Summary
O presente protocolo descreve ferramentas para o manuseio de microeletroletos intracorticais planar de silício durante os tratamentos para modificação superficial via deposição de gás e reações de soluções aquosas. A montagem dos componentes utilizados para manusear os dispositivos durante todo o procedimento é explicada detalhadamente.
Abstract
Microeletrões intracorticais possuem grande potencial terapêutico. Mas eles são desafiados com redução significativa de desempenho após modestas durações de implantação. Um contribuinte substancial para o declínio observado é o dano ao tecido neural proximal ao implante e resposta neuroinflamatória subsequente. Os esforços para melhorar a longevidade do dispositivo incluem modificações químicas ou aplicações de revestimento na superfície do dispositivo para melhorar a resposta do tecido. O desenvolvimento desses tratamentos superficiais é tipicamente concluído usando sondas "manequim" não funcionais que não possuem os componentes elétricos necessários para a aplicação pretendida. A tradução para dispositivos funcionais requer consideração adicional dada a fragilidade dos arrays de microeletrodos intracorticais. Ferramentas de manuseio facilitam muito os tratamentos superficiais para dispositivos montados, particularmente para modificações que requerem longos tempos processuais. As ferramentas de manuseio descritas aqui são utilizadas para tratamentos superficiais aplicados via deposição em fase de gás e exposição aquosa de soluções. A caracterização do revestimento é realizada utilizando elipsometry e espectroscopia de fotoeletrões de raios-X. Uma comparação das gravações de espectroscopia de impedância elétrica antes e depois do procedimento de revestimento em dispositivos funcionais confirmou a integridade do dispositivo após a modificação. As ferramentas descritas podem ser prontamente adaptadas para dispositivos eletrodos alternativos e métodos de tratamento que mantenham a compatibilidade química.
Introduction
Os dispositivos neuroprostéticos visam restaurar as habilidades sensoriais e motoras prejudicadas ou ausentes em uma ampla gama de populações de pacientes, incluindo aqueles com lesão medular, Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), paralisia cerebral e amputações 1,2,3. Microeletrodes intracorticais (IMEs) podem estabelecer uma via de comunicação entre neurônios corticais e os dispositivos usados para controlar a neuroprótese. Uma vantagem distinta dos microeletrodos intracorticais é sua capacidade de registrar sinais neurais na alta resolução espacial e temporal, que é preferida para processamento e controle subsequente de sinais de interfaces cérebro-computador 4,5. Infelizmente, o desempenho das microeletragens intracorticais reduz drasticamente em meses para um ano após a implantação 2,6,7,8. A perda de qualidade e estabilidade do sinal afeta negativamente a aplicação da tecnologia.
Um contribuinte significativo para o declínio de desempenho observado é a resposta biótica aos danos teciduais associados à implantação e à neuroinflamação crônica 9,10,11. A implantação de IMEs inflige danos no tecido cerebral, resultando na liberação de moléculas de sinalização que iniciam cascatas de processos reacionários de defesa celular. O interligamento crônico exacerba a resposta do corpo estranho, levando à neuroinflamação sustentada que danifica o tecido proximal ao dispositivo; muitas vezes reconhecidos como sintomas de neuroinflamação, cicatrizes e neurodegeneração local contribuindo para o declínio do registro da qualidade do sinal 12,13,14,15. Compreendendo um denso conglomerado de astrócitos com microglia ativada e macrófagos, a cicatriz que encapsula o eletrodo cria um ambiente local desfavorável com redução do transporte material e acúmulo local de fatores inflamatórios 16,15,16,17,18.
Muitos estudos descreveram a resposta do cérebro a microeletrodos intracorticais ou abordagens para mitigar a resposta7. A pesquisa e o desenvolvimento para melhorar a resposta tecidual envolveram uma série de estratégias, incluindo modificações na estrutura geral, topologia superficial, materiais e aplicação de revestimentos. Esses esforços visam minimizar os danos sofridos a partir do evento de implantação, introduzir uma interface mais favorável entre o dispositivo e as células proximais, ou reduzir a tensão tecidual após o implantedos dispositivos 7. Métodos especificamente voltados para a resposta biológica crônica levaram a vários revestimentos bioativos que visam estabilizar o local de implantação e promover quimicamente a saúde celular. Exemplos incluem polímeros condutores como poli (etileno dioxythiophene) (PEDOT)19,20, nanotubosde carbono 21, hidrogéis22 e a adição de moléculas bioativas e drogas para atingir processos celulares específicos 23,24,25. Nosso grupo de pesquisa, em particular, explorou muitos mecanismos para promover a redução da resposta inflamatória aos microeletrodos implantados, incluindo, mas não se limitando a, minimizar o trauma associado à implantação do dispositivo26, minimizando a incompatibilidade de dispositivo/rigidez tecidual 27,28,29,30,31,32, otimizando a esterilização procedimentos34,35, reduzindo o estresse/dano oxidativo 28,36,37,38,39,40,41,42, explorando materiais eletrodos alternativos43, e imitando a nanoarestares da matriz extracelular natural 44,45,46 . Interesse recente é o desenvolvimento de revestimentos biomiméticos de superfície para mitigar a resposta neuroinflamatória na interface tecidual microeletrodes diretamente39.
