedene Gating-Strategien an isolierten perfundierten Mäusen Gehirn-Aderhautplexus; Dieses Protokoll identifiziert die wichtigsten Untergruppen von Immunzellen, die diese Gehirnstruktur bevölkern.
Das Gehirn wird nicht mehr als ein isoliert funktionierendes Organ betrachtet; Sich häufende Beweise deuten darauf hin, dass Veränderungen im peripheren Immunsystem die Gehirnfunktion indirekt beeinflussen können. An der Schnittstelle zwischen dem Gehirn und dem systemischen Kreislauf wurden die Aderhautplexus (CP), die die Blut-Cerebrospinal-Flüssigkeitsschranke bilden, als Schlüsselort der Peripherie-zu-Gehirn-Kommunikation hervorgehoben. CP produziert die Zerebrospinalflüssigkeit, neurotrophe Faktoren und Signalmoleküle, die die Homöostase des Gehirns beeinflussen können. CP sind auch eine aktive immunologische Nische. Im Gegensatz zum Hirnparenchym, das unter physiologischen Bedingungen hauptsächlich von Mikroglia besiedelt wird, rekapituliert die Heterogenität der CP-Immunzellen die Vielfalt anderer peripherer Organe. Die Vielfalt und Aktivität der CP-Immunzellen ändert sich mit Alterung, Stress und Krankheit und moduliert die Aktivität des CP-Epithels, wodurch die Gehirnfunktion indirekt beeinflusst wird. Das Ziel dieses Protokolls ist es, murine CP zu isolieren und etwa 90% der wichtigsten Immununtergruppen, die sie bevölkern, zu identifizieren. Diese Methode ist ein Werkzeug, um CP-Immunzellen zu charakterisieren und ihre Funktion bei der Orchestrierung der Peripherie-zu-Gehirn-Kommunikation zu verstehen. Das vorgeschlagene Protokoll könnte helfen zu entschlüsseln, wie CP-Immunzellen indirekt die Gehirnfunktion in der Gesundheit und über verschiedene Krankheitszustände hinweg modulieren.
Seit der Entdeckung der Blut-Hirn-Schranke durch Paul Erhlich im späten 19. Jahrhundert gilt das Gehirn als praktisch getrennt von den anderen Organen und dem Blutkreislauf. In den letzten zehn Jahren ist jedoch das Konzept entstanden, dass die Gehirnfunktion von verschiedenen biologischen Faktoren wie Darmmikrobiota und systemischen Immunzellen und -signalen geprägt wird1,2,3,4. Parallel dazu wurden andere Hirngrenzen wie Hirnhäute und Aderhautplexus (CP) als Schnittstellen des aktiven Immun-Hirn-Cross-Talks und nicht als inertes Barrieregewebe identifiziert5,6,7,8.
Die CP bilden die Blut-Zerebrospinal-Flüssigkeitsschranke, eine der Grenzen, die das Gehirn und die Peripherie trennen. Sie befinden sich in jedem der vier Ventrikel des Gehirns, d.h. im dritten, vierten und beiden lateralen Ventrikeln, und grenzen an Bereiche an, die an der Neurogenese beteiligt sind, wie die subventrikuläre Zone und die subgranulare Zone des Hippocampus3. Strukturell bestehen die CP aus einem Netzwerk von fenestrierten Blutkapillaren, die von einer Monoschicht von Epithelzellen umgeben sind, die durch enge und adhärene Übergänge miteinander verbunden sind9,10. Zu den wichtigsten physiologischen Rollen des CP-Epithels gehören die Produktion von Zerebrospinalflüssigkeit, die das Gehirn von Abfallmetaboliten und Proteinaggregaten spült, sowie die Produktion und kontrollierte Blut-zu-Gehirn-Passage verschiedener Signalmoleküle, einschließlich Hormone und neurotropher Faktoren11,12,13. Sekretierte Moleküle aus CP beeinflussen die Aktivität des Gehirns, d.h. durch Modulation der Neurogenese und der Mikrogliafunktion14,15,16,17,18,19, was CP für die Homöostase des Gehirns entscheidend macht. CP engagieren sich auch in verschiedenen Immunaktivitäten; Während der Hauptimmunzelltyp im Gehirnparenchym unter nicht-pathologischen Bedingungen Mikroglia ist, ist die Vielfalt der CP-Immunzellpopulationen so breit wie in peripheren Organen3,7, was darauf hindeutet, dass verschiedene Kanäle der Immunregulation und -signalisierung am CP am Werk sind.
