Trapianto di pelle murina

Summary

Trapianto allogenico pelle è un modello standard per le risposte T test della cellula ospite per diversi antigeni MHC-donatore. Questo video-articolo fornisce un tutorial visivo di ogni passo coinvolti in esecuzione di un trapianto di BALB/c--> C57BL / 6 della pelle.

Abstract

Come uno dei modelli più rigorosi e meno tecnicamente impegnativo, il trapianto di pelle è un metodo standard per le risposte T test della cellula ospite per diversi antigeni MHC-donatore. Lo scopo di questo video-articolo è di fornire allo spettatore con uno step-by-step dimostrazione visiva del trapianto di cute utilizzando il modello murino. Il protocollo è suddiviso in 5 componenti principali: 1) donatore pelle raccolta; 2) la preparazione del destinatario per il trapianto; 3) trapianto di pelle, 4) la rimozione bendaggio e il rigetto del trapianto di monitoraggio; 5) utili suggerimenti. Una volta esperti, la stessa procedura dovrebbe prendere <10 minuti per eseguire.

Protocol

Prima dell'inizio della sperimentazione:

• Ottenere l'approvazione IACUC
• Sterilizzare strumenti chirurgici e Q-tips

I. Harvest tessuto del donatore

1. Euthanize topo donatore (in conformità con SOP dell'istituzione)
2. Capelli bagnati dalla base dell'orecchio con l'alcol
3. Harvest pelle donatore tagliando orecchio alla base
4. Tessuto posto in lamiera su ghiaccio
5. Orecchio Spalato: i lati pizzico ventrale e dorsale del tessuto alla base di orecchio con denti di topo forcipe; delicatamente separare tessuti; tessuto galleggiante dorsale, superficie interna verso il basso, in PBS su ghiaccio; scartare collagene lembo ventrale

II. Preparare destinatari per trapianti

1. Anestetizzare il mouse utilizzando la procedura approvata
2. Somministrare analgesici per il post-operatorio del dolore (cioè 0,05-0,1 mg / g ip Bupernex)
3. Del mouse posto in posizione laterale
4. Eseguire pizzico dito per assicurare animale è sufficientemente sedato
5. Capelli bagnati con l'alcol e la barba torace
6. Pulire zona pulita con tampone imbevuto di alcool

III. Trapianto di pelle

1. Fare ~ 1 incisione cm: pelle tenda con denti di topo pinze e tagliare ~ 0,25-0,5 cm sotto forcipe
2. Togliere la pelle del donatore da PBS, posto in cima a letto innesto (con superficie interna della pelle dell'orecchio di fronte letto innesto), e rimuovere l'eccesso con PBS sterile Q-tip
3. Rifilare con cura il via l'eccesso di pelle del donatore così che il trapianto è nettamente in letto innesto (assicurandosi che i bordi del trapianto non siano piegati sotto e che non sbornia innesto sulla pelle del tronco destinatario)
4. Destinatario avvolgere in bendaggio sterile (con la non-adesivo segmento garza posta sopra l'innesto di pelle)
5. Assicurarsi che bendaggio non troppo stretto (valutare la respirazione animale) e che le armi sono liberamente mobili
6. Bendaggio sicuro con un unico 2-0 di sutura di seta
7. Luogo animale in gabbia pulita (sotto la lampada di riscaldamento fino a animale ha sufficientemente recuperato da anestesia)
8. Monitor destinatario 1-2/day per i segni di disagio e, se necessario somministrare analgesici per alleviare il dolore

IV. Bendaggio di rimozione (6-7 giorni dopo il trapianto)

1. Anestetizzare il mouse utilizzando la procedura approvata
2. Tagliare e rimuovere sutura di seta
3. Utilizzando le forbici senza punta, con attenzione tagliare bendaggio (facendo attenzione a non disturbare innesto) e rimuovere delicatamente
4. Ritorna mouse per gabbia pulita
5. Controllare innesto ~ 8 ore dopo la rimozione del bendaggio per i segni di formazione di croste o di contrazione. Se presente, innesto potrebbe non essere riuscito a vascolarizzano e dovrebbe essere considerato un guasto tecnico.
6. Monitorare giorno per segni di rifiuto (di solito definito come necrosi ~ 80% del tessuto del donatore)
7. Trapianti di pelle allogenico di solito rifiutano tra D8-12 post-op

Suggerimenti utili V.

1. La raccolta dei tessuti del donatore vicino alla base dell'orecchio saranno: 1) massimizzare la dimensione dell'innesto, e 2) forniscono una sporgenza irregolare ventrale che faciliterà la suddivisione
2. Usare sempre una nuova lama di rasoio per radersi destinatario
3. Se analgesico deve essere dato ip, somministrare prima del trapianto procedura per ridurre al minimo la gestione post-op (ridurre al minimo la possibilità di interrompere il trapianto)
4. Se possibile, rimuovere i guanti prima di applicare la benda. Guanti tendono ad attaccare la benda e complicare l'applicazione
5. Esecuzione di una sutura singola, alla fine bendaggio minimizzare prematura rimozione
6. Avvolgere bendaggio stretto quanto consentito e valutare la respirazione Prima di immettere sutura. Se la fasciatura è troppo stretta, animale smettere di respirare. Se la fasciatura è troppo lenta, animale rimuoverlo.

Discussion

Come dimostrato in questo video-articolo, il modello di trapianto di pelle è un metodo rapido e semplice per monitorare le risposte delle cellule T allogeniche. Trapianto allogenico pelle ha una vasta gamma di applicazioni ed è stato utilizzato per il test di efficienza di una varietà di agenti immunosoppressivi e protocolli di induzione della tolleranza, come pure per studiare gli effetti biologici dei vari anticorpi di blocco.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-dissecting forceps (curved)	Sigma-Aldrich	F4142
Rat-tooth forceps (1x2 teeth, straight)	Fine Science Tools	11053-10	n=2
Strabismus scissors (blunt end)	Fine Science Tools	14074-11
Iris forceps (curved)	Fine Science Tools	11065-07
Spring scissors (angled)	Fine Science Tools	15006-09
Halsey micro needle holder	Fine Science Tools	12500-12
10 cm plates	Corning	430167
PBS	Cellgro	21-040-CV
Bupernex (Buprenorphine hydrochloride)	Reckitt Benckiser	517201
Insulin syringes (29 Ga)	Monoject	8881 600145
Q-tips	Solon Manufacturing Company	362
Single edge razor blades (#9)	Smith & Nephew Inc.	67-0238
Silk suture (2-0; PS-2)	Ethicon Inc.	583H