A modificação da interface oferece o benefício único de direcionar diretamente a ferida e o tecido proximal necessário para a gravação do sinal. Um tratamento superficial que promova a cura sem exacerbar a resposta imune pode beneficiar a vida útil do registro de qualidade e remover limitações na realização do potencial terapêutico e de pesquisa de microeletros intracorticais. O trabalho apresentado detalha métodos para a aplicação de tratamentos superficiais em matrizes de microeletrodos que requerem tempos de reação prolongados, acomodando a fragilidade dos dispositivos. A técnica apresentada destina-se a compartilhar métodos de modificação de superfície em dispositivos funcionais onde o dispositivo não pode ser manuseado durante toda a aplicação do tratamento. As ferramentas são apresentadas para o manuseio de sondas manequim não funcionais e matrizes de microeletrodos planar de silício funcionais.
A abordagem apresentada para modificar a superfície do eletrodo permite a suspensão segura de sondas manequim não funcionais ou conjuntos funcionais de eletrodos planar de silício para deposição em fase de gás e reação com soluções aquosas. Várias peças impressas em 3D são usadas para lidar com esses dispositivos frágeis (Figura 1 e Figura 2). Um exemplo é fornecido de um procedimento que utiliza etapas de fase de gás e solução para a modificação da superfície com um revestimento antioxidativo envolvendo a imobilização da porfirina Mn(III)tetrakis (ácido 4-benzoico) (MnTBAP). MnTBAP é uma metalloporfirina sintética que possui propriedades antioxidantes com mediação demonstrada de inflamação47,48. O exemplo fornecido em matrizes funcionais de eletrodos planar de silício valida uma atualização para um protocolo previamente relatado para dispositivos não funcionais40. A adaptação de uma técnica de deposição de fase de gás da Munief et al. suporta a compatibilidade do protocolo com eletrodos funcionais49. A deposição da fase gasosa é utilizada para amina funcionalizar a superfície em preparação para a reação aquosa envolvendo a química do crosslinker carbodiimide para imobilizar o MnTBAP ativo. A metodologia de manuseio desenvolvida aqui é fornecida como uma plataforma que pode ser modificada para acomodar outros revestimentos e dispositivos similares.
O protocolo ilustra a abordagem usando sondas manequim não funcionais que compreendem uma haste de silício e uma guia impressa em 3D com dimensões semelhantes às matrizes funcionais de eletrodos planar de silício. A embalagem do conector do dispositivo é considerada análoga à guia impressa 3D da sonda manequim não funcional na instrução fornecida.
Figura 1: Peças impressas em 3D para manuseio de dispositivos funcionais durante a deposição em fase de gás em um desiccator a vácuo. (A) A base da estrutura inclui suportes para quadrados de silício de amostra de 1 cm x 1 cm (seta superior) e orifícios para fixação na placa desiccator (seta inferior). (B) A placa é usada para fixar a suspensão dos dispositivos. Daqui em diante, cada peça desta figura será referida como peça 1A ou 1B. Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Peças impressas em 3D para manuseio de dispositivos funcionais para a reação superficial que ocorre na solução aquosa. (A) Peça guia a ser colada à tampa da placa de cultura. (B) Peças benchtop usadas para estabilizar peças (C) e (D) durante a montagem. (C) e (D) juntos fixam a suspensão dos dispositivos para colocação na placa do poço, e (E) segura ainda mais as peças (C) e (D) na tampa da placa do poço. A partir de agora, as peças individuais em cada painel desta figura serão referidas como números de peça correspondentes ao número do painel desta figura. Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
Todos os arquivos de codificação para impressão 3D são fornecidos em Arquivos de Codificação Suplementar 1-16. A análise fornecida nos resultados representativos é descrita utilizando matrizes de eletrodos planar de silício funcionais adquiridos comercialmente (ver Tabela de Materiais).
