Summary
Il presente protocollo descrive gli strumenti per la manipolazione di microelettrodi intracorticali planari al silicio durante i trattamenti per la modifica della superficie tramite deposizione di gas e reazioni acquose della soluzione. L'assemblaggio dei componenti utilizzati per gestire i dispositivi durante la procedura è spiegato in dettaglio.
Abstract
I microelettrodi intracorticali hanno un grande potenziale terapeutico. Ma sono sfidati con una significativa riduzione delle prestazioni dopo periodi di impianto modesti. Un contributo sostanziale al declino osservato è il danno al tessuto neurale prossimale all'impianto e la successiva risposta neuroinfiammatoria. Gli sforzi per migliorare la longevità del dispositivo includono modifiche chimiche o applicazioni di rivestimento sulla superficie del dispositivo per migliorare la risposta del tessuto. Lo sviluppo di tali trattamenti superficiali è tipicamente completato utilizzando sonde "fittizie" non funzionali che mancano dei componenti elettrici necessari per l'applicazione prevista. La traduzione in dispositivi funzionali richiede un'ulteriore considerazione data la fragilità degli array di microelettrodi intracorticali. Gli strumenti di movimentazione facilitano notevolmente i trattamenti superficiali dei dispositivi assemblati, in particolare per le modifiche che richiedono lunghi tempi procedurali. Gli strumenti di manipolazione qui descritti sono utilizzati per i trattamenti superficiali applicati tramite deposizione in fase gassosa ed esposizione alla soluzione acquosa. La caratterizzazione del rivestimento viene eseguita utilizzando l'ellissometria e la spettroscopia fotoelettronica a raggi X. Un confronto delle registrazioni della spettroscopia di impedenza elettrica prima e dopo la procedura di rivestimento sui dispositivi funzionali ha confermato l'integrità del dispositivo dopo la modifica. Gli strumenti descritti possono essere facilmente adattati per dispositivi elettrodi alternativi e metodi di trattamento che mantengono la compatibilità chimica.
Introduction
I dispositivi neuroprotesici mirano a ripristinare le capacità sensoriali e motorie compromesse o assenti in una vasta gamma di popolazioni di pazienti, comprese quelle con lesioni del midollo spinale, sclerosi laterale amiotrofica (SLA), paralisi cerebrale e amputazioni 1,2,3. I microelettrodi intracorticali (IME) possono stabilire un percorso di comunicazione tra i neuroni corticali e i dispositivi utilizzati per controllare le neuroprotesi. Un netto vantaggio dei microelettrodi intracorticali è la loro capacità di registrare segnali neurali ad alta risoluzione spaziale e temporale, che è preferita per la successiva elaborazione del segnale e il controllo delle interfacce cervello-computer 4,5. Sfortunatamente, le prestazioni dei microelettrodi intracorticali si riducono drasticamente entro pochi mesi a un anno dopo l'impianto 2,6,7,8. La perdita di qualità e stabilità del segnale influisce negativamente sull'applicazione della tecnologia.
Un contributo significativo al declino delle prestazioni osservato è la risposta biotica al danno tissutale associato all'impianto e alla neuroinfiammazione cronica 9,10,11. L'impianto di IME infligge danni al tessuto cerebrale, con conseguente rilascio di molecole di segnalazione che avviano cascate di processi di difesa cellulare reazionari. L'interfacciamento cronico esacerba la risposta del corpo estraneo, portando a una neuroinfiammazione sostenuta che danneggia il tessuto prossimale al dispositivo; spesso riconosciuti come sintomi di neuroinfiammazione, cicatrici e neurodegenerazione locale che contribuiscono al declino della registrazione della qualità del segnale 12,13,14,15. Composto da un denso conglomerato di astrociti con microglia e macrofagi attivati trascinati, la cicatrice che incapsula l'elettrodo crea un ambiente locale sfavorevole con ridotto trasporto di materiale e accumulo locale di fattori infiammatori 16,15,16,17,18.
Molti studi hanno descritto la risposta del cervello ai microelettrodi intracorticali o approcci per mitigare la risposta7. La ricerca e lo sviluppo per migliorare la risposta dei tessuti hanno coinvolto una serie di strategie, tra cui modifiche alla struttura generale, alla topologia superficiale, ai materiali e all'applicazione dei rivestimenti. Questi sforzi intendono ridurre al minimo i danni subiti dall'evento di impianto, introdurre un'interfaccia più favorevole tra il dispositivo e le cellule prossimali o ridurre lo sforzo tissutale dopo che i dispositivi sono stati impiantati7. I metodi specificamente mirati alla risposta biologica cronica hanno portato a diversi rivestimenti bioattivi che mirano a stabilizzare il sito di impianto e promuovere chimicamente la salute delle cellule. Gli esempi includono polimeri conduttivi come il poli(etilene diossitiofene) (PEDOT)19,20, i nanotubi di carbonio21, gli idrogel22 e l'aggiunta di molecole e farmaci bioattivi per colpire specifici processi cellulari23,24,25. Il nostro gruppo di ricerca, in particolare, ha esplorato molti meccanismi per promuovere una riduzione della risposta infiammatoria ai microelettrodi impiantati tra cui, ma non solo, minimizzando il trauma associato all'impianto del dispositivo26, minimizzando il disallineamento della rigidità del dispositivo/tessuto 27,28,29,30,31,32,33, ottimizzando la sterilizzazione procedure 34,35, riduzione dello stress/danno ossidativo 28,36,37,38,39,40,41,42, esplorazione di materiali elettrodici alternativi43 e imitazione della nanoarchitettura della matrice extracellulare naturale 44,45,46 . Recente interesse è lo sviluppo di rivestimenti superficiali biomimetici per mitigare la risposta neuroinfiammatoria all'interfaccia tissutale microelettroda direttamente39.
