Un saggio reporter per analizzare la maturazione dei microRNA intronici in cellule di mammifero
Summary
Abbiamo sviluppato un saggio reporter di biogenesi di microRNA intronico da utilizzare in cellule in vitro con quattro plasmidi: uno con miRNA intronico, uno con il bersaglio, uno per sovraesprimere una proteina regolatrice e uno per Renilla luciferasi. Il miRNA è stato elaborato e potrebbe controllare l’espressione della luciferasi legandosi alla sequenza bersaglio.
Abstract
I microRNA (miRNA) sono molecole di RNA corte che sono diffuse negli eucarioti. La maggior parte dei miRNA sono trascritti da introni e la loro maturazione coinvolge diverse proteine leganti l’RNA nel nucleo. I miRNA maturi mediano frequentemente il silenziamento genico, e questo è diventato uno strumento importante per comprendere gli eventi post-trascrizionali. Oltre a ciò, può essere esplorato come una metodologia promettente per le terapie geniche. Tuttavia, attualmente mancano metodi diretti per valutare l’espressione dei miRNA nelle colture cellulari di mammifero. Qui, descriviamo un metodo efficiente e semplice che aiuta a determinare la biogenesi e la maturazione dei miRNA attraverso la conferma della sua interazione con le sequenze bersaglio. Inoltre, questo sistema consente la separazione della maturazione dei miRNA esogeni dalla sua attività endogena utilizzando un promotore inducibile dalla doxiciclina in grado di controllare la trascrizione primaria dei miRNA (pri-miRNA) con alta efficienza e basso costo. Questo strumento consente anche la modulazione con proteine leganti l’RNA in un plasmide separato. Oltre al suo uso con una varietà di miRNA diversi e i loro rispettivi bersagli, può essere adattato a diverse linee cellulari, a condizione che queste siano suscettibili di trasfezione.
Introduction
Lo splicing dell’mRNA precursore è un processo importante per la regolazione dell’espressione genica negli eucarioti1. La rimozione degli introni e l’unione degli esoni nell’RNA maturo è catalizzata dallo spliceosoma, un complesso ribonucleoproteico di 2 megadalton composto da 5 snRNA (U1, U2, U4, U5 e U6) insieme a più di 100 proteine 2,3. La reazione di splicing avviene co-trascrizionalmente e lo spliceosoma viene assemblato ad ogni nuovo introne guidato dal riconoscimento dei siti di giunzione conservati ai confini dell’esone-introne e all’interno dell’introne4. Introni diversi potrebbero avere velocità di splicing diverse nonostante la notevole conservazione del complesso dello spliceosoma e dei suoi componenti. Oltre alle differenze nella conservazione del sito di splicing, le sequenze regolatorie distribuite su introni ed esoni possono guidare le proteine leganti l’RNA (RBP) e stimolare o reprimere lo splicing 5,6. HuR è un RBP espresso ubiquitariamente ed è un fattore importante per controllare la stabilità dell’mRNA7. I risultati precedenti del nostro gruppo hanno mostrato che HuR può legarsi agli introni contenenti miRNA, indicando che questa proteina potrebbe essere un fattore importante per facilitare l’elaborazione e la maturazione dei miRNA, portando anche alla generazione di isoforme di splicing alternative 6,8,9.
Molti microRNA (miRNA) sono codificati da sequenze introniche. Mentre alcuni fanno parte dell’introne, altri sono noti come “mirtron” e sono formati dall’intero introne10,11. I miRNA sono brevi RNA non codificanti, che vanno da 18 a 24 nucleotidi di lunghezza12. La loro sequenza matura mostra una complementarità parziale o totale con le sequenze bersaglio negli mRNA, influenzando quindi i tassi di traduzione e/o di decadimento dell’mRNA. Le combinazioni di miRNA e bersagli guidano la cellula verso risultati diversi. Diversi miRNA possono guidare le cellule verso fenotipi pro- o anti-tumorali13. I miRNA oncogeni di solito prendono di mira gli mRNA che innescano una caratteristica soppressiva, portando ad un aumento della proliferazione cellulare, della migrazione e dell’invasione14. D’altra parte, i miRNA soppressivi del tumore potrebbero colpire mRNA oncogeni o mRNA correlati all’aumento della proliferazione cellulare.
Anche l’elaborazione e la maturazione dei miRNA dipendono dalla loro origine. La maggior parte dei miRNA intronici vengono elaborati con la partecipazione del microprocessore, formato dalla ribonucleasi Drosha e dai cofattori proteici12. I mirtroni vengono elaborati con l’attività dello spliceosoma indipendentemente da Drosha15. Considerando l’alta frequenza di miRNA presenti all’interno degli introni, abbiamo ipotizzato che le proteine leganti l’RNA coinvolte nello splicing potrebbero anche facilitare l’elaborazione e la maturazione di questi miRNA. In particolare, l’hnRNP RBP A2/B1 è già stato associato al microprocessore e alla biogenesi16 del miRNA.
