Summary

Isolierung und Charakterisierung der Immunzellen aus mikrodissektierten Maus-Aderhautplexus

Published: February 03, 2022
doi:

Summary

Diese Studie verwendet Durchflusszytometrie und zwei verschiedene Gating-Strategien an isolierten perfundierten Mäusen Gehirn-Aderhautplexus; Dieses Protokoll identifiziert die wichtigsten Untergruppen von Immunzellen, die diese Gehirnstruktur bevölkern.

Abstract

Das Gehirn wird nicht mehr als ein isoliert funktionierendes Organ betrachtet; Sich häufende Beweise deuten darauf hin, dass Veränderungen im peripheren Immunsystem die Gehirnfunktion indirekt beeinflussen können. An der Schnittstelle zwischen dem Gehirn und dem systemischen Kreislauf wurden die Aderhautplexus (CP), die die Blut-Cerebrospinal-Flüssigkeitsschranke bilden, als Schlüsselort der Peripherie-zu-Gehirn-Kommunikation hervorgehoben. CP produziert die Zerebrospinalflüssigkeit, neurotrophe Faktoren und Signalmoleküle, die die Homöostase des Gehirns beeinflussen können. CP sind auch eine aktive immunologische Nische. Im Gegensatz zum Hirnparenchym, das unter physiologischen Bedingungen hauptsächlich von Mikroglia besiedelt wird, rekapituliert die Heterogenität der CP-Immunzellen die Vielfalt anderer peripherer Organe. Die Vielfalt und Aktivität der CP-Immunzellen ändert sich mit Alterung, Stress und Krankheit und moduliert die Aktivität des CP-Epithels, wodurch die Gehirnfunktion indirekt beeinflusst wird. Das Ziel dieses Protokolls ist es, murine CP zu isolieren und etwa 90% der wichtigsten Immununtergruppen, die sie bevölkern, zu identifizieren. Diese Methode ist ein Werkzeug, um CP-Immunzellen zu charakterisieren und ihre Funktion bei der Orchestrierung der Peripherie-zu-Gehirn-Kommunikation zu verstehen. Das vorgeschlagene Protokoll könnte helfen zu entschlüsseln, wie CP-Immunzellen indirekt die Gehirnfunktion in der Gesundheit und über verschiedene Krankheitszustände hinweg modulieren.

Introduction

Seit der Entdeckung der Blut-Hirn-Schranke durch Paul Erhlich im späten 19. Jahrhundert gilt das Gehirn als praktisch getrennt von den anderen Organen und dem Blutkreislauf. In den letzten zehn Jahren ist jedoch das Konzept entstanden, dass die Gehirnfunktion von verschiedenen biologischen Faktoren wie Darmmikrobiota und systemischen Immunzellen und -signalen geprägt wird1,2,3,4. Parallel dazu wurden andere Hirngrenzen wie Hirnhäute und Aderhautplexus (CP) als Schnittstellen des aktiven Immun-Hirn-Cross-Talks und nicht als inertes Barrieregewebe identifiziert5,6,7,8.

Die CP bilden die Blut-Zerebrospinal-Flüssigkeitsschranke, eine der Grenzen, die das Gehirn und die Peripherie trennen. Sie befinden sich in jedem der vier Ventrikel des Gehirns, d.h. im dritten, vierten und beiden lateralen Ventrikeln, und grenzen an Bereiche an, die an der Neurogenese beteiligt sind, wie die subventrikuläre Zone und die subgranulare Zone des Hippocampus3. Strukturell bestehen die CP aus einem Netzwerk von fenestrierten Blutkapillaren, die von einer Monoschicht von Epithelzellen umgeben sind, die durch enge und adhärene Übergänge miteinander verbunden sind9,10. Zu den wichtigsten physiologischen Rollen des CP-Epithels gehören die Produktion von Zerebrospinalflüssigkeit, die das Gehirn von Abfallmetaboliten und Proteinaggregaten spült, sowie die Produktion und kontrollierte Blut-zu-Gehirn-Passage verschiedener Signalmoleküle, einschließlich Hormone und neurotropher Faktoren11,12,13. Sekretierte Moleküle aus CP beeinflussen die Aktivität des Gehirns, d.h. durch Modulation der Neurogenese und der Mikrogliafunktion14,15,16,17,18,19, was CP für die Homöostase des Gehirns entscheidend macht. CP engagieren sich auch in verschiedenen Immunaktivitäten; Während der Hauptimmunzelltyp im Gehirnparenchym unter nicht-pathologischen Bedingungen Mikroglia ist, ist die Vielfalt der CP-Immunzellpopulationen so breit wie in peripheren Organen3,7, was darauf hindeutet, dass verschiedene Kanäle der Immunregulation und -signalisierung am CP am Werk sind.

Der Raum zwischen den Endothel- und Epithelzellen, das CP-Stroma, wird hauptsächlich von grenzassoziierten Makrophagen (BAM) bevölkert, die proinflammatorische Zytokine und Moleküle im Zusammenhang mit der Antigenpräsentation als Reaktion auf Entzündungssignale exprimieren3. Ein weiterer Subtyp von Makrophagen, Kolmers Epiplexuszellen, sind auf der apikalen Oberfläche des CP-Epithels20 vorhanden. CP-Stroma ist auch eine Nische für dendritische Zellen, B-Zellen, Mastzellen, Basophile, Neutrophile, angeborene lymphatische Zellen und T-Zellen, die meist Effektor-Gedächtnis-T-Zellen sind, die in der Lage sind, Antigene des zentralen Nervensystems zu erkennen7,21,22,23,24. Darüber hinaus ändert sich die Zusammensetzung und Aktivität von Immunzellpopulationen am CP bei systemischer oder Gehirnstörung, beispielsweise während des Alterns10,14,15,21,25, der Störung der Mikrobiota7, des Stress26 und der Krankheit27,28. Insbesondere wurde vorgeschlagen, dass diese Veränderungen indirekt die Gehirnfunktion beeinflussen, d.h. eine Verschiebung von CP CD4 + T-Zellen in Richtung Th2-Entzündung tritt bei der Gehirnalterung auf und löst Immunsignale aus dem CP aus, die den altersbedingten kognitiven Verfall beeinflussen können14,15,21,25,29 . Die Beleuchten der Eigenschaften der CP-Immunzellen wäre daher entscheidend, um ihre regulatorische Funktion auf die Physiologie und Sekretion des CP-Epithels besser zu verstehen und dadurch ihren indirekten Einfluss auf die Gehirnfunktion unter gesunden und Krankheitsbedingungen zu entschlüsseln.