La modifica dell'interfaccia offre il vantaggio unico di colpire direttamente la ferita e il tessuto prossimale necessario per la registrazione del segnale. Un trattamento superficiale che promuove la guarigione senza esacerbare la risposta immunitaria può beneficiare della durata della registrazione di qualità e rimuovere le limitazioni nella realizzazione del potenziale terapeutico e di ricerca dei microelettrodi intracorticali. Il lavoro presentato descrive i metodi per l'applicazione di trattamenti superficiali a array di microelettrodi che richiedono tempi di reazione prolungati pur adattandosi alla fragilità dei dispositivi. La tecnica presentata ha lo scopo di condividere i metodi di modifica della superficie con dispositivi funzionali in cui il dispositivo non può essere maneggiato durante l'applicazione del trattamento. Gli strumenti sono presentati per la gestione di sonde fittizie non funzionali e array di microelettrodi planari in silicio funzionale.
L'approccio presentato per modificare la superficie dell'elettrodo consente la sospensione sicura di sonde fittizie non funzionali o array di elettrodi planari funzionali in silicio per la deposizione e la reazione in fase gassosa con soluzioni acquose. Diversi pezzi stampati in 3D vengono utilizzati per gestire questi dispositivi fragili (Figura 1 e Figura 2). Viene fornito un esempio di una procedura che utilizza fasi di fase gassosa e soluzione per la modifica della superficie con un rivestimento antiossidante che comporta l'immobilizzazione di Mn(III)tetrakis (acido 4-benzoico) porfirina (MnTBAP). MnTBAP è una metalloporfirina sintetica che possiede proprietà antiossidanti con dimostrata mediazione dell'infiammazione47,48. L'esempio fornito sugli array di elettrodi planari funzionali al silicio convalida un aggiornamento di un protocollo precedentemente riportato per dispositivi non funzionali40. L'adattamento di una tecnica di deposizione in fase gassosa di Munief et al. supporta la compatibilità del protocollo con gli elettrodi funzionali49. La deposizione in fase gassosa viene utilizzata per funzionalizzare la superficie in preparazione della reazione acquosa che coinvolge la chimica del reticolante della carbodiimmide per immobilizzare il MnTBAP attivo. La metodologia di manipolazione sviluppata qui è fornita come una piattaforma che può essere modificata per ospitare altri rivestimenti e dispositivi simili.
Il protocollo illustra l'approccio utilizzando sonde fittizie non funzionali che comprendono un gambo di silicio e una linguetta stampata in 3D con dimensioni simili agli array di elettrodi planari funzionali in silicio. L'imballaggio del connettore del dispositivo è considerato analogo alla scheda stampata in 3D della sonda fittizia non funzionale nelle istruzioni fornite.
Figura 1: Pezzi stampati in 3D per la gestione di dispositivi funzionali durante la deposizione in fase gassosa in un essiccatore a vuoto. (A) La base della struttura include supporti per quadrati di silicio campione di 1 cm x 1 cm (freccia superiore) e fori per il fissaggio alla piastra dell'essiccatore (freccia inferiore). (B) La piastra è utilizzata per fissare la sospensione dei dispositivi. Da qui in poi, ogni pezzo in questa figura sarà indicato come pezzo 1A o 1B. Barra della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Pezzi stampati in 3D per la manipolazione di dispositivi funzionali per la reazione superficiale che si verifica nella soluzione acquosa. (A) Pezzo guida da incollare al coperchio della piastra di coltura. (B) Pezzi da banco utilizzati per stabilizzare i pezzi (C) e (D) durante l'assemblaggio. (C) e (D) fissano insieme la sospensione dei dispositivi per il posizionamento nella piastra del pozzo e (E) fissano ulteriormente i pezzi (C) e (D) al coperchio della piastra del pozzo. Da qui in poi, i singoli pezzi in ogni pannello di questa figura saranno indicati come numeri di pezzo corrispondenti al numero di pannello di questa figura. Barra della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
Tutti i file di codifica per la stampa 3D sono forniti in File di codifica supplementari 1-16. L'analisi fornita nei risultati rappresentativi è descritta utilizzando array di elettrodi planari funzionali in silicio acquisiti commercialmente (vedere Tabella dei materiali).
