Summary
Detta protokoll beskriver verktyg för hantering av kiselplanära intrakortikala mikroelektroder under behandlingar för ytmodifiering via gasavsättning och vattenlösningsreaktioner. Monteringen av komponenterna som används för att hantera enheterna under hela proceduren förklaras i detalj.
Abstract
Intrakortikala mikroelektroder har stor terapeutisk potential. Men de utmanas med betydande prestandaminskning efter blygsamma implantationsvaraktigheter. En betydande bidragsgivare till den observerade nedgången är skadan på nervvävnaden proximal mot implantatet och efterföljande neuroinflammatoriskt svar. Ansträngningar för att förbättra enhetens livslängd inkluderar kemiska modifieringar eller beläggningsapplikationer på enhetens yta för att förbättra vävnadssvaret. Utvecklingen av sådana ytbehandlingar slutförs vanligtvis med icke-funktionella "dummy" -sonder som saknar de elektriska komponenter som krävs för den avsedda applikationen. Översättning till funktionella enheter kräver ytterligare överväganden med tanke på bräckligheten hos intrakortiska mikroelektrodmatriser. Hanteringsverktyg underlättar i hög grad ytbehandlingar för monterade enheter, särskilt för modifieringar som kräver långa procedurtider. De hanteringsverktyg som beskrivs här används för ytbehandlingar som appliceras via gasfasdeposition och exponering för vattenhaltiga lösningar. Karakterisering av beläggningen utförs med användning av ellipsometri och röntgenfotoelektronspektroskopi. En jämförelse av elektriska impedansspektroskopiinspelningar före och efter beläggningsproceduren på funktionella anordningar bekräftade enhetens integritet efter modifiering. De beskrivna verktygen kan lätt anpassas för alternativa elektrodanordningar och behandlingsmetoder som upprätthåller kemisk kompatibilitet.
Introduction
Neuroprostetiska enheter syftar till att återställa nedsatt eller frånvarande sensorisk och motorisk förmåga i ett brett spektrum av patientpopulationer, inklusive de med ryggmärgsskada, amyotrofisk lateralskleros (ALS), cerebral pares och amputationer 1,2,3. Intracortical microelectrodes (IME) kan etablera en kommunikationsväg mellan kortikala neuroner och de enheter som används för att kontrollera neuroprostetik. En tydlig fördel med intrakortikala mikroelektroder är deras förmåga att registrera neurala signaler med hög rumslig och tidsmässig upplösning, vilket föredras för efterföljande signalbehandling och kontroll av hjärn-datorgränssnitt 4,5. Tyvärr minskar prestandan hos intrakortikala mikroelektroder dramatiskt inom några månader till ett år efter implantation 2,6,7,8. Förlusten av signalkvalitet och stabilitet påverkar tillämpningen av tekniken negativt.
En betydande bidragande orsak till den observerade prestationsminskningen är det biotiska svaret på implantationsassocierad vävnadsskada och kronisk neuroinflammation 9,10,11. Implantation av IME orsakar skador på hjärnvävnad, vilket resulterar i frisättning av signalmolekyler som initierar kaskader av reaktionära cellulära försvarsprocesser. Kroniskt gränssnitt förvärrar svaret på främmande kropp, vilket leder till ihållande neuroinflammation som skadar vävnaden proximal mot enheten; ofta erkänd som symtom på neuroinflammation, ärrbildning och lokal neurodegeneration som bidrar till nedgången i inspelningen av signalkvaliteten 12,13,14,15. Bestående av ett tätt konglomerat av astrocyter med entrained aktiverade mikroglia och makrofager, skapar ärret som inkapslar elektroden en ogynnsam lokal miljö med minskad materialtransport och lokal ackumulering av inflammatoriska faktorer 16,15,16,17,18.
Många studier har beskrivit hjärnans svar på intrakortikala mikroelektroder eller metoder för att mildra svaret7. Forskning och utveckling för att förbättra vävnadssvaret har involverat en rad strategier, inklusive modifieringar av den övergripande strukturen, yttopologin, materialen och beläggningsapplikationen. Dessa ansträngningar avser att minimera skador som uppstått från implantationshändelsen, införa ett mer gynnsamt gränssnitt mellan enheten och proximala celler eller minska vävnadsstammen efter att enheter implanterats7. Metoder som specifikt riktar sig mot det kroniska biologiska svaret har lett till flera bioaktiva beläggningar som syftar till att stabilisera implantationsstället och kemiskt främja cellhälsa. Exempel inkluderar ledande polymerer såsom poly (etylendioxytiofen) (PEDOT)19,20, kolnanorör21, hydrogeler22 och tillsats av bioaktiva molekyler och läkemedel för att rikta in sig på specifika cellulära processer 23,24,25. Vår forskargrupp har i synnerhet utforskat många mekanismer för att främja en minskning av det inflammatoriska svaret på implanterade mikroelektroder inklusive, men inte begränsat till, minimering av traumat i samband med enhetsimplantation26, minimering av enhetens / vävnadens styvhetsfel 27,28,29,30,31,32,33, optimering av sterilisering procedurer34,35, minska oxidativ stress /skada 28,36,37,38,39,40,41,42, utforska alternativa elektrodmaterial 43 och efterlikna nanoarkitekturen hos den naturliga extracellulära matrisen 44,45,46 . Nytt intresse är utvecklingen av biomimetiska ytbeläggningar för att mildra det neuroinflammatoriska svaret vid mikroelektrodvävnadsgränssnittet direkt39.
Modifiering av gränssnittet erbjuder den unika fördelen att direkt rikta in sig på såret och den proximala vävnaden som är nödvändig för signalinspelning. En ytbehandling som främjar läkning utan att förvärra immunsvaret kan gynna livslängden för kvalitetsinspelning och ta bort begränsningar för att förverkliga den terapeutiska och forskningspotentialen för intrakortiska mikroelektroder. Det presenterade arbetet beskriver metoder för att applicera ytbehandlingar på mikroelektrodmatriser som kräver förlängda reaktionstider samtidigt som enheternas bräcklighet tillgodoses. Den presenterade tekniken är avsedd att dela ytmodifieringsmetoder till funktionella enheter där produkten inte kan hanteras under hela behandlingsapplikationen. Verktygen presenteras för hantering av icke-funktionella dummyprober och funktionella kiselplanära mikroelektrodmatriser.