1. Montagem de manuseio para deposição em fase de gás em um desiccador a vácuo
NOTA: O aparelho montado para manusear e segurar dispositivos durante a deposição em fase de gás é mostrado na Figura 3. As etapas 1.1-1.8 descrevem o procedimento necessário para colocar os dispositivos no aparelho para deposição (Figura 4A).
Figura 3: Montagem de peças impressas em 3D para manuseio de dispositivos funcionais durante a deposição em fase de gás. O conjunto é retratado sem amostras a serem revestidas. Parafusos e porcas de asa são usados para fixar peças 1A e 2B juntas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem de montagem e colocação de amostras a serem revestidas. Este esquema descreve o manuseio de dispositivos funcionais durante a deposição em fase de gás, assegurado dentro de um dessecador de vácuo. (A) Fita de poliimida de duas faces colocada na peça 1A e fita de espuma colocada em dispositivos 1B. (B) fixados na fita. (C) Parafusos e porcas de asa são usados para fixar peças 1B a 1A, e o conjunto é anexado à bandeja de desiccator usando laços de cabo zip (setas vermelhas). (D) amostras quadradas de silício de 1 cm x 1 cm são colocadas em seus respectivos suportes. (E) A folha de alumínio e o medidor de pressão são colocados no desiccador na orientação mostrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Para tratamento superficial, adquira amostras quadradas de 1 cm x 1 cm do material do substrato dos dispositivos.
- Para amostras de silício (selecionadas para este protocolo), corte o wafer de silício em quadrados de 1 cm x 1 cm usando uma máquina de dicing de wafer (ver Tabela de Materiais).
- Imprimir ou adquirir as peças 1A (Figura 1A, Arquivo de Codificação Suplementar 1, Arquivo de Codificação Suplementar 2) e 1B (Figura 1B, Arquivo de Codificação Suplementar 3, Arquivo de Codificação Suplementar 4).
- Conecte fita de poliimida de duas faces à peça 1A e conecte tira de espuma de 1/8" grossa com adesivo unilateral à peça 1B.
- Adere a embalagem do conector do dispositivo à fita na peça 1A.
NOTA: A orientação ideal do conector na fita deixará a haste suspensa sobre a borda, como mostrado na Figura 4B. - Fixar peça 1A e peça 1B juntas (Figura 4C). Alinhe os orifícios e fixe usando parafusos de aço inoxidável e porcas de asa (ver Tabela de Materiais).
- Usando laços zip, fixe o conjunto à bandeja de dessecador de vácuo usando os orifícios na parte inferior da peça 1A, como mostrado na Figura 4C.
- Se for o caso, coloque amostras de material quadrado nas fendas na parte inferior do quadro (Figura 4D). Aqui, amostras de wafer de silício de 1 cm x 1 cm quadrados são usadas como exemplo.
NOTA: O material exato precisará corresponder ao substrato do dispositivo tratado, que variará dependendo do dispositivo. - Complete a deposição em fase de gás colocando a solução em um recipiente apropriado dentro do desiccador de vácuo oposto e em linha com o conjunto protegido.
NOTA: Os pratos de alumínio foram utilizados como recipientes para a deposição (3-Aminopropil)triethoxysilane (APTES), como exemplo aqui.- Coloque um medidor de vácuo (ver Tabela de Materiais) dentro do dessecador para registrar a pressão exata. Posicione a porta da tampa do desiccator perto do conjunto protegido e em linha com a solução (Figura 4E).
NOTA: Mais detalhes sobre este método de deposição em fase de gás estão descritos em uma referência49 publicada anteriormente.
- Coloque um medidor de vácuo (ver Tabela de Materiais) dentro do dessecador para registrar a pressão exata. Posicione a porta da tampa do desiccator perto do conjunto protegido e em linha com a solução (Figura 4E).
2. Montagem de manuseio para reação superficial através de solução aquosa
NOTA: Os componentes e aparelhos montados para manuseio e retenção de dispositivos durante a deposição de fase aquosa e tratamento de superfície são ilustrados nas Figuras 5-7. As etapas a seguir detalharão o procedimento necessário para colocar os dispositivos no aparelho para deposição e tratamento.