1. Assemblaggio di movimentazione per la deposizione in fase gassosa in un essiccatore sottovuoto
NOTA: L'apparecchio assemblato per la manipolazione e la tenuta dei dispositivi durante la deposizione in fase gassosa è mostrato nella Figura 3. I passaggi 1.1-1.8 descrivono la procedura necessaria per posizionare i dispositivi nell'apparecchio per la deposizione (figura 4A).
Figura 3: Assemblaggio di pezzi stampati in 3D per la gestione di dispositivi funzionali durante la deposizione in fase gassosa. L'assemblaggio è raffigurato senza campioni da rivestire. Viti e dadi alari vengono utilizzati per fissare insieme i pezzi 1A e 2B. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagine dell'assemblaggio e del posizionamento dei campioni da rivestire. Questo schema descrive la manipolazione di dispositivi funzionali durante la deposizione in fase gassosa assicurata all'interno di un essiccatore a vuoto. (A) Nastro biadesivo in poliimmide posto sul pezzo 1A e nastro di schiuma posto su 1B. (B) Dispositivi fissati su nastro. (C) Le viti e i dadi alari vengono utilizzati per fissare i pezzi da 1B a 1A e l'assemblaggio è fissato al vassoio dell'essiccatore utilizzando fascette per cavi con zip (frecce rosse). (D) I campioni quadrati di silicio di 1 cm x 1 cm sono collocati nei rispettivi supporti. (E) La pesata e il manometro in alluminio sono posizionati nell'essiccatore nell'orientamento mostrato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Per il trattamento superficiale, acquisire campioni quadrati di 1 cm x 1 cm del materiale del substrato dei dispositivi.
- Per i campioni di silicio (selezionati per questo protocollo), tagliare il wafer di silicio in quadrati di 1 cm x 1 cm utilizzando una cubettatrice per wafer (vedere Tabella dei materiali).
- Stampare o acquisire i pezzi 1A (Figura 1A, File di codifica supplementare 1, File di codifica supplementare 2) e 1B (Figura 1B, File di codifica supplementare 3, File di codifica supplementare 4).
- Attaccare il nastro biadesivo in poliimmide al pezzo 1A e fissare una striscia di schiuma spessa 1/8 "con adesivo unilaterale al pezzo 1B.
- Far aderire la confezione del connettore del dispositivo al nastro sul pezzo 1A.
NOTA: l'orientamento ideale del connettore sul nastro lascerà il gambo sospeso sopra il bordo, come illustrato nella Figura 4B. - Fissare insieme il pezzo 1A e il pezzo 1B (Figura 4C). Allineare i fori e fissarli con viti in acciaio inossidabile e dadi alari (vedere Tabella dei materiali).
- Utilizzando fascette lampo, fissate l'assieme al vassoio dell'essiccatore sottovuoto utilizzando i fori nella parte inferiore del pezzo 1A, come mostrato nella Figura 4C.
- Se applicabile, posizionare campioni di materiale quadrati nelle fessure nella parte inferiore del telaio (Figura 4D). Qui, i campioni di wafer di silicio quadrati di 1 cm x 1 cm vengono utilizzati come esempio.
NOTA: il materiale esatto dovrà corrispondere al substrato del dispositivo trattato, che varierà a seconda del dispositivo. - Completare la deposizione in fase gassosa posizionando la soluzione in un apposito recipiente all'interno dell'essiccatore sottovuoto opposto e in linea con l'assemblaggio fissato.
NOTA: Le piastre di pesatura in alluminio sono state utilizzate come recipienti per la deposizione (3-aminopropil) trietossisilano (APTES), come esempio qui.- Posizionare un vacuometro (vedere Tabella dei materiali) all'interno dell'essiccatore per registrare la pressione esatta. Posizionare la porta del coperchio dell'essiccatore vicino all'assieme fissato e in linea con la soluzione (Figura 4E).
NOTA: Ulteriori dettagli su questo metodo di deposizione in fase gassosa sono descritti in un riferimento49 precedentemente pubblicato.
- Posizionare un vacuometro (vedere Tabella dei materiali) all'interno dell'essiccatore per registrare la pressione esatta. Posizionare la porta del coperchio dell'essiccatore vicino all'assieme fissato e in linea con la soluzione (Figura 4E).
2. Assemblaggio di manipolazione per la reazione superficiale tramite soluzione acquosa
NOTA: I componenti e gli apparecchi assemblati per la manipolazione e la tenuta dei dispositivi durante la deposizione in fase acquosa e il trattamento superficiale sono illustrati nelle figure 5-7. I seguenti passaggi descriveranno in dettaglio la procedura necessaria per posizionare i dispositivi nell'apparecchio per la deposizione e il trattamento.