CP sind kleine Strukturen, die nur wenige Immunzellen enthalten. Ihre Isolierung erfordert eine Mikrodissektion nach einem vorbereitenden Perfusionsschritt; Immunzellen im Blutkreislauf würden sonst große Verunreinigungen darstellen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die myeloischen und T-Zell-Teilmengen des CP mittels Durchflusszytometrie zu charakterisieren. Diese Methode identifiziert etwa 90% der Immunzellpopulationen, die Maus-CP unter nicht-entzündlichen Bedingungen bilden, in Übereinstimmung mit kürzlich veröffentlichten Arbeiten, die andere Methoden zur Sezierung der Immun-CP-Heterogenität verwenden7,10,28. Dieses Protokoll könnte angewendet werden, um Veränderungen im CP-Immunzellkompartiment mit Krankheit und anderen experimentellen Paradigmen in vivo zu charakterisieren.

Protocol

Alle Verfahren, die mit den Leitlinien der Europäischen Kommission für den Umgang mit Versuchstieren, Richtlinie 86/609/EWG, übereinstimmen. Sie wurden von den Ethikkommissionen Nr. 59, von der CETEA/CEEA Nr. 089, unter der Nummer dap210067 und APAFIS #32382-2021070917055505 v1 genehmigt. 1. Vorbereitung der Materialien Lagern Sie alle Antikörper (Materialtabelle) bei 4 °C, geschützt vor Lichteinwirkung. DAPI-Stammlösung (…

Representative Results

Die hier vorgestellten Durchflusszytometrie-Analysen zeigten erfolgreich die wichtigsten Teilmengen der myeloischen und T-Zellen (Abbildung 1 bzw. Abbildung 2) und ihre relative Gesamtzahl pro Maus in einer hochgradig reproduzierbaren Weise (Abbildung 3). Die Durchflusszytometrie-Analyse myeloischer Zellen zeigte, dass CP mit CD11b+ CX3CR1+ F4/80high BAM bestückt sind, wa…

Discussion

Studien, die darauf abzielen, die immunologischen Beiträge zur Homöostase und Erkrankung des Gehirns zu verstehen, konzentrierten sich hauptsächlich auf Zellen, die sich im Gehirnparenchym befinden, und vernachlässigten Gehirngrenzen wie CP, die dennoch entscheidend zur Gehirnfunktion beitragen2,3. Die Analyse von Immunzellpopulationen bei CP ist aufgrund der geringen Größe von CP, der geringen Anzahl residenter Immunzellen und des komplizierten Zugangs zu …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken dem Institut Pasteur Animalerie Centrale und den Mitgliedern der CB-UTechS-Einrichtung für ihre Hilfe. Diese Arbeit wurde vom Institut Pasteur finanziell unterstützt.

Materials

anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142 Flow cytometry antibody
Albumin, bovine MP Biomedicals 160069 Blocking reagent
APC anti-mouse CX3CR1 BioLegend 149008 Flow cytometry antibody
APC anti-mouse TCRb BioLegend 109212 Flow cytometry antibody
APC-Cy7 anti-mouse CD4 BioLegend 100414 Flow cytometry antibody
APC-Cy7 anti-mouse IA-IE BioLegend 107628 Flow cytometry antibody
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer BD Biosciences Flow cytometry analyzer
BV711 anti-mouse Ly6C BioLegend 128037 Flow cytometry antibody
Collagenase IV Gibco 17104-019 Enzyme to dissociate CP tissue
DAPI Thermo Scientific 62248 Live/dead marker
EDTA Ion chelator
fine scissors FST 14058-11 Dissection tool
FITC anti-mouse CD45 BioLegend 103108 Flow cytometry antibody
Flow controller infusion inset CareFusion RG-3-C Blood perfusion inset
FlowJo software BD Biosciences Analysis software
forceps FST 11018-12 Dissection tool
Heparin Sigma-Aldrich H3149-10KU Anticoagulant
Imalgene Boehringer Ingelheim Ketamine, anesthesic
OneComp eBeads Invitrogen 01-1111-42 Control beads to realize compensation
PBS-/- Gibco 14190-094 Buffer
PBS+/+ Gibco 14040-091 Buffer
PE anti-mouse CD8a BioLegend 100708 Flow cytometry antibody
PE anti-mouse F4/80 BioLegend 123110 Flow cytometry antibody
PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b BioLegend 101256 Flow cytometry antibody
Rompun Bayer Xylazine, anesthesic
thin forceps Dumoxel Biology 11242-40 Dissection tool
Vetergesic Ceva Buprenorphin, analgesic

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Dominguez-Belloso, A., Schmutz, S., Novault, S., Travier, L., Deczkowska, A. Isolation and Characterization of the Immune Cells from Micro-dissected Mouse Choroid Plexuses. J. Vis. Exp. (180), e63487, doi:10.3791/63487 (2022).

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