Figura 5: Montagem de peças impressas em 3D para manuseio de dispositivos funcionais para a reação superficial que ocorre em solução aquosa. (A) Peça guia a ser colada à tampa da placa de cultura. (B) A peça de bancada foi usada para estabilizar peças (C) e (D) durante a montagem. (C) e (D) juntos fixam a suspensão dos dispositivos para colocação na placa do poço. (E) segura ainda mais as peças (C) e (D) na tampa da placa do poço. A fita poliimida de dois lados foi colocada na porção inferior de (C), e a fita de espuma foi colocada na porção inferior de (D) (ambas encaixotadas em vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Tampa da placa de cultura celular construída com 6 guias (peça 2A). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Sequência para proteger e carregar sondas para reação da solução. A cor das peças foi alterada nesta figura para clareza dentro da imagem. Estas são as mesmas partes da Figura 5 e Figura 6. (A) A peça 2C é colocada na peça 2B, e o dispositivo é fixado na porção colada de 2C. (B) A peça 2D se encaixa na peça 2C para criar um conjunto que suspenda a haste do dispositivo. (C) O conjunto de 2C, 2D e o dispositivo é cuidadosamente posicionado sobre a tampa da placa do poço usando o guia. (D) A peça 2E cabe em cima do conjunto para fixar ainda mais a tampa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Construa uma tampa para a placa do poço para suspender a matriz de eletrodos do dispositivo na solução (Figura 6). Este protocolo descreve o uso de uma placa de 24 poços.
- Corte os orifícios retangulares de 19 mm x 10,5 mm na tampa da placa do poço usando um cortador a laser ou manualmente com um cortador de caixa. Combine o número de furos com o número de dispositivos desejados para o tratamento.
NOTA: Para facilitar a montagem, recomenda-se tratar seis dispositivos por placa de poço, ou, no mínimo, colocar furos sobre poços não adjacentes (Figura 6). - Imprima ou adquira o número adequado de guias (peça 2A (Figura 2A), Arquivo de Codificação Suplementar 5, Arquivo de Codificação Suplementar 6).
- Use adesivo de cianoacrilato para fixar guias na tampa. Alinhe os orifícios retangulares nas guias e tampas enquanto colagem para garantir que o orifício retangular do guia seja desobstruído, como mostrado na Figura 6.
- Corte os orifícios retangulares de 19 mm x 10,5 mm na tampa da placa do poço usando um cortador a laser ou manualmente com um cortador de caixa. Combine o número de furos com o número de dispositivos desejados para o tratamento.
- Encha a placa do poço com a solução desejada nos locais onde o tratamento ocorrerá. Para efeitos de exemplo, a solução é composta por EDC e Sulfo-NHS (ver Tabela de Materiais) no buffer MES.
NOTA: O volume da solução dependerá das dimensões do dispositivo eletrodo. Para as matrizes de microeletrodes estilo Michigan (ver Tabela de Materiais) com conectores de baixo perfil de 8,6 mm e comprimento da haste de 3 mm, há ~9 mm de folga50. O uso de 2 mL de solução permitirá que a haste do dispositivo fique totalmente submersa, mantendo o restante do dispositivo fora da solução de reação.- Se amostras de substrato estiverem sendo usadas para confirmar o tratamento superficial, coloque amostras de material quadrado em um poço da placa e submerse-as na solução de reação.
- Suspenda com segurança os dispositivos (ver Tabela de Materiais) em uma placa de poço. A sequência é mostrada na Figura 7.
- Peça de fita 2B (Figura 2B, Arquivo de Codificação Suplementar 7, Arquivo de Codificação Suplementar 8) para um bancada (Figura 7A).
- Coloque fita de poliímida de dupla face para cobrir a base da peça 2C (Figura 2C, Arquivo de Codificação Suplementar 9, Arquivo de Codificação Suplementar 10).
- Coloque fita de espuma de 1/8" com adesivo de lado único para cobrir a base da peça 2D (Figura 2D, Arquivo de Codificação Suplementar 11, Arquivo de Codificação Suplementar 12).
- Ajuste a peça 2C no sulco da peça 2B (Figura 7A).
- Adere à embalagem do conector do dispositivo na fita, orientada, para que o comprimento da haste do dispositivo seja suspenso (Figura 7B).
- Fixar o dispositivo deslizando peça 2D (mostrada em laranja na Figura 7) na peça 2C. Este conjunto segura efetivamente o dispositivo entre as peças da ferramenta (Figura 7B).
- Segurando as bordas do conjunto, levante cuidadosamente para remover da peça 2A.
- Coloque o conjunto na tampa alinhando os semicírculos voltados para fora nas peças 2C e 2D com as guias correspondentes na peça 2A (mostrada em verde na Figura 7C).
- Colocação de montagem segura por peça de encaixe de prensa 2E (Figura 2E) sobre os guias (mostrado em verde na Figura 7D, Arquivo de Codificação Suplementar 13, Arquivo de Codificação Suplementar 14).