Figura 5: Assemblaggio di pezzi stampati in 3D per la manipolazione di dispositivi funzionali per la reazione superficiale che si verifica in soluzione acquosa. (A) Pezzo guida da incollare al coperchio della piastra di coltura. (B) Il pezzo da banco è stato utilizzato per stabilizzare i pezzi (C) e (D) durante l'assemblaggio. C) e D) fissare insieme la sospensione dei dispositivi per il posizionamento nella piastra del pozzo. (E) fissa ulteriormente i pezzi (C) e (D) al coperchio della piastra del pozzo. Il nastro biadesivo in poliimmide è stato posizionato sulla parte inferiore di (C) e il nastro di schiuma è stato posizionato sulla parte inferiore di (D) (entrambi inscatolati in rosso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Coperchio della piastra di coltura cellulare costruito con 6 guide (pezzo 2A). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Sequenza per il fissaggio e il caricamento delle sonde per la reazione della soluzione. Il colore delle parti è stato modificato in questa figura per chiarezza all'interno dell'immagine. Si tratta delle stesse parti della Figura 5 e della Figura 6. (A) Il pezzo 2C viene inserito nel pezzo 2B e il dispositivo è fissato alla parte nastrata di 2C. (B) Il pezzo 2D si inserisce nel pezzo 2C per creare un assieme che sospende il gambo del dispositivo. (C) L'assemblaggio di 2C, 2D e il dispositivo sono accuratamente posizionati sul coperchio della piastra del pozzo utilizzando la guida. (D) Il pezzo 2E si inserisce nella parte superiore dell'assieme per fissare ulteriormente il coperchio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Costruire un coperchio per la piastra del pozzo per sospendere l'array di elettrodi del dispositivo in soluzione (Figura 6). Questo protocollo descrive l'uso di una piastra a 24 pozzetti.
- Tagliare fori rettangolari di 19 mm x 10,5 mm nel coperchio della piastra del pozzo utilizzando una taglierina laser o manualmente con una taglierina. Abbinare il numero di fori al numero di dispositivi desiderati per il trattamento.
NOTA: per facilitare il montaggio, si consiglia di trattare sei dispositivi per piastra di pozzo o, come minimo, di posizionare fori su pozzi non adiacenti (Figura 6). - Stampare o acquisire il numero appropriato di guide (pezzo 2A (Figura 2A), file di codifica supplementare 5, file di codifica supplementare 6).
- Utilizzare adesivo cianoacrilato per fissare le guide al coperchio. Allineare i fori rettangolari nelle guide e nei coperchi durante l'incollaggio per garantire che il foro rettangolare della guida non sia ostruito, come illustrato nella Figura 6.
- Tagliare fori rettangolari di 19 mm x 10,5 mm nel coperchio della piastra del pozzo utilizzando una taglierina laser o manualmente con una taglierina. Abbinare il numero di fori al numero di dispositivi desiderati per il trattamento.
- Riempire la piastra del pozzo con la soluzione desiderata nei punti in cui si verificherà il trattamento. Ad esempio, la soluzione comprende EDC e Sulfo-NHS (vedi Tabella dei materiali) nel buffer MES.
NOTA: il volume della soluzione dipenderà dalle dimensioni del dispositivo elettrodo. Per gli array di microelettrodi in stile Michigan (vedere Tabella dei materiali) con connettori a basso profilo di 8,6 mm e lunghezza del gambo di 3 mm, c'è una distanza di ~ 9 mm50. L'utilizzo di 2 mL di soluzione consentirà di immergere completamente il gambo del dispositivo mantenendo il resto del dispositivo fuori dalla soluzione di reazione.- Se vengono utilizzati campioni di substrato per confermare il trattamento superficiale, posizionare campioni di materiale quadrato in un pozzetto della piastra e immergerli nella soluzione di reazione.
- Sospendere saldamente i dispositivi (vedere Tabella dei materiali) in una piastra del pozzo. La sequenza è illustrata nella Figura 7.
- Nastro 2B (Figura 2B, File di codifica supplementare 7, File di codifica supplementare 8) a un piano di lavoro (Figura 7A).
- Posizionare del nastro biadesivo in poliimmide per coprire la base del pezzo 2C (Figura 2C, File di codifica supplementare 9, File di codifica supplementare 10).
- Posizionare un nastro in schiuma da 1/8" con adesivo monolaterale per coprire la base del pezzo 2D (Figura 2D, File di codifica supplementare 11, File di codifica supplementare 12).
- Inserire il pezzo 2C nella scanalatura del pezzo 2B (Figura 7A).
- Far aderire la confezione del connettore del dispositivo sul nastro, orientato, in modo che la lunghezza del gambo del dispositivo sia sospesa (Figura 7B).
- Fissare il dispositivo facendo scorrere il pezzo 2D (mostrato in arancione nella Figura 7) nel pezzo 2C. Questo assieme fissa efficacemente il dispositivo tra i pezzi dell'utensile (Figura 7B).
- Tenendo i bordi dell'assieme, sollevare con attenzione per rimuovere dal pezzo 2A.
- Inserire l'assieme nel coperchio allineando i semicerchi rivolti verso l'esterno sui pezzi 2C e 2D con le guide corrispondenti sul pezzo 2A (mostrate in verde nella Figura 7C).