Det presenterade tillvägagångssättet för att modifiera elektrodytan möjliggör säker suspension av icke-funktionella dummyprober eller funktionella kiselplanära elektrodmatriser för gasfasavsättning och reaktion med vattenhaltiga lösningar. Flera 3D-tryckta delar används för att hantera dessa ömtåliga enheter (figur 1 och figur 2). Ett exempel ges på ett förfarande som använder både gas- och lösningsfassteg för ytmodifieringen med en antioxidativ beläggning som involverar immobilisering av Mn (III) tetrakis (4-bensoesyra) porfyrin (MnTBAP). MnTBAP är ett syntetiskt metalloporfyrin som har antioxidativa egenskaper med demonstrerad förmedling av inflammation47,48. Det tillhandahållna exemplet på funktionella kiselplanära elektrodmatriser validerar en uppdatering av ett tidigare rapporterat protokoll för icke-funktionella enheter40. Anpassningen av en gasfasavsättningsteknik från Munief m.fl. stöder protokollets kompatibilitet med funktionella elektroder49. Gasfasavsättningen används för att aminfunktionalisera ytan som förberedelse för den vattenhaltiga reaktionen som involverar karbodiimid tvärbindande kemi för att immobilisera den aktiva MnTBAP. Hanteringsmetoden som utvecklats här tillhandahålls som en plattform som kan modifieras för att rymma andra beläggningar och liknande enheter.
Protokollet illustrerar tillvägagångssättet med icke-funktionella dummyprober bestående av ett kiselskaft och en 3D-tryckt flik med liknande dimensioner som de funktionella kiselplanära elektrodmatriserna. Enhetens anslutningsförpackning anses vara analog med den 3D-tryckta fliken för den icke-funktionella dummysonden i den medföljande instruktionen.
Figur 1: 3D-tryckta bitar för hantering av funktionella anordningar under gasfasavsättningen i en vakuumdessiccator. (B) Plattan används för att säkra upphängningen av anordningar. Härifrån och framåt kommer varje bit i denna figur att kallas antingen bit 1A eller 1B. Skalstreck = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: 3D-printade delar för hantering av funktionella anordningar för ytreaktion som sker i vattenlösningen. (B) Bänkstycken som används för att stabilisera bitar (C) och (D) vid montering. (C) och (D) tillsammans säkrar upphängningen av anordningar för placering i brunnsplattan, och (E) säkrar ytterligare bitar (C) och (D) till brunnsplattans lock. Härifrån och framåt kommer enskilda bitar i varje panel i denna figur att kallas styckenummer som motsvarar panelnumret för denna figur. Skalstreck = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla kodningsfiler för 3D-utskrift finns i Kompletterande kodningsfiler 1-16. Analysen i de representativa resultaten beskrivs med hjälp av kommersiellt förvärvade funktionella kiselplanarelektrodmatriser (se materialtabell).
1. Hantering av enhet för gasfasavsättning i en vakuumdesickator
ANMÄRKNING: Den monterade apparaten för hantering och förvaring av anordningar under gasfasavsättning visas i figur 3. Steg 1.1-1.8 beskriver det förfarande som krävs för att placera anordningarna i apparaten för deponering (figur 4A).
Figur 3: Montering av 3D-tryckta delar för hantering av funktionella anordningar under gasfasavsättning. Aggregatet är avbildat utan prover som ska beläggas. Skruvar och vingmuttrar används för att fästa bitar 1A och 2B tillsammans. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Bild av montering och placering av prover som ska beläggas. Detta schema beskriver hanteringen av funktionella anordningar under gasfasdeposition säkrad i en vakuumdessiccator. (A) Dubbelsidig polyimidtejp placerad på bit 1A och skumtejp placerad på 1B. (B) Enheter som är fästa på tejp. (C) Skruvar och vingmuttrar används för att fästa delar 1B till 1A, och enheten fästs på exsickatorbrickan med dragkedjor (röda pilar). (D) 1 cm x 1 cm kiselkvadratprover placeras i respektive hållare. (E) Aluminiumvägningsskålen och tryckmätaren placeras i exsickatorn i den riktning som visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- För ytbehandling, skaffa 1 cm x 1 cm kvadratiska prover av enheternas substratmaterial.
- För kiselprover (valda för detta protokoll), skär kiselskivan i 1 cm x 1 cm kvadrater med hjälp av en wafertärningsmaskin (se materialtabell).
- Skriv ut eller skaffa delar 1A (figur 1A, kompletterande kodningsfil 1, kompletterande kodningsfil 2) och 1B (figur 1B, kompletterande kodningsfil 3, kompletterande kodningsfil 4).
- Fäst dubbelsidig polyimidtejp på bit 1A och fäst 1/8 " tjock skumremsa med ensidig lim till stycke 1B.
- Fäst enhetens kontaktförpackning på tejpen på bit 1A.
OBS: Den ideala orienteringen av kontakten på tejpen lämnar skaftet upphängt över kanten, som visas i figur 4B. - Säkra punkt 1A och stycke 1B tillsammans (figur 4C). Rikta in hålen och säkra med skruvar och vingmuttrar i rostfritt stål (se materialtabell).
- Fäst enheten i vakuumbetsbehållaren med hjälp av dragkedjor med hålen i botten av punkt 1A enligt figur 4C.
- Placera i tillämpliga fall kvadratiska materialprover i slitsarna längst ner på ramen (figur 4D). Här används 1 cm x 1 cm fyrkantiga kiselskiva tärnade prover som ett exempel.