Der Raum zwischen den Endothel- und Epithelzellen, das CP-Stroma, wird hauptsächlich von grenzassoziierten Makrophagen (BAM) bevölkert, die proinflammatorische Zytokine und Moleküle im Zusammenhang mit der Antigenpräsentation als Reaktion auf Entzündungssignale exprimieren3. Ein weiterer Subtyp von Makrophagen, Kolmers Epiplexuszellen, sind auf der apikalen Oberfläche des CP-Epithels20 vorhanden. CP-Stroma ist auch eine Nische für dendritische Zellen, B-Zellen, Mastzellen, Basophile, Neutrophile, angeborene lymphatische Zellen und T-Zellen, die meist Effektor-Gedächtnis-T-Zellen sind, die in der Lage sind, Antigene des zentralen Nervensystems zu erkennen7,21,22,23,24. Darüber hinaus ändert sich die Zusammensetzung und Aktivität von Immunzellpopulationen am CP bei systemischer oder Gehirnstörung, beispielsweise während des Alterns10,14,15,21,25, der Störung der Mikrobiota7, des Stress26 und der Krankheit27,28. Insbesondere wurde vorgeschlagen, dass diese Veränderungen indirekt die Gehirnfunktion beeinflussen, d.h. eine Verschiebung von CP CD4 + T-Zellen in Richtung Th2-Entzündung tritt bei der Gehirnalterung auf und löst Immunsignale aus dem CP aus, die den altersbedingten kognitiven Verfall beeinflussen können14,15,21,25,29 . Die Beleuchten der Eigenschaften der CP-Immunzellen wäre daher entscheidend, um ihre regulatorische Funktion auf die Physiologie und Sekretion des CP-Epithels besser zu verstehen und dadurch ihren indirekten Einfluss auf die Gehirnfunktion unter gesunden und Krankheitsbedingungen zu entschlüsseln.
CP sind kleine Strukturen, die nur wenige Immunzellen enthalten. Ihre Isolierung erfordert eine Mikrodissektion nach einem vorbereitenden Perfusionsschritt; Immunzellen im Blutkreislauf würden sonst große Verunreinigungen darstellen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die myeloischen und T-Zell-Teilmengen des CP mittels Durchflusszytometrie zu charakterisieren. Diese Methode identifiziert etwa 90% der Immunzellpopulationen, die Maus-CP unter nicht-entzündlichen Bedingungen bilden, in Übereinstimmung mit kürzlich veröffentlichten Arbeiten, die andere Methoden zur Sezierung der Immun-CP-Heterogenität verwenden7,10,28. Dieses Protokoll könnte angewendet werden, um Veränderungen im CP-Immunzellkompartiment mit Krankheit und anderen experimentellen Paradigmen in vivo zu charakterisieren.
Studien, die darauf abzielen, die immunologischen Beiträge zur Homöostase und Erkrankung des Gehirns zu verstehen, konzentrierten sich hauptsächlich auf Zellen, die sich im Gehirnparenchym befinden, und vernachlässigten Gehirngrenzen wie CP, die dennoch entscheidend zur Gehirnfunktion beitragen2,3. Die Analyse von Immunzellpopulationen bei CP ist aufgrund der geringen Größe von CP, der geringen Anzahl residenter Immunzellen und des komplizierten Zugangs zu …
The authors have nothing to disclose.
Wir danken dem Institut Pasteur Animalerie Centrale und den Mitgliedern der CB-UTechS-Einrichtung für ihre Hilfe. Diese Arbeit wurde vom Institut Pasteur finanziell unterstützt.
anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Flow cytometry antibody |
Albumin, bovine | MP Biomedicals | 160069 | Blocking reagent |
APC anti-mouse CX3CR1 | BioLegend | 149008 | Flow cytometry antibody |
APC anti-mouse TCRb | BioLegend | 109212 | Flow cytometry antibody |
APC-Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100414 | Flow cytometry antibody |
APC-Cy7 anti-mouse IA-IE | BioLegend | 107628 | Flow cytometry antibody |
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry analyzer | |
BV711 anti-mouse Ly6C | BioLegend | 128037 | Flow cytometry antibody |
Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | Enzyme to dissociate CP tissue |
DAPI | Thermo Scientific | 62248 | Live/dead marker |
EDTA | Ion chelator | ||
fine scissors | FST | 14058-11 | Dissection tool |
FITC anti-mouse CD45 | BioLegend | 103108 | Flow cytometry antibody |
Flow controller infusion inset | CareFusion | RG-3-C | Blood perfusion inset |
FlowJo software | BD Biosciences | Analysis software | |
forceps | FST | 11018-12 | Dissection tool |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Anticoagulant |
Imalgene | Boehringer Ingelheim | Ketamine, anesthesic | |
OneComp eBeads | Invitrogen | 01-1111-42 | Control beads to realize compensation |
PBS-/- | Gibco | 14190-094 | Buffer |
PBS+/+ | Gibco | 14040-091 | Buffer |
PE anti-mouse CD8a | BioLegend | 100708 | Flow cytometry antibody |
PE anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123110 | Flow cytometry antibody |
PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101256 | Flow cytometry antibody |
Rompun | Bayer | Xylazine, anesthesic | |
thin forceps | Dumoxel Biology | 11242-40 | Dissection tool |
Vetergesic | Ceva | Buprenorphin, analgesic |