- Posizionamento sicuro dell'assemblaggio mediante raccordo a pressione del pezzo 2E (Figura 2E) sopra le guide (mostrato in verde nella Figura 7D, File di codifica supplementare 13, File di codifica supplementare 14).
- Per le reazioni che beneficiano della miscelazione continua della soluzione, agitare la piastra del pozzo. Trasferire la piastra del pozzo assemblata su una tavola scuotitrice e funzionare a velocità inferiori a 100 giri / min.
- Se si desiderano più reazioni basate sulla soluzione o fasi di lavaggio, trasferire con attenzione il coperchio in una nuova piastra del pozzo con la soluzione o le soluzioni desiderate distribuite nei pozzetti appropriati.
NOTA: il passaggio 2.4 è facoltativo. - Rimuovere i dispositivi dalla piastra del pozzo.
- Nastro pezzo 2B a un banco.
- Rimuovere il pezzo 2E dal coperchio.
- Rimuovere con attenzione il gruppo che tiene il dispositivo dalla piastra del pozzo.
- Orientate l'assieme, in modo che il pezzo 2C sia rivolto verso il piano di lavoro e il pezzo 2D sia rivolto verso l'alto. Il gambo del dispositivo deve essere parallelo al piano di lavoro. Montare il pezzo 2C dell'assieme nel pezzo 2B come è stato completato in precedenza (punto 2.3.4) durante il montaggio dell'assieme.
- Separare il pezzo 2D dal pezzo 2C separandoli con cura. Applicare una leggera pressione sulle linguette del pezzo 2C nel banco per fornire stabilità per questo compito.
NOTA: le schede di 2C sono più lunghe di quelle di 2D per facilitare questa gestione. - Utilizzare una pinza per tenere la confezione del connettore del dispositivo da rimuovere dal nastro e trasferire il dispositivo nel contenitore di archiviazione desiderato.
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Representative Results
Per dimostrare l'uso dei componenti di manipolazione, è stata implementata la metodologia descritta per adattare l'immobilizzazione di un mediatore ossidante al silicio attivato. L'applicazione di questa chimica agli IME per ridurre lo stress ossidativo è stata ideata da Potter-Baker et al. e dimostrata su sonde fittizie al silicio non funzionali40. Questo trattamento superficiale immobilizza l'antiossidante, MnTBAP, sulla superficie di silicio attivato UV / ozono tramite funzionalizzazione amminica seguita da chimica di reticolazione carbodiimide51. La funzionalizzazione delle ammine è completata tramite deposizione in fase gassosa e la chimica della reticolazione della carbodiimide tramite reazione acquosa. Questi esperimenti sono stati condotti utilizzando array di microelettrodi in stile Michigan disponibili in commercio e campioni quadrati di silicio per consentire l'analisi dei materiali del metodo di rivestimento (vedi Tabella dei materiali).
In primo luogo, la funzionalizzazione delle ammine è stata eseguita utilizzando l'aminosilano, (3-aminopropil) trietossisilano (APTES). La deposizione in fase gassosa di APTES ha impiegato un adattamento dei metodi descritti da Munief et al.49. I dispositivi sono stati sospesi in modo sicuro utilizzando gli strumenti stampati in 3D seguendo il protocollo di gestione descritto per il trattamento in fase gassosa. Successivamente, 400 μL di APTES liquido sono stati collocati in un piatto di alluminio all'interno dell'essiccatore sottovuoto. Il coperchio dell'essiccatore è stato posizionato e il vuoto è stato tirato a ~ 25 psi per 20 minuti. Dopo 20 minuti, il vuoto è stato rilasciato. Un fresco 400 μL di APTES liquido è stato inserito in una nuova parabola di alluminio. Il vuoto è stato tirato di nuovo a ~ 25 psi per altri 20 minuti. Dopo 20 minuti, l'APTES è stato aggiornato una seconda volta e il vuoto è stato mantenuto a ~ 25 psi per 24 ore52. Dopo la funzionalizzazione delle ammine, la chimica della reticolazione della carbodiimide è stata utilizzata per immobilizzare MnTBAP. La procedura standard che utilizza 1-[3-(Dimetilammino)propil]-3-etilcarbodiimide metioduro (EDC) e N-Idrossisulfosuccinimide sale sodico (Sulfo-NHS) in tampone di acido 2-(N-Morfolino)etansolfonico (MES) è stata impiegata come descritto in precedenza40. Gli strumenti stampati in 3D hanno sospeso i dispositivi in pozzi contenenti la soluzione di reazione.