OBS: Det exakta materialet måste matcha substratet för den behandlade enheten, vilket varierar beroende på enhet. - Slutför gasfasavsättningen genom att placera lösningen i ett lämpligt kärl i vakuumdesickatorn mittemot och i linje med den säkrade enheten.
OBS: Aluminiumvägningsskålar användes som behållare för (3-Aminopropyl) trietoxisilan (APTES) avsättning, som ett exempel här.- Placera en vakuummätare (se materialtabell) i exsickatorn för att registrera det exakta trycket. Placera porten på exsickatorlocket nära den säkrade enheten och i linje med lösningen (figur 4E).
OBS: Ytterligare detaljer om denna metod för gasfasdeposition beskrivs i en tidigare publicerad referens49.
- Placera en vakuummätare (se materialtabell) i exsickatorn för att registrera det exakta trycket. Placera porten på exsickatorlocket nära den säkrade enheten och i linje med lösningen (figur 4E).
2. Hantering av montering för ytreaktion via vattenlösning
OBS: Komponenterna och den monterade apparaten för hantering och förvaring av anordningar under vattenfasdeposition och ytbehandling illustreras i figurerna 5-7. Följande steg kommer att beskriva det förfarande som krävs för att placera enheterna i apparaten för deponering och behandling.
Figur 5: Montering av 3D-tryckta delar för hantering av funktionella anordningar för ytreaktion som sker i vattenlösning. (B) Bänkskivan användes för att stabilisera bitar (C) och (D) under montering. (C) och (D) tillsammans säkra upphängningen av anordningar för placering i brunnsplattan. (E) säkrar vidare bitar (C) och (D) på brunnsplattans lock. Dubbelsidig polyimidtejp placerades på den nedre delen av (C) och skumtejp placerades på den nedre delen av (D) (båda boxade i rött). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Cellodlingsplattans lock konstruerat med 6 guider (stycke 2A). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Sekvens för säkring och laddning av sonder för lösningsreaktion. Färgen på delarna ändrades i denna figur för tydlighet i bilden. Det är samma delar som figur 5 och figur 6. (A) Bit 2C placeras i stycke 2B och enheten är fäst vid den tejpade delen av 2C. (B) Bit 2D passar in i stycke 2C för att skapa en enhet som hänger upp enhetens skaft. (C) Monteringen av 2C, 2D och enheten placeras försiktigt på locket på brunnsplattan med hjälp av styrningen. (D) Stycke 2E passar ovanpå aggregatet för att ytterligare säkra locket. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Konstruera ett lock för brunnsplattan för att suspendera elektroduppsättningen på enheten i lösning (figur 6). Detta protokoll beskriver användningen av en 24-brunnsplatta.
- Skär rektangulära hål 19 mm x 10,5 mm i locket på brunnsplattan med en laserskärare eller manuellt med en lådskärare. Matcha antalet hål till antalet enheter som önskas för behandling.
OBS: För att underlätta montering rekommenderas att behandla sex enheter per brunnsplatta, eller åtminstone placera hål över icke-intilliggande brunnar (figur 6). - Skriv ut eller skaffa lämpligt antal guider (stycke 2A (figur 2A), kompletterande kodningsfil 5, kompletterande kodningsfil 6).
- Använd cyanoakrylatlim för att säkra styrningar till locket. Rikta in de rektangulära hålen i styrningarna och locken medan du limmar för att säkerställa att styrningens rektangulära hål är obehindrat, som visas i figur 6.
- Skär rektangulära hål 19 mm x 10,5 mm i locket på brunnsplattan med en laserskärare eller manuellt med en lådskärare. Matcha antalet hål till antalet enheter som önskas för behandling.
- Fyll brunnsplattan med önskad lösning på platser där behandling kommer att ske. Lösningen består till exempel av EDC och Sulfo-NHS (se materialtabell) i MES-buffert.
OBS: Lösningens volym beror på elektrodanordningens dimensioner. För mikroelektrodmatriser i Michigan-stil (se materialtabell) med lågprofilkontakter på 8,6 mm och skaftlängd på 3 mm finns det ~ 9 mm spelrum50. Användning av 2 ml lösning gör det möjligt för anordningens skaft att vara helt nedsänkt samtidigt som resten av anordningen hålls borta från reaktionslösningen.- Om substratprover används för att bekräfta ytbehandling, placera fyrkantiga materialprover i en brunn på plattan och sänk ner dem i reaktionslösningen.
- Stäng av enheterna ordentligt (se materialtabell) i en brunnsplatta. Sekvensen visas i figur 7.
- Bandstycke 2B (figur 2B, kompletterande kodningsfil 7, kompletterande kodningsfil 8) till en bänkskiva (figur 7A).
- Placera dubbelsidig polyimidtejp för att täcka basen på bit 2C (figur 2C, kompletterande kodningsfil 9, kompletterande kodningsfil 10).
- Placera 1/8 " skumtejp med ensidigt lim för att täcka basen på bit 2D (figur 2D, kompletterande kodningsfil 11, kompletterande kodningsfil 12).
- Montera bit 2C i spåret på bit 2B (figur 7A).
- Fäst enhetens kontaktförpackning på tejpen, orienterad, så att längden på enhetens skaft är upphängd (figur 7B).
- Säkra enheten genom att skjuta bit 2D (visas i orange i figur 7) i stycke 2C. Denna montering säkrar effektivt enheten mellan verktygsbitarna (figur 7B).
- Håll kanterna på enheten, lyft försiktigt för att ta bort från stycke 2A.
- Montera enheten i locket genom att rikta in de utåtvända halvcirklarna på bitarna 2C och 2D med motsvarande styrningar på stycke 2A (visas i grönt i figur 7C).
- Säkra monteringsplaceringen genom att trycka på stycke 2E (figur 2E) över stödlinjerna (visas i grönt i figur 7D, Kompletterande kodningsfil 13, Kompletterande kodningsfil 14).
- För reaktioner som drar nytta av kontinuerlig blandning av lösningen, omrör brunnsplattan. Överför den monterade brunnsplattan till ett skakbord och kör med hastigheter under 100 varv / minut.
