哺乳類細胞におけるイントロニックマイクロRNA成熟を解析するためのレポーターアッセイ
Summary
イントロマイクロRNA生合成レポーターアッセイを開発し、イン ビトロ の細胞で、イントロニックmiRNAの1つ、ターゲットの1つ、調節タンパク質を過剰発現させるプラスミド、ウミシイタケの4種類のプラスミドを用いました。miRNAをプロセシングし、標的配列に結合することによってルシフェラーゼ発現を制御することができた。
Abstract
マイクロRNA(miRNA)は、真核生物に広く普及している短いRNA分子です。ほとんどのmiRNAはイントロンから転写され、その成熟には核内の異なるRNA結合タンパク質が含まれます。成熟したmiRNAはしばしば遺伝子サイレンシングを媒介し、これは転写後の事象を理解するための重要なツールとなっている。それに加えて、それは遺伝子治療のための有望な方法論として探求することができます。しかしながら、現在、哺乳動物細胞培養物におけるmiRNA発現を評価するための直接的な方法は存在しない。ここでは、標的配列との相互作用の確認を通じてmiRNAの生合成と成熟の決定に役立つ効率的で簡単な方法について説明します。また、このシステムは、一次miRNA(pri-miRNA)転写を高効率かつ低コストで制御することができるドキシサイクリン誘導性プロモーターを用いて、外因性miRNA成熟をその内因性活性から分離することを可能にする。このツールは、別のプラスミド中のRNA結合タンパク質による調節も可能にする。さまざまな異なるmiRNAおよびそれらのそれぞれの標的と共に使用することに加えて、トランスフェクションに順応性がある限り、異なる細胞株に適合させることができる。
Introduction
前駆体mRNAスプライシングは、真核生物1における遺伝子発現調節のための重要なプロセスである。成熟RNA中のイントロンの除去およびエクソンの結合は、スプライソソーム、5つのsnRNA(U1、U2、U4、U5、およびU6)と100以上のタンパク質2,3からなる2メガダルトンリボヌクレオタンパク質複合体によって触媒される。スプライシング反応は共転写的に起こり、スプライソソームは、エキソン-イントロン境界およびイントロン4内の保存されたスプライス部位の認識によって導かれて、各新しいイントロンで組み立てられる。異なるイントロンは、スプライソソーム複合体およびその成分の顕著な保存にもかかわらず、異なるスプライシング速度を有する可能性がある。スプライス部位保存の違いに加えて、イントロンおよびエキソンに分布する調節配列は、RNA結合タンパク質(RBP)を誘導し、スプライシングを刺激または抑制することができる5,6。HuRは遍在的に発現するRBPであり、mRNAの安定性を制御する重要な因子である7。我々のグループの以前の結果は、HuRがmiRNAを含むイントロンに結合することができることを示しており、このタンパク質がmiRNAのプロセシングおよび成熟を促進する重要な因子である可能性があり、また、選択的スプライシングアイソフォームの生成につながる可能性があることを示している6,8,9。
多くのマイクロRNA(miRNA)はイントロニック配列からコード化されている。いくつかはイントロンの一部ですが、他のものは「ミルトロン」として知られており、イントロン10,11全体によって形成されています。miRNAは短い非コードRNAであり、長さ12から18〜24ヌクレオチドの範囲である。それらの成熟配列は、mRNA中の標的配列と部分的または全体的な相補性を示し、したがって、翻訳および/またはmRNAの崩壊速度に影響を及ぼす。miRNAと標的の組み合わせは、細胞を異なる結果に駆り立てます。いくつかのmiRNAは、細胞をプロ腫瘍性または抗腫瘍性表現型に駆動することができる13。発癌性miRNAは通常、抑制特性を誘発するmRNAを標的とし、細胞増殖、遊走、および浸潤の増加をもたらす14。一方、腫瘍抑制性miRNAは、発癌性mRNAまたは細胞増殖の増加に関連するmRNAを標的とする可能性がある。
miRNAのプロセシングと成熟は、その起源にも依存します。ほとんどのイントロニックmiRNAは、リボヌクレアーゼDroshaおよびタンパク質補因子12によって形成されるマイクロプロセッサの関与により処理される。ミルトロンは、Drosha15とは無関係にスプライソソームの活性で処理される。イントロン内で見出されるmiRNAの頻度が高いことを考慮して、我々は、スプライシングに関与するRNA結合タンパク質もこれらのmiRNAの処理および成熟を促進する可能性があるという仮説を立てた。特に、RBP hnRNP A2/B1は、マイクロプロセッサおよびmiRNA生合成16と既に関連している。
我々は以前、質量分析によって、hnRNPやHuRなどのいくつかのRNA結合タンパク質がイントロニックmiRNAと関連していることを報告している17。miR-17-92イントロニッククラスターからのmiRNAとのHuR(ELAVL1)の関連は、免疫沈降およびインシリコ分析9を用いて確認された。miR-17-92は、異なる癌において発現が増加した6つのmiRNAからなるイントロニックmiRNAクラスターである18、19。このクラスターは「oncomiR-1」としても知られており、miR-17、miR-18 a、miR-19a、miR-20、miR-19 b、およびmiR-92 aから構成されており、miR-19 aおよびmiR-19bはこのクラスター19の中で最も発癌性の高いmiRNAの1つです。 HuRの発現増加は、miR-19aおよびmiR-19b合成を刺激する9。 このクラスターに隣接するイントロニック領域はHuRと関連していることから、このタンパク質がmiR-19aおよびmiR-19bの発現と成熟を調節できるかどうかを調べる方法を開発しました。我々の仮説の重要な予測の1つは、調節タンパク質として、HuRがmiRNAの生合成を促進し、表現型の変化をもたらす可能性があるということでした。1つの可能性は、miRNAはHuRの刺激によって処理されるが、成熟して機能的ではないため、タンパク質の効果が表現型に直接影響しないことであった。そこで、HuRなどのRBPがイントロニックmiRNAの生合成と成熟に影響を与えるかどうかを調べるスプライシングレポーターアッセイを開発しました。miRNAのプロセシングと成熟を確認することにより、私たちのアッセイは、標的配列との相互作用と成熟した機能的なmiRNAの生成を示しています。私たちのアッセイでは、イントロニックmiRNAクラスターの発現をルシフェラーゼプラスミドと結合させて、培養細胞におけるmiRNA標的結合をチェックします。
Protocol
Representative Results
Discussion
プレmRNAスプライシングは遺伝子発現調節のための重要なプロセスであり、その制御は細胞表現型改変に強い効果を引き起こす可能性がある22、23。miRNAの70%以上がヒトのイントロンから転写されており、我々は、調節タンパク質をスプライシングすることによって、それらのプロセシングと成熟を促進することができるという仮説を立てた<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、HeLa-Cre細胞およびpRD-RIPEおよびpCAGGS-Creプラスミドについて、E. Makeyev(シンガポール南洋理工大学)に感謝している。エドナ・キムラ、カロライナ・パーセル・ゴーズ、ヒセラ・ラモス、ルシア・ロセッティ・ロペス、アンセルモ・モリスコットのサポートに感謝します。
Materials
| Recombinant DNA | |||
| pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pFLAG-HuR | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-RAP-IB | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-scrambled | Generated during this work | ||
| pRD-miR-17-92 | Generated during this work | ||
| pRD-RIPE-donor | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pTK-Renilla | Promega | E2241 | |
| Antibodies | |||
| anti-B-actin | Sigma Aldrich | A5316 | |
| anti-HuR | Cell Signaling | mAb 12582 | |
| IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG | Li-Cor Biosciences | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG | Li-Cor Biosciences | 929-70020 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HeLa-Cre | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| HeLa-Cre miR17-92 | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-scrambled | Generated during this work | ||