A seguito del completamento delle reazioni di funzionalizzazione, è stata eseguita l'ellissometria e la spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) per confermare la presenza di APTES (fase 1) e MnTBAP (fase 2), rispettivamente. Quadrati di silicio 1 cm x 1 cm sono stati utilizzati per analizzare ogni fase del processo di rivestimento per convalidare la deposizione APTES di successo e l'immobilizzazione MnTBAP. Le misurazioni ellissometriche prese dal centro di 12 campioni di silicio hanno prodotto uno spessore medio dello strato APTES di 8,5 ± 1,02 Å, rispetto allo spessore teorico del monostrato di 7 Å. I risultati di XPS sono forniti nella Tabella 1. A seguito del trattamento APTES in fase gassosa, si ha un aumento della percentuale delle concentrazioni atomiche di azoto e carbonio, indicativo del deposito chimico. Dopo il processo di immobilizzazione della fase di soluzione, questi risultati dimostrano la presenza di manganese, l'elemento che contribuisce all'attività di MnTBAP, che non era rilevabile prima dell'immobilizzazione in fase di soluzione.
| Modifica | C (%) | N (%) | O (%) | Si (%) | Mn (%) | ||
| Si trattato al plasma | 3.06 | 0.5 | 49.84 | 46.605 | 0 | ||
| APTES deposizione in fase gassosa | 13.63 | 3.2 | 43.98 | 39.2 | 0 | ||
| MnTBAP immobilizzato | 44.16 ± 3.94 | 5,33 ± 0,37 | 21.81 ± 1.30 | 21.81 ± 2.39 | 0.79 ± 0.07 | ||
Tabella 1: Analisi XPS per modifiche sequenziali al silicio. I valori forniti per la fase di immobilizzazione MnTBAP sono presentati con una deviazione standard per una dimensione del campione di 4.
La funzionalità degli array di microelettrodi in stile Michigan dopo i processi di rivestimento è stata valutata utilizzando la spettroscopia di impedenza elettrica (EIS)50. L'EIS è stato registrato per 20 canali microelettrodi totali su due dispositivi. I canali inclusi per il test sono stati selezionati in modo casuale e distribuiti uniformemente tra i due dispositivi (10 canali / dispositivo). Le misurazioni sono state effettuate utilizzando un potenziostato con una configurazione a tre elettrodi. Le misurazioni sono state completate per ciascun canale tre volte prima del processo di rivestimento e tre volte dopo il processo di rivestimento. La magnitudine dell'impedenza a 1 kHz era di 238 ± 10,22 kΩ e 237 ± 9,81 kΩ prima e dopo il processo di rivestimento, rispettivamente. È stato selezionato un t-test a coppie per determinare se il processo di rivestimento ha influenzato l'impedenza del canale53. Le misurazioni dell'impedenza del dispositivo presentano una varianza significativa; pertanto, un'analisi a livello del dispositivo può perdere un effetto del rivestimento all'interno del rumore della variabilità di fabbricazione. Un test a coppie t tra le grandezze di impedenza dei canali a 1 kHz prima e dopo il processo di rivestimento non ha indicato alcuna differenza statistica (p > 0,937). Il diagramma del corpo di un dispositivo testato è fornito nella Figura 8, che mostra i risultati delle registrazioni a 10 canali prima e dopo il trattamento. Le immagini dell'array di elettrodi prima e dopo il processo di rivestimento sono fornite nella Figura 9. Ulteriori informazioni sui dettagli strumentali per le analisi dei materiali sono disponibili nel file supplementare 1.
Figura 8: Diagramma del corpo che mostra le misurazioni medie dell'impedenza elettrochimica su un dispositivo testato (10 canali) prima (grigio) e dopo (rosso) la procedura di rivestimento. Le barre rappresentano l'errore standard della media. L'entità dell'impedenza diminuiva con l'aumentare della frequenza. L'angolo di fase diminuiva con l'aumentare della frequenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Immagini dell'array di elettrodi prima (in alto) e dopo (in basso) il processo di rivestimento. Barra della scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File integrativo 1: Dettagli strumentali per l'analisi dei materiali. Fare clic qui per scaricare questo file.
File di codifica supplementari 1-16: Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il protocollo descritto è stato progettato per il trattamento superficiale di array di microelettrodi planari al silicio. Gli strumenti stampati in 3D sono personalizzati per array di microelettrodi in stile Michigan con connettori a basso profilo50. Le sonde non funzionali sono state assemblate aderendo una sonda di silicio a schede stampate in 3D utilizzando un adesivo biocompatibile. Le schede stampate in 3D sono state progettate con dimensioni simili ai connettori incorporati nei dispositivi disponibili in commercio utilizzati. I file per le schede stampate in 3D sono disponibili come File di codifica supplementare 15, File di codifica supplementare 16. Il filamento acrilonitrile butadiene stirene (ABS) è stato utilizzato per costruire i pezzi stampati in 3D. Se lo si desidera, il filamento di acido polilattico (PLA) può anche essere utilizzato per costruire gli strumenti. Una piastra a 24 pozzetti è stata utilizzata per la reazione superficiale con la soluzione acquosa con una profondità del pozzo di 17,4 mm. Quando si adatta il protocollo a dispositivi alternativi, è necessario considerare il tipo di elettrodo (dimensioni del connettore, lunghezza del gambo), la risoluzione della stampante 3D utilizzata e la compatibilità chimica del filamento.