- Om flera lösningsbaserade reaktioner eller tvättsteg önskas, överför försiktigt locket till en ny brunnsplatta med önskad lösning (er) fördelad till lämpliga brunnar.
OBS: Steg 2.4 är valfritt. - Ta bort enheter från brunnsplattan.
- Tejpstycke 2B till en bänkskiva.
- Ta bort bit 2E från locket.
- Ta försiktigt bort enheten som håller enheten från brunnsplattan.
- Orientera monteringen så att stycke 2C vetter mot bänkskivan och stycke 2D uppåt. Enhetens skaft måste vara parallellt med bänkskivan. Montera del 2C av enheten i stycke 2B som slutfördes tidigare (steg 2.3.4) när du monterar ihop enheten.
- Separera bit 2D från bit 2C genom att försiktigt dra isär dem. Applicera lätt tryck på flikarna i stycke 2C i bänken för att ge stabilitet för denna uppgift.
OBS: Flikarna i 2C är längre än 2D för att underlätta denna hantering. - Använd pincett för att hålla fast enhetens kontaktförpackning för att ta bort från tejpen och överföra enheten till önskad förvaringsbehållare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera användningen av hanteringskomponenterna implementerades den beskrivna metoden för att anpassa immobiliseringen av en oxidantmediator till aktiverat kisel. Tillämpningen av denna kemi på IME för att minska oxidativ stress utformades av Potter-Baker etal. Denna ytbehandling immobiliserar antioxidanten, MnTBAP, till UV/ozonaktiverad kiselyta via aminfunktionalisering följt av karbodiimid tvärbindande kemi51. Aminfunktionaliseringen slutförs via gasfasavsättning och karbodiimid tvärbindningskemi via vattenreaktion. Dessa experiment utfördes med hjälp av kommersiellt tillgängliga mikroelektrodmatriser i Michigan-stil och kiselkvadratprover för att möjliggöra materialanalys av beläggningsmetoden (se materialtabell).
Först utfördes aminfunktionalisering med användning av aminosilan, (3-Aminopropyl)trietoxisilan (APTES). Gasfasdepositionen av APTES använde en anpassning av metoder som beskrivs av Munief et al.49. Enheterna suspenderades säkert med hjälp av de 3D-tryckta verktygen enligt det beskrivna hanteringsprotokollet för gasfasbehandling. Därefter placerades 400 μl flytande APTES i en aluminiumskål i vakuumdesickatorn. Exsickatorlocket placerades och vakuumet drogs till ~25 psi i 20 min. Efter 20 min släpptes vakuumet. En ny 400 μl flytande APTES placerades i en ny aluminiumskål. Vakuumet drogs igen till ~25 psi i ytterligare 20 min. Efter 20 min uppdaterades APTES en andra gång och vakuumet hölls vid ~ 25 psi i 24 h52. Efter aminfunktionaliseringen användes karbodiimid tvärbindningskemi för att immobilisera MnTBAP. Standardförfarande med användning av 1-[3-(Dimetylamino)propyl]-3-etylkarbodiimidmetiodid (EDC) och N-Hydroxysulfosuccinimidnatriumsalt (Sulfo-NHS) i 2-(N-Morpholino)etansulfonsyra (MES) buffert användes som tidigarebeskrivits 40. De 3D-tryckta verktygen suspenderade enheterna i brunnar som innehöll reaktionslösningen.
Efter slutförandet av funktionaliseringsreaktionerna utfördes ellipsometri och röntgenfotoelektronspektroskopi (XPS) för att bekräfta närvaron av APTES (steg 1) respektive MnTBAP (steg 2). Kiselrutor 1 cm x 1 cm användes för att analysera varje beläggningsprocesssteg för att validera framgångsrik APTES-deponering och MnTBAP-immobilisering. Ellipsometrimätningar tagna från mitten av 12 kiselprover gav en genomsnittlig APTES-skikttjocklek på 8,5 ± 1,02 Å, jämfört med den teoretiska monolagertjockleken på 7 Å. Resultaten av XPS finns i tabell 1. Efter APTES-behandlingen i gasfasen ökar andelen atomkoncentrationer av kväve och kol, vilket indikerar den kemiska avsättningen. Efter immobiliseringsprocessen för lösningsfasen visar dessa resultat närvaron av mangan, det element som bidrar till aktiviteten hos MnTBAP, vilket inte kunde upptäckas före immobilisering av lösningsfasen.
| Ändring | C (%) | N (%) | O (%) | Si (%) | Mn (%) | ||
| Plasmabehandlat Si | 3.06 | 0.5 | 49.84 | 46.605 | 0 | ||
| APTES-avsättning av gasfas | 13.63 | 3.2 | 43.98 | 39.2 | 0 | ||
| MnTBAP immobiliserad | 44.16 ± 3.94 | 5.33 ± 0.37 | 21.81 ± 1.30 | 21.81 ± 2.39 | 0,79 ± 0,07 | ||
Tabell 1: XPS-analys för sekventiella modifieringar av kisel. Värden som tillhandahålls för MnTBAP-immobiliseringssteget presenteras med en standardavvikelse för en provstorlek på 4.
Funktionaliteten hos mikroelektrodmatriser i Michigan-stil efter beläggningsprocesserna bedömdes med hjälp av elektrisk impedansspektroskopi (EIS)50. EIS spelades in för totalt 20 mikroelektrodkanaler över två enheter. Kanalerna som ingick i testet valdes slumpmässigt och fördelades jämnt mellan de två enheterna (10 kanaler / enhet). Mätningarna gjordes med hjälp av en potentiostat med en treelektrodinställning. Mätningarna slutfördes för varje kanal tre gånger före beläggningsprocessen och tre gånger efter beläggningsprocessen. Impedansstorleken vid 1 kHz var 238 ± 10,22 kΩ respektive 237 ± 9,81 kΩ före respektive efter beläggningsprocessen. Ett parvis t-test valdes för att avgöra om beläggningsprocessen påverkade kanalimpedansen53. Enhetens impedansmätningar uppvisar signifikant varians; Således kan en analys på enhetsnivå förlora en effekt av beläggningen inom bruset från tillverkningsvariabiliteten. Ett parvis t-test mellan kanalernas impedansstorlekar vid 1 kHz före och efter beläggningsprocessen indikerade ingen statistisk skillnad (p > 0,937). Bode-diagrammet för en testad enhet finns i figur 8, som visar resultaten av 10-kanalsinspelningar före och efter behandlingen. Bilder av elektroduppsättningen före och efter beläggningsprocessen finns i figur 9. Ytterligare information om de instrumentella detaljerna för materialanalyserna finns i tilläggsfil 1.