- Para reações que se beneficiam da mistura contínua da solução, agitar a placa do poço. Transfira a placa de poço montada para uma mesa de agitação e corra a velocidades abaixo de 100 rpm.
- Se forem desejadas múltiplas reações baseadas em soluções ou passos de lavagem, transfira cuidadosamente a tampa para uma nova placa de poço com soluções desejadas distribuídas para os poços apropriados.
NOTA: O passo 2.4 é opcional. - Remova os dispositivos da placa do poço.
- Fita 2B para um banco.
- Retire a peça 2E da tampa.
- Remova cuidadosamente o conjunto que segura o dispositivo da placa do poço.
- Oriente a montagem, de modo que a peça 2C fique de frente para o banco e peça 2D virada para cima. A haste do dispositivo precisa ser paralela à bancada. Ajuste a peça 2C da montagem na peça 2B como foi concluída anteriormente (etapa 2.3.4) ao encaixar a montagem.
- Separe a peça 2D da peça 2C, separando-as cuidadosamente. Aplique uma leve pressão nas guias da peça 2C no banco para fornecer estabilidade para esta tarefa.
NOTA: As guias de 2C são mais longas que as de 2D para facilitar esse manuseio. - Use fórceps para segurar a embalagem do conector do dispositivo para remover da fita e transferir o dispositivo para o recipiente de armazenamento desejado.
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Representative Results
Para demonstrar o uso dos componentes de manuseio, foi implementada a metodologia descrita para adaptar a imobilização de um mediador oxidante ao silício ativado. A aplicação desta química aos IMEs para reduzir o estresse oxidativo foi concebida por Potter-Baker et al. e demonstrada em sondas manequim de silício não funcionais40. Este tratamento superficial imobiliza o antioxidante, MnTBAP, para a superfície de silício ativada UV/ozônio através da funcionalidade de amina seguida de carbodiimide crosslinking química51. A funcionalização da amina é concluída através da deposição em fase de gás e a química de ligação cruzada de carbodiimida através da reação aquosa. Esses experimentos foram realizados usando matrizes de microeletrodos disponíveis comercialmente no estilo michigan e amostras quadradas de silício para permitir a análise material do método de revestimento (ver Tabela de Materiais).
Primeiro, a amina de funcionalidade foi realizada utilizando-se o aminosilano, (3-Aminopropil)triethoxysilane (APTES). A deposição em fase de gás da APTES utilizou uma adaptação dos métodos descritos por Munief et al.49. Os dispositivos foram suspensos com segurança usando as ferramentas impressas em 3D após o protocolo de manuseio descrito para tratamento em fase de gás. Em seguida, 400 μL de APTES líquidos foi colocado em um prato de alumínio dentro do dessecador de vácuo. A tampa do desiccator foi colocada, e o vácuo foi puxado para ~25 psi por 20 minutos. Depois de 20 minutos, o vácuo foi liberado. Um fresco 400 μL de APTES líquido foi colocado em um novo prato de alumínio. O vácuo foi puxado novamente para ~25 psi por mais 20 minutos. Depois de 20 min, o APTES foi atualizado uma segunda vez, e o vácuo foi mantido em ~25 psi por 24 h52. Após a funcionalidade de amina, a química de crosslinking de carbodiimide foi usada para imobilizar o MnTBAP. Procedimento padrão utilizando 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide methiodide (EDC) e N-Hydroxysulfosuccinimide sal de sódio (Sulfo-NHS) em 2-(N-Morpholino)ácido esulfônico (MES) foi empregado como descrito anteriormente40. As ferramentas impressas em 3D suspenderam os dispositivos em poços contendo a solução de reação.
Após a conclusão das reações de funcionalização, foi realizada espectroscopia de fotoelétrons de raios-X e raios-X (XPS) para confirmar a presença de APTES (etapa 1) e MnTBAP (etapa 2), respectivamente. Os quadrados de silício de 1 cm x 1 cm foram utilizados para analisar cada etapa do processo de revestimento para validar a deposição APTES bem sucedida e a imobilização do MnTBAP. As medidas de elipsometry colhidas do centro de 12 amostras de silício produziram uma espessura média da camada APTES de 8,5 ± 1,02 Å, em comparação com a espessura teórica da monocamadas de 7 Å. Os resultados da XPS estão previstos na Tabela 1. Após o tratamento APTES em fase de gás, há um aumento na porcentagem das concentrações atômicas de nitrogênio e carbono, indicativo do depósito químico. Após o processo de imobilização da fase da solução, esses resultados demonstram a presença de manganês, elemento que contribuiu para a atividade do MnTBAP, que era indetectável antes da imobilização da fase de solução.