Le tecniche standard per analizzare i trattamenti superficiali sono impossibili da eseguire su dispositivi assemblati a causa delle dimensioni dei test e/o della natura distruttiva. Per ottenere rappresentazioni del trattamento superficiale su array di microelettrodi planari al silicio, è possibile trattare campioni di silicio di grado dispositivo insieme a dispositivi funzionali per analisi successive. Se viene utilizzato un dispositivo diverso, il materiale campione deve corrispondere a quello del substrato del dispositivo. Sebbene indiretto, questo metodo consente controlli di qualità tra i trattamenti batch. Lo strumento stampato in 3D per la deposizione in fase gassosa include funzionalità che ospitano campioni quadrati per garantire condizioni di deposizione superficiale sufficienti. Le caratteristiche che contengono i campioni quadrati hanno una fessura di 1 mm per inserire i campioni. I campioni di silicio utilizzati nel lavoro presentato hanno uno spessore di 525 μm. Se si desidera un materiale campione alternativo e ha uno spessore superiore a 1 mm, è necessario apportare modifiche ai file forniti. La Figura 1 illustra i componenti dell'assieme per la deposizione in fase gassosa. La Figura 2 mostra i componenti dell'assieme per la reazione della soluzione acquosa in una piastra a 24 pozzetti.
L'adattamento del metodo di immobilizzazione di MnTBAP descritto da Potter-Baker et al. è stato utilizzato per dimostrare l'utilità degli strumenti presentati40. Questi esperimenti sono stati completati utilizzando array di microelettrodi in stile Michigan disponibili in commercio e campioni quadrati di silicio per consentire l'analisi dei materiali del metodo di rivestimento. Per confermare la presenza di APTES, l'ellissometria e la spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) sono state eseguite sui campioni quadrati di silicio. Le misurazioni ellissometriche hanno dimostrato un aumento dello spessore del campione corrispondente al deposito APTES previsto. L'analisi XPS condotta sui campioni ha mostrato un aumento della percentuale delle concentrazioni atomiche di azoto e carbonio, indicativo del deposito APTES. L'analisi XPS ha dimostrato un'assenza di manganese prima del processo di immobilizzazione della fase di soluzione, seguita dalla presenza di manganese. Questi dati insieme sono stati presi come giustificazione dell'esistenza del rivestimento. In questa fase, i dispositivi sono pronti per i test in vitro e in vivo. Ad esempio, possono essere condotti esperimenti in vivo che impiantano i dispositivi nei roditori per consentire l'analisi di registrazione e la colorazione immunoistochimica per determinare l'effetto del rivestimento sulle prestazioni del dispositivo36,40.
Migliorare le prestazioni in vivo del microelettrodo intracorticale è necessario affinché la tecnologia progredisca nell'uso clinico. Gli sforzi di ricerca in corso mirano a chiarire e alleviare i processi alla base del guasto del dispositivo54. Un'area sostanziale di questa ricerca è finalizzata alla mitigazione della risposta del tessuto deleterio all'impianto cronico del dispositivo 7,55,56,57. Concentrarsi sull'interfaccia tra il dispositivo e il tessuto consente un trattamento mirato del tessuto interessato58,59. Diverse modifiche superficiali ai microelettrodi intracorticali hanno e continuano ad essere esplorate 60,61,62,63.
La procedura presentata offre metodi per l'applicazione di trattamenti superficiali che comportano la deposizione in fase gassosa e la reazione acquosa della soluzione ai dispositivi assemblati. Nello sviluppo dei trattamenti superficiali, la traduzione in dispositivi funzionali pone diversi problemi di manipolazione64. Considerando la fragilità e la spesa degli array di microelettrodi funzionali, gli strumenti presentati facilitano notevolmente il mantenimento dell'integrità del dispositivo durante i trattamenti6. I metodi di gestione sicuri sono rilevanti nelle procedure di modifica che si verificano per periodi prolungati e includono più passaggi. La funzionalizzazione delle superfici che coinvolgono depositi di film e immobilizzazione delle molecole può includere diversi cicli di processi con un tempo totale di incubazione superiore a più ore 23,24,40,60. I metodi per la gestione di array di microelettrodi funzionali devono ancora essere riportati in dettaglio. La relazione presentata intende divulgare in dettaglio un metodo di gestione.
Gli sforzi di ricerca per migliorare le prestazioni degli array di microelettrodi intracorticali attraverso lo sviluppo di trattamenti superficiali e rivestimenti possono trarre beneficio dall'applicazione sicura dei trattamenti utilizzando questi strumenti. Sebbene progettati per il trattamento superficiale di dispositivi planari al silicio modellati per gli array di microelettrodi in stile Michigan descritti, i file sono disponibili per adattare i pezzi stampati in 3D per dispositivi alternativi. Quando si effettuano le regolazioni, considerare le dimensioni del dispositivo, la risoluzione della stampante 3D utilizzata e la compatibilità chimica.