Figur 8: Bodediagram som visar genomsnittliga elektrokemiska impedansmätningar över en testad enhet (10 kanaler) före (grå) och efter (röd) beläggningsproceduren. Staplarna representerar medelvärdets standardfel. Impedansstorleken minskade med ökande frekvens. Fasvinkeln minskade med ökande frekvens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Bilder av elektroduppsättningen före (överst) och efter (botten) beläggningsprocessen. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfil 1: Instrumentella detaljer för materialanalyser. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfiler 1-16: Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det beskrivna protokollet var utformat för ytbehandling av kiselplanära mikroelektrodmatriser. De 3D-tryckta verktygen är anpassade till mikroelektrodmatriser i Michigan-stil med lågprofilkontakter50. Icke-funktionella sonder monterades genom att fästa en kiselsond på 3D-tryckta flikar med hjälp av ett biokompatibelt lim. De 3D-tryckta flikarna designades med liknande dimensioner som kontakterna som ingår i de kommersiellt tillgängliga enheterna som används. Filer för de 3D-utskrivna flikarna är tillgängliga som kompletterande kodningsfil 15, kompletterande kodningsfil 16. Akrylnitrilbutadienstyrenfilament (ABS) användes för att konstruera de 3D-tryckta bitarna. Om så önskas kan polymjölksyrafilament (PLA) också användas för att konstruera verktygen. En 24-brunnsplatta användes för ytreaktionen med den vattenhaltiga lösningen med ett brunnsdjup av 17,4 mm. Vid anpassning av protokollet till alternativa enheter måste typen av elektrod (kontaktens dimensioner, skaftets längd), upplösningen på den använda 3D-skrivaren och filamentets kemiska kompatibilitet beaktas.
Standardtekniker för att analysera ytbehandlingar är omöjliga att utföra på monterade enheter på grund av testernas storlek och / eller destruktiva natur. För att erhålla representationer av ytbehandlingen på kiselplanära mikroelektrodmatriser kan prover av kisel av enhetskvalitet behandlas tillsammans med funktionella enheter för senare analys. Om en annan enhet används måste provmaterialet matcha det för enhetens substrat. Även om den är indirekt möjliggör denna metod kvalitetskontroller mellan batchbehandlingar. Det 3D-tryckta verktyget för gasfasdeposition innehåller funktioner som rymmer kvadratiska prover för att säkerställa tillräckliga ytdepositionsförhållanden. Funktionerna som håller de fyrkantiga proverna har en slits på 1 mm för att infoga proverna. Kiselproverna som används i det presenterade arbetet är 525 μm tjocka. Om alternativt provmaterial önskas och är tjockare än 1 mm måste justeringar göras i de medföljande filerna. Figur 1 illustrerar aggregatets komponenter för gasfasdeposition. Figur 2 visar monteringskomponenterna för den vattenhaltiga lösningsreaktionen i en 24-brunnsplatta.
Anpassningen av immobiliseringsmetoden för MnTBAP som beskrivs av Potter-Baker m.fl. användes för att demonstrera nyttan av de presenterade verktygen40. Dessa experiment slutfördes med hjälp av kommersiellt tillgängliga mikroelektrodmatriser i Michigan-stil och kiselkvadratprover för att möjliggöra materialanalys av beläggningsmetoden. För att bekräfta närvaron av APTES utfördes ellipsometri och röntgenfotoelektronspektroskopi (XPS) på kiselkvadratproverna. Ellipsometrimätningar visade en ökning av provtjockleken som motsvarar den förväntade APTES-avsättningen. XPS-analysen som utfördes på proverna visade en ökning av procentandelen av atomkoncentrationerna av kväve och kol, vilket indikerar APTES-avsättningen. XPS-analysen visade en frånvaro av mangan som föregick immobiliseringsprocessen för lösningsfasen, följt av närvaron av mangan. Dessa uppgifter tillsammans togs som motivering för beläggningens existens. I detta skede är enheterna redo för in vitro- och in vivo-testning. Till exempel kan in vivo-experiment som implanterar produkterna på gnagare utföras för att möjliggöra registreringsanalys och immunohistokemifärgning för att bestämma beläggningens effekt på produktens prestanda36,40.
Att förbättra intracortical microelectrode in vivo-prestanda är nödvändigt för att tekniken ska kunna utvecklas i klinisk användning. Pågående forskningsinsatser syftar till att belysa och lindra processerna bakom enhetsfel54. Ett betydande område av denna forskning syftar till att mildra skadligt vävnadssvar på implantation av kronisk enhet 7,55,56,57. Fokusering på gränssnittet mellan enheten och vävnaden möjliggör riktad behandling av den drabbade vävnaden 58,59. Flera ytmodifieringar av intrakortikala mikroelektroder har och fortsätter att utforskas 60,61,62,63.
