Transplantation de peau murine

Summary

La transplantation allogénique de la peau est un modèle standard d'analyse des réponses des cellules T à l'hôte antigènes du donneur MHC-disparates. Cette vidéo-article fournit un tutoriel visuelle de chaque étape à effectuer une greffe BALB/c--> C57BL / 6 peau.

Abstract

Comme l'un des modèles les plus strictes et moins difficile techniquement, la peau de transplantation est une méthode standard pour le dosage réponses de l'hôte de lymphocytes T aux antigènes MHC-donateurs disparates. Le but de cette vidéo article est de fournir au spectateur une démonstration étape par étape visuelle de la transplantation de peau en utilisant le modèle de la souris. Le protocole est divisé en cinq composantes principales: 1) la peau des donneurs de récolte; 2) la préparation de bénéficiaires pour la greffe; greffe de peau 3), 4) l'enlèvement bandage et le rejet du greffon suivi; 5) des conseils utiles. Une fois compétents, la procédure elle-même devrait prendre <10 min à effectuer.

Protocol

Avant le début de l'expérience:

• Obtenir l'approbation du IACUC
• Stériliser les instruments chirurgicaux et les Q-tips

Tissu I. Récolte des donateurs

1. Euthanasier souris donneuse (en conformité avec SOP institution)
2. Mouiller les cheveux en arrière de la base de l'oreille avec de l'alcool
3. La peau des bailleurs de fonds récolte en coupant l'oreille à l'arrêt de base
4. Placez le tissu de la plaque sur la glace
5. L'oreille Split: pincez côtés ventral et dorsal de tissu à la base de l'oreille avec le rat-dent de forceps; tirez doucement en dehors des tissus; tissus flottent dorsale, surface interne vers le bas, dans le PBS sur la glace; jetez collagènes rabat ventral

II. Préparer Récipiendaire d'une transplantation

1. La souris en utilisant une procédure approuvée Anesthetize
2. Administrer analgésique pour soulager la douleur post-opératoire (c.-à 0,05-0,1 mg / g ip Bupernex)
3. Placez la souris en position latérale
4. Effectuer pincement de l'orteil pour assurer des animaux est suffisamment sédation
5. Mouiller les cheveux avec de l'alcool et raser le thorax
6. Essuyez la zone propre avec tampon imbibé d'alcool

III. Greffe de peau

1. Faire une incision ~ 1 cm: la peau tente avec le rat-dent de pince et couper ~ 0.25 à 0,5 cm en dessous des pinces
2. Enlever la peau des bailleurs de fonds du CPE, place au sommet lit de greffe (avec une surface interne de la peau d'oreille face à lit de greffe), et enlever l'excédent avec du PBS stérile, Q-tip
3. Soigneusement rogner la peau donateurs excès de telle sorte que la transplantation est platement sein lit de greffe (en s'assurant que les bords du greffon ne sont pas courbés sous et que la corruption ne fait pas la gueule de bois sur la peau du tronc destinataire)
4. Bénéficiaires Envelopper dans un bandage stérile (avec le segment de gaze non-adhésif placé sur la greffe de peau)
5. S'assurer que le bandage est trop serré (évaluer la respiration des animaux) et que les armes sont librement mobiles
6. Bandage avec une seule suture de soie 2-0
7. Placer dans des animaux en cage propre (sous la lampe de chauffage jusqu'au animal a suffisamment récupéré de l'anesthésie)
8. Moniteur bénéficiaires 1-2/day les signes de détresse et d'administrer analgésique nécessaire pour soulager la douleur

IV. Retrait Bandage (6-7 jours post-transplantation)

1. La souris en utilisant une procédure approuvée Anesthetize
2. Couper et enlever suture de soie
3. Avec des ciseaux extrémité émoussée, soigneusement découpé par un bandage (en veillant à ne pas perturber la greffe) et retirez délicatement
4. Retour de la souris pour cage propre
5. Vérifiez greffe de ~ 8 heures après l'enlèvement bandage pour des signes de croûtes ou de contraction. S'il est présent, la greffe peut avoir omis de vasculariser et doit être considéré comme un échec technique.
6. Surveiller quotidiennement les signes de rejet (généralement définie comme une nécrose ~ 80% du tissu du donneur)
7. Greffes de peau allogénique seront généralement rejettent entre d8-12 post-op

Conseils utiles V.

1. Récolte tissu du donneur à proximité de la base de l'oreille va: 1) de maximiser la taille du greffon, et 2) fournir un surplomb inégale ventrale qui facilitera fractionnement
2. Toujours utiliser une lame de rasoir neuve pour le rasage bénéficiaires
3. Si antalgique doit être donnée ip, administrer la procédure avant la greffe afin de minimiser la manipulation post-op (minimiser les risques de perturber la greffe)
4. Si possible, enlever les gants avant d'appliquer le bandage. Gants tendance à coller le pansement et compliquent l'application
5. Placer une suture simple à la fin pansement sera de minimiser le retrait prématuré
6. Enveloppez un bandage aussi serré que permise et évaluer la respiration Avant de placer de suture. Si le bandage est trop serré, animal arrêter de respirer. Si le bandage est trop lâche, animal sera le retirer.

Discussion

Comme démontré dans cette vidéo l'article, le modèle de greffe de peau est une méthode rapide et facile pour le contrôle des lymphocytes T allogéniques réponses. La peau de transplantation allogénique a une large gamme d'applications et a été utilisée pour doser l'efficacité d'une variété d'agents immunosuppresseurs et les protocoles d'induction de tolérance, ainsi que pour étudier les effets biologiques des différents anticorps bloquants.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-dissecting forceps (curved)	Sigma-Aldrich	F4142
Rat-tooth forceps (1x2 teeth, straight)	Fine Science Tools	11053-10	n=2
Strabismus scissors (blunt end)	Fine Science Tools	14074-11
Iris forceps (curved)	Fine Science Tools	11065-07
Spring scissors (angled)	Fine Science Tools	15006-09
Halsey micro needle holder	Fine Science Tools	12500-12
10 cm plates	Corning	430167
PBS	Cellgro	21-040-CV
Bupernex (Buprenorphine hydrochloride)	Reckitt Benckiser	517201
Insulin syringes (29 Ga)	Monoject	8881 600145
Q-tips	Solon Manufacturing Company	362
Single edge razor blades (#9)	Smith & Nephew Inc.	67-0238
Silk suture (2-0; PS-2)	Ethicon Inc.	583H