Le limitazioni all'approccio dettagliato devono essere affrontate quando si determina il metodo più appropriato per qualsiasi protocollo di modifica della superficie personalizzato. I pezzi stampati in 3D sono personalizzati e richiedono tempo e accesso per essere realizzati. Inoltre, i pezzi sono stati progettati per uno stile particolare dell'array di microelettrodi. Pertanto, saranno necessarie regolazioni ai pezzi stampati in 3D per ospitare dispositivi alternativi e la corrispondente confezione del connettore. Infine, i protocolli qui descritti non sono stati valutati per la compatibilità con vari contatti metallici o polimeri conduttori a base organica rilevanti per altri progetti di dispositivi. Per garantire l'assoluta integrità del dispositivo e la sicurezza dei ricercatori, devono essere presi in considerazione i reagenti utilizzati per la chimica di reazione.
In sintesi, è stato presentato un protocollo robusto che consente modifiche superficiali agli elettrodi neurali funzionali riducendo al minimo il rischio di compromettere l'integrità del dispositivo. La metodologia può fungere da piattaforma per ulteriori modifiche di classi di dispositivi simili o alternative.
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Disclosures
I contenuti non rappresentano le opinioni del Dipartimento degli Affari dei Veterani degli Stati Uniti, del National Institutes of Health o del Governo degli Stati Uniti.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato in parte dal Merit Review Award IRX002611 (Capadona) e dal Research Career Scientist Award IK6RX003077 (Capadona) del Dipartimento degli Affari dei Veterani degli Stati Uniti (USA) Rehabilitation Research and Development Service. Inoltre, questo lavoro è stato supportato in parte anche dal National Institute of Health, dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke R01NS110823 (Capadona / Pancrazio) e dal National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (Krebs).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide methiodide (EDC) | Sigma-Aldrich | 165344-1G | Solid, stored desiccated at -20 °C |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 18 Pound Solid Nylon Cable/Zip Ties | Cole-Parmer | EW-06830-66 | Length 4 inches |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | 4432-31-9 | Solid |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140-100ML | Liquid, container with Sure/Seal |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-103 | |
| Aluminum weighing dishes | Fisher Scientific | 08-732-102 | Diameter 66 mm |
| Bel-Art Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15B | |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Millipore Sigma | CLS3527-100EA | 24-well plate, polystyrene |
| Cyanoacrylate Adhesive | LocTite | N/A | |
| Digital Microscope | Keyence | VHX-S750E | |
| Disco DAD3350 Dicing Saw | Disco | DAD3350 | Used to cut silicon wafer into 1 cm x 1 cm samples |
| Double-Sided Polyimide Tape | Kapton Tape | PPTDE-1/4 | ¼” x 36 yds. |
| EP21LVMed – low viscosity, two component epoxy compound | Masterbond | EP21LVMed | Meets USP Class VI certification, Passes ISO 10993-5 for cytotoxicity |
| Epilog Fusion Pro 48 Laser Machine | Epilog | N/A | CO2 laser |
| Foam tape | XFasten | N/A | 1/8" Thick |
| Gamry Interface 1010E Potentiostat | Gamry | 992-00129 | |
| High precision 45° curved tapered very fine point tweezers/forceps | Fisher Scientific | 12-000-131 | |
| Lab tape | Fisher Scientific | 15-901-10L | |
| Mn(III)tetrakis (4-benzoic acid) porphyrin (MnTBAP) | EMD Millipore | 475870-25MG | Solid, stored at -20 °C |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | 56485-250MG | Solid, stored desiccated at 4°C |
| Platinum clad niobium mesh anode | Technic | N/A | Clad with 125μ” of platinum on one side, framed in titanium with (1) 1” x 6” titanium strap centered on one 6” dimension |
| Silicon Planar Microelectrode Array, 16 Channel | NeuroNexus | A1x16-3mm-100-177-CM16LP | Electrode site material is iridium, shank thickness is 15 μm |
| Silicon Wafer | University Wafer | 1575 | Diameter 100 mm, p-type, boron-doped, 100 oriented, resistivity 0.01-0.02 Ohm-cm, thickness 525 um, single side polished, prime grade |
| Silver/silver Chloride reference electrode | Gamry Instruments | 930-00015 | |
| Solidworks | N/A | ||
| Stainless Steel Phillips Flat Head Screws | McMaster Carr | 96877A629 | #8-32, 1 1/2", fully threaded |
| Type I deionized water | ChemWorld | CW-DI1-20 | |
| Ultimaker 3 3D printer | Ultimaker | N/A | |
| Ultimaker Cura | Ultimaker | N/A | 3D printing software |
| Ultimaker NFC ABS Filament | Dynamism, Inc. | 1621 | 2.85 mm |
| Ultimaker NFC PLA Filament | Dynamism, Inc. | 1609 | 2.85 mm |
| Vacuum Gauge Vacuum Gauge | Measureman Direct | N/A | Glycerin Filled, 2-1/2” Dial Size, ¼”NPT, -30” Hg/-100kpa-0 |
| Wing nuts | Everbilt | 934917 | #8-32, zinc plated |
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