Det presenterade förfarandet erbjuder metoder för att applicera ytbehandlingar som involverar gasfasavsättning och vattenlösningsreaktion på monterade anordningar. I utvecklingen av ytbehandlingar innebär översättningen till funktionella enheter flera hanteringsproblem64. Med tanke på bräckligheten och kostnaden för de funktionella mikroelektrodmatriserna underlättar de presenterade verktygen i hög grad underhållet av enhetens integritet under behandlingar6. Säkra hanteringsmetoder är relevanta i modifieringsprocedurer som inträffar under längre perioder och inkluderar flera steg. Funktionaliserande ytor som involverar filmavlagringar och molekylimmobilisering kan inkludera flera omgångar av processer med total inkubationstid som överstiger flera timmar 23,24,40,60. Metoder för hantering av funktionella mikroelektrodmatriser har ännu inte rapporterats i detalj. Den presenterade rapporten avser att redovisa en hanteringsmetod i detalj.
Forskningsinsatser för att förbättra intracortical microelectrode array prestanda genom utveckling av ytbehandlingar och beläggningar kan dra nytta av att säkert applicera behandlingar med hjälp av dessa verktyg. Medan de är utformade för ytbehandling av kiselplanära enheter modellerade för de beskrivna mikroelektrodmatriserna i Michigan-stil, är filerna tillgängliga för att anpassa de 3D-tryckta bitarna för alternativa enheter. När du gör justeringar bör du tänka på enhetens dimensioner, upplösningen på den använda 3D-skrivaren och den kemiska kompatibiliteten.
Begränsningar av det detaljerade tillvägagångssättet ska åtgärdas när man bestämmer den lämpligaste metoden för alla anpassade ytmodifieringsprotokoll. De 3D-tryckta bitarna är anpassade och kräver tid och åtkomst för att göras. Dessutom var bitarna utformade för en viss stil av mikroelektroduppsättningen. Således kommer justeringar av de 3D-tryckta bitarna att vara nödvändiga för att rymma alternativa enheter och motsvarande kontaktförpackning. Slutligen har protokollen som beskrivs här inte utvärderats för kompatibilitet med olika metallkontakter eller organiskt baserade ledande polymerer som är relevanta för andra enhetskonstruktioner. För att säkerställa absolut produktintegritet och forskarsäkerhet måste reagenser som används för reaktionskemi beaktas.
Sammanfattningsvis har ett robust protokoll presenterats som möjliggör ytmodifieringar av funktionella neurala elektroder samtidigt som risken för att äventyra enhetens integritet minimeras. Metoden kan fungera som en plattform för ytterligare modifieringar av liknande eller alternativa enhetsklasser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Innehållet representerar inte åsikterna från US Department of Veterans Affairs, National Institutes of Health eller USA: s regering.
Acknowledgments
Denna studie stöddes delvis av Merit Review Award IRX002611 (Capadona) och Research Career Scientist Award IK6RX003077 (Capadona) från USA :s (USA) Department of Veterans Affairs Rehabilitation Research and Development Service. Dessutom stöddes detta arbete delvis av National Institute of Health, National Institute of Neurological Disorders and Stroke R01NS110823 (Capadona / Pancrazio) och National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (Krebs).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide methiodide (EDC) | Sigma-Aldrich | 165344-1G | Solid, stored desiccated at -20 °C |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 18 Pound Solid Nylon Cable/Zip Ties | Cole-Parmer | EW-06830-66 | Length 4 inches |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | 4432-31-9 | Solid |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 440140-100ML | Liquid, container with Sure/Seal |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-103 | |
| Aluminum weighing dishes | Fisher Scientific | 08-732-102 | Diameter 66 mm |
| Bel-Art Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15B | |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Millipore Sigma | CLS3527-100EA | 24-well plate, polystyrene |
| Cyanoacrylate Adhesive | LocTite | N/A | |
| Digital Microscope | Keyence | VHX-S750E | |
| Disco DAD3350 Dicing Saw | Disco | DAD3350 | Used to cut silicon wafer into 1 cm x 1 cm samples |
| Double-Sided Polyimide Tape | Kapton Tape | PPTDE-1/4 | ¼” x 36 yds. |
| EP21LVMed – low viscosity, two component epoxy compound | Masterbond | EP21LVMed | Meets USP Class VI certification, Passes ISO 10993-5 for cytotoxicity |
| Epilog Fusion Pro 48 Laser Machine | Epilog | N/A | CO2 laser |
| Foam tape | XFasten | N/A | 1/8" Thick |
| Gamry Interface 1010E Potentiostat | Gamry | 992-00129 | |
| High precision 45° curved tapered very fine point tweezers/forceps | Fisher Scientific | 12-000-131 | |
| Lab tape | Fisher Scientific | 15-901-10L | |
| Mn(III)tetrakis (4-benzoic acid) porphyrin (MnTBAP) | EMD Millipore | 475870-25MG | Solid, stored at -20 °C |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | 56485-250MG | Solid, stored desiccated at 4°C |
| Platinum clad niobium mesh anode | Technic | N/A | Clad with 125μ” of platinum on one side, framed in titanium with (1) 1” x 6” titanium strap centered on one 6” dimension |
| Silicon Planar Microelectrode Array, 16 Channel | NeuroNexus | A1x16-3mm-100-177-CM16LP | Electrode site material is iridium, shank thickness is 15 μm |
| Silicon Wafer | University Wafer | 1575 | Diameter 100 mm, p-type, boron-doped, 100 oriented, resistivity 0.01-0.02 Ohm-cm, thickness 525 um, single side polished, prime grade |
| Silver/silver Chloride reference electrode | Gamry Instruments | 930-00015 | |
| Solidworks | N/A | ||
| Stainless Steel Phillips Flat Head Screws | McMaster Carr | 96877A629 | #8-32, 1 1/2", fully threaded |
| Type I deionized water | ChemWorld | CW-DI1-20 | |
| Ultimaker 3 3D printer | Ultimaker | N/A | |
| Ultimaker Cura | Ultimaker | N/A | 3D printing software |
| Ultimaker NFC ABS Filament | Dynamism, Inc. | 1621 | 2.85 mm |
| Ultimaker NFC PLA Filament | Dynamism, Inc. | 1609 | 2.85 mm |
| Vacuum Gauge Vacuum Gauge | Measureman Direct | N/A | Glycerin Filled, 2-1/2” Dial Size, ¼”NPT, -30” Hg/-100kpa-0 |
| Wing nuts | Everbilt | 934917 | #8-32, zinc plated |
References
- Donoghue, J. Bridging the brain to the world: A perspective on neural interface systems. Neuron. 60 (3), 511-521 (2008).
