فحص مراسل لتحليل نضج الحمض النووي الريبي الميكروي الإنتروني في خلايا الثدييات
Summary
قمنا بتطوير فحص مراسل التكوين الحيوي للحمض النووي الريبوزي المرسال الميكروي الإنتروني لاستخدامه في الخلايا في المختبر مع أربعة بلازميدات: واحد مع miRNA intronic ، واحد مع الهدف ، واحد للمبالغة في التعبير عن بروتين تنظيمي ، وواحد ل Renilla luciferase. تمت معالجة miRNA ويمكنه التحكم في تعبير luciferase عن طريق الارتباط بالتسلسل المستهدف.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) هي جزيئات RNA قصيرة منتشرة على نطاق واسع في حقيقيات النوى. يتم نسخ معظم miRNAs من الإنترونات ، ويتضمن نضجها بروتينات مختلفة مرتبطة بالحمض النووي الريبي في النواة. غالبا ما تتوسط الحمض النووي الريبوزي المرسال الناضج في إسكات الجينات ، وقد أصبح هذا أداة مهمة لفهم أحداث ما بعد النسخ. إلى جانب ذلك ، يمكن استكشافه كمنهجية واعدة للعلاجات الجينية. ومع ذلك ، هناك حاليا نقص في الطرق المباشرة لتقييم تعبير miRNA في مزارع خلايا الثدييات. هنا ، نصف طريقة فعالة وبسيطة تساعد في تحديد التكوين الحيوي للحمض النووي الريبوزي المرسال ونضجه من خلال تأكيد تفاعله مع التسلسلات المستهدفة. أيضا ، يسمح هذا النظام بفصل نضج miRNA الخارجي عن نشاطه الداخلي باستخدام مروج مستحث للدوكسيسيكلين قادر على التحكم في نسخ miRNA الأولي (pri-miRNA) بكفاءة عالية وتكلفة منخفضة. تسمح هذه الأداة أيضا بالتشكيل باستخدام بروتينات ربط الحمض النووي الريبي في بلازميد منفصل. بالإضافة إلى استخدامه مع مجموعة متنوعة من miRNAs المختلفة وأهدافها الخاصة ، يمكن تكييفها مع خطوط الخلايا المختلفة ، شريطة أن تكون قابلة للنقل.
Introduction
يعد ربط الحمض النووي الريبوزي المرسال السلائف عملية مهمة لتنظيم التعبير الجيني في حقيقيات النوى1. يتم تحفيز إزالة الإنترونات واتحاد الإكسونات في الحمض النووي الريبي الناضج بواسطة spliceosome ، وهو مركب بروتين ريبي نووي 2 ميجادالتون يتكون من 5 snRNAs (U1 و U2 و U4 و U5 و U6) إلى جانب أكثر من 100 بروتين 2,3. يحدث تفاعل الربط بشكل مشترك ، ويتم تجميع spliceosome في كل إنترون جديد مسترشدا بالتعرف على مواقع الربط المحفوظة عند حدود exon-intron وداخل intron4. قد يكون للإنترونات المختلفة معدلات ربط مختلفة على الرغم من الحفظ الملحوظ لمجمع spliceosome ومكوناته. بالإضافة إلى الاختلافات في الحفاظ على موقع الربط ، يمكن للتسلسلات التنظيمية الموزعة على الإنترونات والإكسونات توجيه البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي (RBP) وتحفيز أو قمع الربط 5,6. HuR هو RBP يتم التعبير عنه في كل مكان وهو عامل مهم للتحكم في استقرار mRNA7. أظهرت النتائج السابقة من مجموعتنا أن HuR يمكن أن يرتبط بالإنترونات التي تحتوي على miRNAs ، مما يشير إلى أن هذا البروتين قد يكون عاملا مهما لتسهيل معالجة miRNA ونضجه ، مما يؤدي أيضا إلى توليد أشكال ربط بديلة 6,8,9.