| Chemicals and Peptides | |||
| DMEM/high-glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800-017 | |
| Doxycycline | BioBasic | MB719150 | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | ER0271 | |
| EcoRV | Thermo Fisher Scientific | ER0301 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | E859-EG | |
| L-glutamine | Life Technologies | ||
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| pFLAG-CMV™-3 Expression Vector | Sigma Aldrich | E6783 | |
| pGEM-T | Promega | A3600 | |
| Platinum Taq DNA polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10966-030 | |
| pmiR-GLO | Promega | E1330 | |
| Puromycin | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNAse OUT | Thermo Fisher Scientific | 752899 | |
| SuperScript IV kit | Thermo Fisher Scientific | 18091050 | |
| Trizol-LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | |
| trypsin/EDTA 10X | Life Technologies | 15400-054 | |
| XbaI | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | |
| XhoI | Promega | R616A | |
| Oligonucleotides | |||
| forward RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT |
|
| reverse RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
| forward scrambled pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT |
|
| reverse scrambled pmiRGLO | Exxtend | CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
| forward HuR pFLAG | Exxtend | GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC |
|
| reverse HuR pFLAG | Exxtend | GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG |
|
| forward pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG |
|
| reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG |
|
| forward snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | CTCGCTTCGGCAGCACATATAC | |
| reverse snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG | |
| forward B-Actin qPCR | Exxtend | ACCTTCTACAATGAGCTGCG | |
| reverse B-Actin qPCR | Exxtend | CCTGGATAGCAACGTACATGG | |
| forward HuR qPCR | Exxtend | ATCCTCTGGCAGATGTTTGG | |
| reverse HuR qPCR | Exxtend | CATCGCGGCTTCTTCATAGT | |
| forward pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG |
|
| reverse pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG |
|
| Software and Algorithms | |||
| Prism 8 for Mac OS X | Graphpad | https://www.graphpad.com | |
| ImageJ | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij |
References
- Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
- Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
- Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
- Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
- Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
- Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
- Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
- Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
- Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
- Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
- Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs – MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
- Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
- Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
- Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
- Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
- He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
- Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
- Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
- Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
- Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
- Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
- Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
- Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
- Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).
- Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
- Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).