Abbiamo precedentemente riportato che diverse proteine leganti l’RNA, come hnRNPs e HuR, sono associate a miRNA intronici dalla spettrometria di massa17. L’associazione di HuR (ELAVL1) con i miRNA del cluster intronico miR-17-92 è stata confermata utilizzando l’immunoprecipitazione e l’analisi in silico 9. miR-17-92 è un cluster di miRNA intronico composto da sei miRNA con aumentata espressione in diversi tumori18,19. Questo cluster è anche noto come “oncomiR-1” ed è composto da miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b e miR-92 a. miR-19 a e miR-19b sono tra i miRNA più oncogeni di questo cluster 19. L’aumentata espressione di HuR stimola la sintesi di miR-19a e miR-19b 9. Poiché le regioni introniche che fiancheggiano questo cluster sono associate a HuR, abbiamo sviluppato un metodo per indagare se questa proteina potesse regolare l’espressione e la maturazione di miR-19a e miR-19b. Una previsione importante della nostra ipotesi era che, come proteina regolatrice, HuR potrebbe facilitare la biogenesi dei miRNA, portando ad alterazioni fenotipiche. Una possibilità era che i miRNA fossero processati dalla stimolazione di HuR ma non fossero maturi e funzionali e, quindi, gli effetti della proteina non avrebbero avuto un impatto diretto sul fenotipo. Pertanto, abbiamo sviluppato un saggio di splicing reporter per indagare se un RBP come HuR potrebbe influenzare la biogenesi e la maturazione di un miRNA intronico. Confermando l’elaborazione e la maturazione dei miRNA, il nostro test mostra l’interazione con la sequenza target e la generazione di un miRNA maturo e funzionale. Nel nostro test, abbiamo accoppiato l’espressione di un cluster di miRNA intronico con un plasmide di luciferasi per verificare il legame del bersaglio dei miRNA nelle cellule in coltura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo splicing pre-mRNA è un processo importante per la regolazione dell’espressione genica e il suo controllo può innescare forti effetti sulle modificazioni fenotipiche cellulari22,23. Più del 70% dei miRNA sono trascritti da introni nell’uomo, e abbiamo ipotizzato che la loro elaborazione e maturazione potrebbe essere facilitata dallo splicing delle proteine regolatrici24,25. Abbiamo sviluppato un meto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono grati a E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapore) per le cellule HeLa-Cre e i plasmidi pRD-RIPE e pCAGGS-Cre. Ringraziamo Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes e Anselmo Moriscot per il loro supporto.
Materials
| Recombinant DNA | |||
| pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pFLAG-HuR | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-RAP-IB | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-scrambled | Generated during this work | ||
| pRD-miR-17-92 | Generated during this work | ||
| pRD-RIPE-donor | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pTK-Renilla | Promega | E2241 | |
| Antibodies | |||
| anti-B-actin | Sigma Aldrich | A5316 | |
| anti-HuR | Cell Signaling | mAb 12582 | |
| IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG | Li-Cor Biosciences | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG | Li-Cor Biosciences | 929-70020 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HeLa-Cre | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| HeLa-Cre miR17-92 | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-scrambled | Generated during this work | ||
| Chemicals and Peptides | |||
| DMEM/high-glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800-017 | |
| Doxycycline | BioBasic | MB719150 | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | ER0271 | |
| EcoRV | Thermo Fisher Scientific | ER0301 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | E859-EG | |
| L-glutamine | Life Technologies | ||
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| pFLAG-CMV™-3 Expression Vector | Sigma Aldrich | E6783 | |
| pGEM-T | Promega | A3600 | |
| Platinum Taq DNA polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10966-030 | |
| pmiR-GLO | Promega | E1330 | |
| Puromycin | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNAse OUT | Thermo Fisher Scientific | 752899 | |
| SuperScript IV kit | Thermo Fisher Scientific | 18091050 | |
| Trizol-LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | |
| trypsin/EDTA 10X | Life Technologies | 15400-054 | |
| XbaI | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | |
| XhoI | Promega | R616A | |
| Oligonucleotides | |||
| forward RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT |
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| reverse RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
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| forward scrambled pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT |
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| reverse scrambled pmiRGLO | Exxtend | CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
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| forward HuR pFLAG | Exxtend | GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC |
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| reverse HuR pFLAG | Exxtend | GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG |
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| forward pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG |
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| reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG |
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| forward snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | CTCGCTTCGGCAGCACATATAC | |
| reverse snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG | |
| forward B-Actin qPCR | Exxtend | ACCTTCTACAATGAGCTGCG | |
| reverse B-Actin qPCR | Exxtend | CCTGGATAGCAACGTACATGG | |
| forward HuR qPCR | Exxtend | ATCCTCTGGCAGATGTTTGG | |
| reverse HuR qPCR | Exxtend | CATCGCGGCTTCTTCATAGT | |
| forward pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG |
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| reverse pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG |
|
| Software and Algorithms | |||
| Prism 8 for Mac OS X | Graphpad | https://www.graphpad.com | |
| ImageJ | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij |
References
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