يتم ترميز العديد من microRNAs (miRNAs) من تسلسلات إنترونية. في حين أن بعضها جزء من الإنترون ، فإن البعض الآخر يعرف باسم “mirtrons” ويتم تشكيله بواسطة intron10,11 بأكمله. miRNAs هي RNAs قصيرة غير مشفرة ، تتراوح من 18 إلى 24 نيوكليوتيدات في الطول12. يظهر تسلسلها الناضج تكاملا جزئيا أو كليا مع التسلسلات المستهدفة في mRNAs ، مما يؤثر على الترجمة و / أو معدلات اضمحلال mRNA. مجموعات من miRNAs والأهداف تدفع الخلية إلى نتائج مختلفة. يمكن للعديد من miRNAs دفع الخلايا إلى الأنماط الظاهرية المؤيدة أو المضادة للوذكور13. عادة ما تستهدف miRNAs السرطانية المنشأ mRNAs التي تؤدي إلى خاصية قمعية ، مما يؤدي إلى زيادة الانتشار الخلوي والهجرة والغزو14. من ناحية أخرى ، قد تستهدف miRNAs المثبطة للورم mRNAs المسببة للأورام أو mRNAs المتعلقة بزيادة انتشار الخلايا.
تعتمد معالجة ونضج miRNAs أيضا على أصلها. تتم معالجة معظم miRNAs الإنترونية بمشاركة المعالج الدقيق ، الذي يتكون من الريبونوكلياز دروشا والعوامل المساعدة للبروتين12. تتم معالجة Mirtrons مع نشاط spliceosome بشكل مستقل عن Drosha15. بالنظر إلى التردد العالي لل miRNAs الموجودة داخل الإنترونات ، افترضنا أن البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي المشاركة في الربط يمكن أن تسهل أيضا معالجة ونضج هذه miRNAs. والجدير بالذكر أن RBP hnRNP A2 / B1 قد ارتبط بالفعل بالمعالج الدقيق والتكوين الحيوي miRNA16.
لقد أبلغنا سابقا أن العديد من البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي ، مثل hnRNPs و HuR ، ترتبط بالحمض النووي الريبوزي المرسال الاستبطاني بواسطة مطياف الكتلة17. تم تأكيد ارتباط HuR (ELAVL1) مع miRNAs من الكتلة الإنترونية miR-17-92 باستخدام الترسيب المناعي وفي تحليل سيليكو 9. miR-17-92 هي مجموعة miRNA إنترونية تتكون من ستة miRNAs مع زيادة التعبير في أنواع السرطان المختلفة18,19. تعرف هذه المجموعة أيضا باسم “oncomiR-1” وتتكون من miR-17 و miR-18a و miR-19 a و miR-20 و miR-19 b و miR-92 a. miR-19 a و miR-19b هي من بين أكثر miRNAs ورمية المنشأ في هذه المجموعة 19. زيادة التعبير عن HuR يحفز miR-19a و miR-19b التوليف9. نظرا لأن المناطق الإنترونية المحيطة بهذه المجموعة مرتبطة ب HuR ، فقد طورنا طريقة للتحقيق فيما إذا كان هذا البروتين يمكن أن ينظم تعبير ونضج miR-19a و miR-19b. كان أحد التنبؤات المهمة لفرضيتنا هو أنه ، كبروتين تنظيمي ، يمكن أن يسهل HuR التكوين الحيوي miRNA ، مما يؤدي إلى تغييرات في النمط الظاهري. كان أحد الاحتمالات هو أن miRNAs تمت معالجتها عن طريق تحفيز HuR ولكنها لن تكون ناضجة ووظيفية ، وبالتالي ، فإن آثار البروتين لن تؤثر بشكل مباشر على النمط الظاهري. لذلك ، قمنا بتطوير فحص مراسل الربط للتحقيق فيما إذا كان RBP مثل HuR يمكن أن يؤثر على التكوين الحيوي ونضج miRNA الإنتروني. من خلال تأكيد معالجة miRNA ونضجها ، يظهر فحصنا التفاعل مع التسلسل المستهدف وتوليد miRNA ناضج ووظيفي. في فحصنا ، نقوم بإقران التعبير عن مجموعة miRNA الإنترونية مع بلازميد luciferase للتحقق من وجود ربط مستهدف miRNA في الخلايا المستزرعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد ربط ما قبل الحمض النووي الريبوزي المرسال عملية مهمة لتنظيم التعبير الجيني ، ويمكن أن يؤدي التحكم فيه إلى تأثيرات قوية على تعديلات النمط الظاهري للخلية22,23. يتم نسخ أكثر من 70٪ من miRNAs من الإنترونات في البشر ، وافترضنا أنه يمكن تسهيل معالجتها ونضجها عن طريق …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشعر المؤلفون بالامتنان ل E. Makeyev (جامعة نانيانغ التكنولوجية ، سنغافورة) لخلايا HeLa-Cre وبلازميدات pRD-RIPE و pCAGGS-Cre. نشكر إدنا كيمورا وكارولينا بورسيل غويس وجيزيلا راموس ولوسيا روسيتي لوبيز وأنسيلمو موريسكوت على دعمهم.