| Modificação | C (%) | N (%) | O (%) | Si (%) | Mn (%) | ||
| Si tratado com plasma | 3.06 | 0.5 | 49.84 | 46.605 | 0 | ||
| Deposição da fase de gás APTES | 13.63 | 3.2 | 43.98 | 39.2 | 0 | ||
| MnTBAP imobilizado | 44.16 ± 3.94 | 5.33 ± 0.37 | 21.81 ± 1.30 | 21.81 ± 2.39 | 0,79 ± 0,07 | ||
Tabela 1: Análise XPS para modificações sequenciais ao silício. Os valores previstos para a etapa de imobilização do MnTBAP são apresentados com um desvio padrão para um tamanho amostral de 4.
A funcionalidade das matrizes de microeletrodos estilo Michigan após os processos de revestimento foi avaliada usando espectroscopia de impedância elétrica (EIS)50. O EIS foi registrado para 20 canais totais de microeletrodos em dois dispositivos. Os canais incluídos para o teste foram selecionados aleatoriamente e distribuídos uniformemente entre os dois dispositivos (10 canais/dispositivo). As medições foram feitas utilizando um potencialiostat com uma configuração de três eletrodos. As medições foram concluídas para cada canal três vezes antes do processo de revestimento e três vezes após o processo de revestimento. A magnitude de impedância de 1 kHz foi de 238 ± 10,22 kΩ e 237 ± 9,81 kΩ antes e depois do processo de revestimento, respectivamente. Um teste t em pares foi selecionado para determinar se o processo de revestimento afetou a impedância do canal53. As medidas de impedância do dispositivo apresentam variância significativa; assim, uma análise sobre o nível do dispositivo pode perder um efeito do revestimento dentro do ruído da variabilidade de fabricação. Um teste t-t entre magnitudes de impedância dos canais a 1 kHz antes e depois do processo de revestimento não indicou diferença estatística (p > 0,937). O traçado bode de um dispositivo testado é fornecido na Figura 8, exibindo os resultados de gravações de 10 canais antes e depois do tratamento. As imagens da matriz de eletrodos antes e depois do processo de revestimento são fornecidas na Figura 9. Podem ser encontradas informações adicionais sobre os detalhes instrumentais para as análises materiais no Arquivo Complementar 1.
Figura 8: Enredo bode exibindo medidas médias de impedância eletroquímica em um dispositivo testado (10 canais) antes (cinza) e depois (vermelho) do procedimento de revestimento. As barras representam o erro padrão da média. A magnitude da impedância diminuiu com o aumento da frequência. O ângulo de fase diminuiu com o aumento da frequência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Imagens da matriz de eletrodos antes (superior) e depois (inferior) do processo de revestimento. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo Complementar 1: Detalhes instrumentais para análises materiais. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivos de codificação suplementar 1-16: Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
O protocolo descrito foi projetado para o tratamento superficial de matrizes de microeletrodos planar de silício. As ferramentas impressas em 3D são personalizadas para matrizes de microeletrodos estilo Michigan com conectores de baixo perfil50. As sondas não funcionais foram montadas aderindo uma sonda de silício a guias impressas em 3D usando um adesivo biocompatível. As guias impressas em 3D foram projetadas com dimensões semelhantes aos conectores incorporados nos dispositivos disponíveis comercialmente utilizados. Os arquivos para as guias impressas em 3D estão disponíveis como Arquivo de Codificação Suplementar 15, Arquivo de Codificação Suplementar 16. O filamento de estireno de acrilonitrilo butadieno (ABS) foi usado para construir as peças impressas em 3D. Se desejar, o filamento de ácido polilático (PLA) também pode ser usado para construir as ferramentas. Uma placa de 24 poços foi usada para a reação superficial com a solução aquosa com uma profundidade de poço de 17,4 mm. Ao adaptar o protocolo a dispositivos alternativos, o tipo de eletrodo (dimensões do conector, comprimento da haste), a resolução da impressora 3D utilizada e a compatibilidade química do filamento precisam ser considerados.