- Ajiboye, A. B., et al. Restoration of reaching and grasping movements through brain-controlled muscle stimulation in a person with tetraplegia: a proof-of-concept demonstration. The Lancet. 398 (10081), 1821-1830 (2017).
- Ereifej, E. S., et al. Neural engineering: the process, applications, and its role in the future of medicine. Journal of Neural Engineering. 16 (6), 063002 (2019).
- Nicolas-Alonso, L. F., Gomez-Gil, J. Brain computer interfaces, a review. Sensors (Basel). 12 (2), 1211-1279 (2012).
- Leuthardt, E. C., Schalk, G., Moran, D., Ojemann, J. G. The emerging world of motor neuroprosthetics: a neurosurgical perspective. Neurosurgery. 59 (1), 1-14 (2006).
- Barrese, J. C., et al. Failure mode analysis of silicon-based intracortical microelectrode arrays in non-human primates. Journal of Neural Engineering. 10 (6), 066014 (2013).
- Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications. Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001 (2015).
- Prasad, A., et al. Comprehensive characterization and failure modes of tungsten microwire arrays in chronic neural implants. Journal of Neural Engineering. 9 (5), 056015 (2012).
- Hermann, J. K., Capadona, J. R. Understanding the role of innate immunity in the response to intracortical microelectrodes. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 46 (4), 341-367 (2018).
- Ravikumar, M., et al. The roles of blood-derived macrophages and resident microglia in the neuroinflammatory response to implanted intracortical microelectrodes. Biomaterials. 35 (28), 8049-8064 (2014).
- Sawyer, A. J., et al. The effect of inflammatory cell-derived MCP-1 loss on neuronal survival during chronic neuroinflammation. Biomaterials. 35 (25), 6698-6706 (2014).
- Prasad, A., Sanchez, J. C. Quantifying long-term microelectrode array functionality using chronic in vivo impedance testing. Journal of Neural Engineering. 9 (2), 026028 (2012).
- Salatino, J. W., Ludwig, K. A., Kozai, T. D. Y., Purcell, E. K. Glial responses to implanted electrodes in the brain. Nature Biomedical Engineering. 1 (11), 862-877 (2017).
- McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 056003 (2009).
- Rennaker, R. L., Miller, J., Tang, H., Wilson, D. A. Minocycline increases quality and longevity of chronic neural recordings. Journal of Neural Engineering. 4 (2), 1-5 (2007).
- Carnicer-Lombarte, A., Chen, S. T., Malliaras, G. G., Barone, D. G. Foreign body reaction to implanted biomaterials and its impact in nerve neuroprosthetics. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 622524 (2021).
- Roitbak, T., Sykova, E. Diffusion barriers evoked in the rat cortex by reactive astrogliosis. Glia. 28 (1), 40-48 (1999).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
- Cui, X., Martin, D. C. Electrochemical deposition and characterization of poly(3,4-ethylenedioxythiophene) on neural microelectrode arrays. Sensors and Actuators B: Chemical. 89 (1), 92-102 (2003).
- Ludwig, K. A., Uram, J. D., Yang, J., Martin, D. C., Kipke, D. R. Chronic neural recordings using silicon microelectrode arrays electrochemically deposited with a poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) film. Journal of Neural Engineering. 3 (1), 59-70 (2006).
- Keefer, E. W., Botterman, B. R., Romero, M. I., Rossi, A. F., Gross, G. W. Carbon nanotube coating improves neuronal recordings. Nature Nanotechnology. 3 (7), 434-439 (2008).
- Kim, D. -H., Wiler, J. A., Anderson, D. J., Kipke, D. R., Martin, D. C. Conducting polymers on hydrogel-coated neural electrode provide sensitive neural recordings in auditory cortex. Acta Biomaterialia. 6 (1), 57-62 (2010).
- He, W., McConnell, G. C., Bellamkonda, R. V. Nanoscale laminin coating modulates cortical scarring response around implanted silicon microelectrode arrays. Journal of Neural Engineering. 3 (4), 316-326 (2006).
- Azemi, E., Lagenaur, C. F., Cui, X. T. The surface immobilization of the neural adhesion molecule L1 on neural probes and its effect on neuronal density and gliosis at the probe/tissue interface. Biomaterials. 32 (3), 681-692 (2011).
- Zhong, Y., Bellamkonda, R. V. Controlled release of anti-inflammatory agent alpha-MSH from neural implants. Journal of Controlled Release. 106 (3), 309-318 (2005).
- Shoffstall, A. J., et al. Potential for thermal damage to the blood-brain barrier during craniotomy: implications for intracortical recording microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 034001 (2018).
- Bedell, H. W., et al. Understanding the effects of both CD14-meditated innate immunity and device/tissue mechanical mismatch in the neuroinflammatory response to intracortical microelectrodes. Frontiers in Neuroscience. 12, 772 (2018).
- Nguyen, J. K., et al. Influence of resveratrol release on the tissue response to mechanically adaptive cortical implants. Acta Biomaterialia. 29, 81-93 (2016).
- Sridharan, A., Nguyen, J. K., Capadona, J. R., Muthuswamy, J. Compliant intracortical implants reduce strains and strain rates in brain tissue in vivo. Journal of Neural Engineering. 12 (3), 036002 (2015).
- Nguyen, J. K., et al. Mechanically-compliant intracortical implants reduce the neuroinflammatory response. Journal of Neural Engineering. 11, 056014 (2014).
- Harris, J. P., et al. In vivo deployment of mechanically adaptive nanocomposites for intracortical microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 8 (4), 046010 (2011).
- Shoffstall, A. J., et al. Characterization of the neuroinflammatory response to Thiol-ene/Acrylate shape memory polymer coated intracortical microelectrodes. Micromachines. 10, 486 (2018).