Materials
| Recombinant DNA | |||
| pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pFLAG-HuR | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-RAP-IB | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-scrambled | Generated during this work | ||
| pRD-miR-17-92 | Generated during this work | ||
| pRD-RIPE-donor | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pTK-Renilla | Promega | E2241 | |
| Antibodies | |||
| anti-B-actin | Sigma Aldrich | A5316 | |
| anti-HuR | Cell Signaling | mAb 12582 | |
| IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG | Li-Cor Biosciences | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG | Li-Cor Biosciences | 929-70020 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HeLa-Cre | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| HeLa-Cre miR17-92 | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-scrambled | Generated during this work | ||
| Chemicals and Peptides | |||
| DMEM/high-glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800-017 | |
| Doxycycline | BioBasic | MB719150 | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | ER0271 | |
| EcoRV | Thermo Fisher Scientific | ER0301 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | E859-EG | |
| L-glutamine | Life Technologies | ||
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| pFLAG-CMV™-3 Expression Vector | Sigma Aldrich | E6783 | |
| pGEM-T | Promega | A3600 | |
| Platinum Taq DNA polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10966-030 | |
| pmiR-GLO | Promega | E1330 | |
| Puromycin | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNAse OUT | Thermo Fisher Scientific | 752899 | |
| SuperScript IV kit | Thermo Fisher Scientific | 18091050 | |
| Trizol-LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | |
| trypsin/EDTA 10X | Life Technologies | 15400-054 | |
| XbaI | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | |
| XhoI | Promega | R616A | |
| Oligonucleotides | |||
| forward RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT |
|
| reverse RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
| forward scrambled pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT |
|
| reverse scrambled pmiRGLO | Exxtend | CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
| forward HuR pFLAG | Exxtend | GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC |
|
| reverse HuR pFLAG | Exxtend | GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG |
|
| forward pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG |
|
| reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG |
|
| forward snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | CTCGCTTCGGCAGCACATATAC | |
| reverse snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG | |
| forward B-Actin qPCR | Exxtend | ACCTTCTACAATGAGCTGCG | |
| reverse B-Actin qPCR | Exxtend | CCTGGATAGCAACGTACATGG | |
| forward HuR qPCR | Exxtend | ATCCTCTGGCAGATGTTTGG | |
| reverse HuR qPCR | Exxtend | CATCGCGGCTTCTTCATAGT | |
| forward pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG |
|
| reverse pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG |
|
| Software and Algorithms | |||
| Prism 8 for Mac OS X | Graphpad | https://www.graphpad.com | |
| ImageJ | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij |
References
- Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
- Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
- Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
- Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
- Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
- Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
- Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
- Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
- Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
- Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
- Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs – MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
- Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
- Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
- Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
- Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
- He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
- Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
- Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
- Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
- Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
- Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
- Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
- Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
- Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).
- Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
- Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).