Técnicas padrão para analisar tratamentos superficiais são impossíveis de realizar em dispositivos montados devido ao tamanho e/ou natureza destrutiva dos testes. Para obter representações do tratamento superficial em matrizes de microeletrodos planar de silício, amostras de silício de grau dispositivo podem ser tratadas juntamente com dispositivos funcionais para análise posterior. Se um dispositivo diferente estiver sendo usado, o material amostral precisa corresponder ao do substrato do dispositivo. Embora indireto, este método permite verificações de qualidade entre tratamentos em lote. A ferramenta impressa em 3D para deposição em fase de gás inclui características que acomodam amostras quadradas para garantir condições suficientes de deposição de superfície. As características que guardam as amostras quadradas têm uma fenda de 1 mm para inserir as amostras. As amostras de silício utilizadas no trabalho apresentado têm 525 μm de espessura. Se o material amostral alternativo for desejado e for mais espesso que 1 mm, é necessário fazer ajustes nos arquivos fornecidos. A Figura 1 ilustra os componentes da montagem para deposição em fase de gás. A Figura 2 mostra os componentes de montagem para a reação da solução aquosa em uma placa de 24 poços.
A adaptação do método de imobilização do MnTBAP descrito por Potter-Baker et al. foi utilizada para demonstrar a utilidade das ferramentas apresentadas40. Esses experimentos foram concluídos usando matrizes de microeletrodos no estilo michigan comercialmente disponíveis e amostras quadradas de silício para permitir a análise material do método de revestimento. Para confirmar a presença de APTES, foi realizada espectroscopia de fotoeletríno de raios-X e raios-X (XPS) nas amostras quadradas de silício. As medidas de elipsão demonstraram um aumento na espessura da amostra correspondente ao depósito APTES previsto. A análise da XPS realizada nas amostras mostrou um aumento no percentual das concentrações atômicas de nitrogênio e carbono, indicativo do depósito aptes. A análise da XPS demonstrou ausência de manganês antes do processo de imobilização da fase da solução, seguido pela presença de manganês. Esses dados juntos foram tomados como justificativa da existência do revestimento. Nesta fase, os dispositivos estão prontos para testes in vitro e in vivo. Por exemplo, experimentos in vivo implantando os dispositivos em roedores podem ser realizados para permitir a análise de gravação e coloração imunohistoquímica para determinar o efeito do revestimento no desempenho do dispositivo36,40.
Melhorar o desempenho intracortical de microeletrodos in vivo é necessário para que a tecnologia avance no uso clínico. Os esforços de pesquisa em andamento visam elucidar e aliviar os processos por trás da falha do dispositivo54. Uma área substancial desta pesquisa visa a mitigação da resposta de tecido deletério à implantação de dispositivos crônicos 7,55,56,57. O foco na interface entre o dispositivo e o tecido permite o tratamento direcionado do tecido afetado58,59. Várias modificações superficiais em microeletros intracorticais têm e continuam a ser exploradas 60,61,62,63.
O procedimento apresentado oferece métodos para a aplicação de tratamentos superficiais envolvendo deposição em fase de gás e reação aquosa de solução aos dispositivos montados. No desenvolvimento de tratamentos superficiais, a tradução para dispositivos funcionais apresenta várias preocupações de manuseio64. Considerando a fragilidade e o gasto das matrizes de microeletrodos funcionais, as ferramentas apresentadas facilitam muito a manutenção da integridade do dispositivo durante os tratamentos6. Métodos de manuseio seguros são relevantes em procedimentos de modificação que ocorrem por longos períodos e incluem múltiplas etapas. A funcionalidade de superfícies envolvendo depósitos de filmes e imobilização de moléculas pode incluir várias rodadas de processos com tempo total de incubação superior a múltiplas horas 23,24,40,60. Os métodos de manuseio de matrizes de microeletrodos funcionais ainda não foram relatados detalhadamente. O relatório apresentado pretende divulgar em detalhes um método de manuseio.
Os esforços de pesquisa para melhorar o desempenho da matriz de microeletrodos intracorticais através do desenvolvimento de tratamentos superficiais e revestimentos podem se beneficiar da aplicação segura de tratamentos usando essas ferramentas. Embora projetados para tratamento superficial de dispositivos planar de silício modelados para as matrizes de microeletrodos descritas no estilo michigan, os arquivos estão disponíveis para adaptar as peças impressas em 3D para dispositivos alternativos. Ao fazer ajustes, considere as dimensões do dispositivo, a resolução da impressora 3D utilizada e a compatibilidade química.
Limitações à abordagem detalhada devem ser abordadas ao determinar o método mais adequado para qualquer protocolo de modificação de superfície personalizado. As peças impressas em 3D são personalizadas e requerem tempo e acesso para serem feitas. Além disso, as peças foram projetadas para um estilo particular da matriz de microeletrodos. Assim, serão necessários ajustes nas peças impressas em 3D para acomodar dispositivos alternativos e embalagens correspondentes do conector. Finalmente, os protocolos aqui detalhados não foram avaliados para compatibilidade com vários contatos metálicos ou polímeros de condução de base orgânica relevantes para outros projetos de dispositivos. Para garantir a absoluta integridade do dispositivo e a segurança dos pesquisadores, devem ser considerados reagentes usados para química de reação.