- Simon, D. M., et al. Design and demonstration of an intracortical probe technology with tunable modulus. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 105 (1), 159-168 (2017).
- Ravikumar, M., et al. The effect of residual endotoxin contamination on the neuroinflammatory response to sterilized intracortical microelectrodes. Journal of Materials Chemistry. B. 2 (17), 2517-2529 (2014).
- Ecker, M., et al. Sterilization of thiol-ene/acrylate based shape memory polymers for biomedical applications. Macromolecular Materials and Engineering. 302 (2), 160331 (2017).
- Ereifej, E. S., et al. Implantation of neural probes in the brain elicits oxidative stress. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (9), 1-12 (2018).
- Potter, K. A., et al. The effect of resveratrol on neurodegeneration and blood brain barrier stability surrounding intracortical microelectrodes. Biomaterials. 34 (29), 7001-7015 (2013).
- Potter, K. A., et al. Curcumin-releasing mechanically adaptive intracortical implants improve the proximal neuronal density and blood-brain barrier stability. Acta Biomaterialia. 10 (5), 2209-2222 (2014).
- Potter-Baker, K. A., Capadona, J. R. Reducing the "stress": Antioxidative therapeutic and material approaches may prevent intracortical microelectrode failure. ACS Macro Letters. 4 (3), 275-279 (2015).
- Potter-Baker, K. A., et al. Development of superoxide dismutase mimetic surfaces to reduce accumulation of reactive oxygen species for neural interfacing applications. Journal of Materials Chemistry B. 2 (16), 2248-2258 (2014).
- Potter-Baker, K. A., et al. Implications of chronic daily antioxidant administration on the inflammatory response to intracortical microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 12 (4), 046002 (2015).
- Kim, Y., et al. Ventricular delivery of resveratrol improves microelectrode recording performance and reduces oxidative stress. Micromachines. 12, 1446 (2021).
- Deku, F., et al. Amorphous silicon carbide ultramicroelectrode arrays for neural stimulation and recording. Journal of Neural Engineering. 15 (1), 016007 (2018).
- Ereifej, E. S., et al. The neuroinflammatory response to nanopatterning parallel grooves into the surface structure of intracortical microelectrodes. Advanced Functional Materials. 28 (12), 1704420 (2018).
- Kim, Y., et al. Nano-architectural approaches for improved intracortical interface technologies. Frontiers in Neuroscience. 12, 456 (2018).
- Mahajan, S., et al. Towards standardization of electrophysiology and computational tissue strain in rodent intracortical microelectrode models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 416 (2020).
- Suresh, M. V., et al. The protective role of MnTBAP in oxidant-mediated injury and inflammation in a rat model of lung contusion. Surgery. 154 (5), 980-990 (2013).
- Liu, D., Shan, Y., Valluru, L., Bao, F. Mn (III) tetrakis (4-benzoic acid) porphyrin scavenges reactive species, reduces oxidative stress, and improves functional recovery after experimental spinal cord injury in rats: comparison with methylprednisolone. BMC Neuroscience. 14 (1), 23 (2013).
- Munief, W. M., et al. Silane deposition via gas-phase evaporation and high-resolution surface characterization of the ultrathin siloxane coatings. Langmuir. 34 (35), 10217-10229 (2018).
- Hoogerwerf, A. C., Wise, K. D. A three-dimensional microelectrode array for chronic neural recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 41 (12), 1136-1146 (1994).
- Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analalytical Biochemistry. 156 (1), 220-222 (1986).
- Yuan, X., Wolf, N., Mayer, D., Offenhausser, A., Wordenweber, R. Vapor-phase deposition and electronic characterization of 3-Aminopropyltriethoxysilane self-assembled monolayers on silicon dioxide. Langmuir. 35 (25), 8183-8190 (2019).
- Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. Eighth edition. , John Wiley & Sons, Inc. (2013).
- Shoffstall, A. J., Capadona, J. R. Bio-inspired materials and systems for neural interfacing. Current Opinions in Biomedical Engineering. 6, 110-119 (2018).
- Skousen, J. L., Tresco, P. A. Neuroprosthetics. Theory and Practice 2nd Edition. , 259-299 (2017).
- Michelson, N. J., et al. multi-modal analysis uncovers complex relationship at the brain tissue-implant neural interface: new emphasis on the biological interface. Journal of Neural Engineering. 15 (3), 033001 (2018).
- Hofmann, U. G., Capadona, J. R. Editorial: Bridging the gap in neuroelectronic interfaces. Frontiers in Neuroscience. 14, 457 (2020).
- Usoro, J., Sturgill, B., Musselman, K., Capadona, J. R., Pancrazio, J. J. On the definition of 'chronic' for intracortical microelectrode array applications. Micromachines. 12 (8), 972 (2021).
- Thompson, C. H., Saxena, A., Heelan, N., Salatino, J., Purcell, E. K. Spatiotemporal patterns of gene expression around implanted silicon electrode arrays. Journal of Neural Engineering. 18 (4), 1741 (2021).
- Golabchi, A., Woeppel, K. M., Li, X., Lagenaur, C. F., Cui, X. T. Neuroadhesive protein coating improves the chronic performance of neuroelectronics in mouse brain. Biosensors and Bioelectronics. 155, 112096 (2020).
- Zheng, X. S., et al. A superoxide scavenging coating for improving tissue response to neural implants. Acta Biomaterialia. 99, 72-83 (2019).
- Lee, H. C., et al. Foreign body response to intracortical microelectrodes is not altered with dip-coating of Polyethylene Glycol (PEG). Frontiers in Neuroscience. 11, 513 (2017).
- Boehler, C., et al. Actively controlled release of Dexamethasone from neural microelectrodes in a chronic in vivo study. Biomaterials. 129, 176-187 (2017).
- Hess, A. E., et al. Development of a stimuli-responsive polymer nanocomposite toward biologically optimized, MEMS-based neural probes. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (5), 054009 (2011).