Em resumo, foi apresentado um protocolo robusto que permite modificações superficiais em eletrodos neurais funcionais, minimizando o risco de comprometer a integridade do dispositivo. A metodologia pode servir como uma plataforma para novas modificações de classes de dispositivos similares ou alternativas.
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Disclosures
O conteúdo não representa as opiniões do Departamento de Assuntos dos Veteranos dos EUA, dos Institutos Nacionais de Saúde ou do Governo dos Estados Unidos.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado em parte pelo Merit Review Award IRX002611 (Capadona) e pelo Research Career Scientist Award IK6RX003077 (Capadona) do Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento de Assuntos de Veteranos dos Estados Unidos (EUA). Além disso, este trabalho também contou com o apoio, em parte, do Instituto Nacional de Saúde, Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e AVC R01NS110823 (Capadona/Pancrazio) e do Programa nacional de Bolsas de Pós-Graduação em Pesquisa (Krebs).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide methiodide (EDC) | Sigma-Aldrich | 165344-1G | Solid, stored desiccated at -20 °C |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 18 Pound Solid Nylon Cable/Zip Ties | Cole-Parmer | EW-06830-66 | Length 4 inches |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | 4432-31-9 | Solid |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140-100ML | Liquid, container with Sure/Seal |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-103 | |
| Aluminum weighing dishes | Fisher Scientific | 08-732-102 | Diameter 66 mm |
| Bel-Art Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15B | |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Millipore Sigma | CLS3527-100EA | 24-well plate, polystyrene |
| Cyanoacrylate Adhesive | LocTite | N/A | |
| Digital Microscope | Keyence | VHX-S750E | |
| Disco DAD3350 Dicing Saw | Disco | DAD3350 | Used to cut silicon wafer into 1 cm x 1 cm samples |
| Double-Sided Polyimide Tape | Kapton Tape | PPTDE-1/4 | ¼” x 36 yds. |
| EP21LVMed – low viscosity, two component epoxy compound | Masterbond | EP21LVMed | Meets USP Class VI certification, Passes ISO 10993-5 for cytotoxicity |
| Epilog Fusion Pro 48 Laser Machine | Epilog | N/A | CO2 laser |
| Foam tape | XFasten | N/A | 1/8" Thick |
| Gamry Interface 1010E Potentiostat | Gamry | 992-00129 | |
| High precision 45° curved tapered very fine point tweezers/forceps | Fisher Scientific | 12-000-131 | |
| Lab tape | Fisher Scientific | 15-901-10L | |
| Mn(III)tetrakis (4-benzoic acid) porphyrin (MnTBAP) | EMD Millipore | 475870-25MG | Solid, stored at -20 °C |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | 56485-250MG | Solid, stored desiccated at 4°C |
| Platinum clad niobium mesh anode | Technic | N/A | Clad with 125μ” of platinum on one side, framed in titanium with (1) 1” x 6” titanium strap centered on one 6” dimension |
| Silicon Planar Microelectrode Array, 16 Channel | NeuroNexus | A1x16-3mm-100-177-CM16LP | Electrode site material is iridium, shank thickness is 15 μm |
| Silicon Wafer | University Wafer | 1575 | Diameter 100 mm, p-type, boron-doped, 100 oriented, resistivity 0.01-0.02 Ohm-cm, thickness 525 um, single side polished, prime grade |
| Silver/silver Chloride reference electrode | Gamry Instruments | 930-00015 | |
| Solidworks | N/A | ||
| Stainless Steel Phillips Flat Head Screws | McMaster Carr | 96877A629 | #8-32, 1 1/2", fully threaded |
| Type I deionized water | ChemWorld | CW-DI1-20 | |
| Ultimaker 3 3D printer | Ultimaker | N/A | |
| Ultimaker Cura | Ultimaker | N/A | 3D printing software |
| Ultimaker NFC ABS Filament | Dynamism, Inc. | 1621 | 2.85 mm |
| Ultimaker NFC PLA Filament | Dynamism, Inc. | 1609 | 2.85 mm |
| Vacuum Gauge Vacuum Gauge | Measureman Direct | N/A | Glycerin Filled, 2-1/2” Dial Size, ¼”NPT, -30” Hg/-100kpa-0 |
| Wing nuts | Everbilt | 934917 | #8-32, zinc plated |
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