Summary

Déchiffrer le mécanisme moléculaire de l’assemblage des histones par la technique du rideau d’ADN

Published: March 09, 2022
doi:

Summary

Le rideau d’ADN, une technique d’imagerie à haut débit d’une seule molécule, fournit une plate-forme pour la visualisation en temps réel de diverses interactions protéine-ADN. Le présent protocole utilise la technique du rideau d’ADN pour étudier le rôle biologique et le mécanisme moléculaire d’Abo1, une ATPase AAA+ contenant du bromodomaine de Schizosaccharomyces pombe .

Abstract

La chromatine est une structure d’ordre supérieur qui emballe l’ADN eucaryote. La chromatine subit des altérations dynamiques en fonction de la phase du cycle cellulaire et en réponse à des stimuli environnementaux. Ces changements sont essentiels à l’intégrité génomique, à la régulation épigénétique et aux réactions métaboliques de l’ADN telles que la réplication, la transcription et la réparation. L’assemblage de la chromatine est crucial pour la dynamique de la chromatine et est catalysé par les chaperons des histones. Malgré des études approfondies, les mécanismes par lesquels les chaperons histones permettent l’assemblage de la chromatine restent insaisissables. De plus, les caractéristiques globales des nucléosomes organisés par des chaperons d’histones sont mal comprises. Pour résoudre ces problèmes, ce travail décrit une technique unique d’imagerie à molécule unique appelée rideau d’ADN, qui facilite l’étude des détails moléculaires de l’assemblage des nucléosomes par les chaperons d’histones. Le rideau d’ADN est une technique hybride qui combine la fluidité des lipides, la microfluidique et la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRFM) pour fournir une plate-forme universelle pour l’imagerie en temps réel de diverses interactions protéine-ADN. À l’aide d’un rideau d’ADN, la fonction chaperon des histones d’Abo1, l’ATPase AAA+ contenant des bromodomaines contenant des pombes de Schizosaccharomyces , est étudiée, et le mécanisme moléculaire sous-jacent à l’assemblage des histones d’Abo1 est révélé. Le rideau d’ADN offre une approche unique pour l’étude de la dynamique de la chromatine.

Introduction

L’ADN eucaryote est emballé dans une structure d’ordre supérieur connue sous le nom de chromatine 1,2. Le nucléosome est l’unité fondamentale de la chromatine, qui se compose d’environ 147 pb d’ADN enroulé autour des histones octamères 3,4. La chromatine joue un rôle essentiel dans les cellules eucaryotes ; par exemple, la structure compacte protège l’ADN des facteurs endogènes et des menaces exogènes5. La structure de la chromatine change dynamiquement en fonction de la phase du cycle cellulaire et des stimuli environnementaux, et ces changements contrôlent l’accès aux protéines lors des transactions de l’ADN telles que la réplication, la transcription et la réparation6. La dynamique de la chromatine est également importante pour la stabilité génomique et l’information épigénétique.

La chromatine est régulée dynamiquement par divers facteurs, y compris les modifications de la queue des histones et les organisateurs de la chromatine tels que les remodeleurs de chromatine, les protéines du groupe polycomb et les chaperons d’histones7. Les chaperons histones coordonnent l’assemblage et le désassemblage des nucléosomes par dépôt ou détachement des histones centrales 8,9. Les défauts dans les chaperons d’histones induisent une instabilité du génome et provoquent des troubles du développement et des cancers 9,10. Divers chaperons d’histones n’ont pas besoin de consommation d’énergie chimique comme l’hydrolyse de l’ATP pour assembler ou désassembler les nucléosomes 9,11,12,13. Récemment, des chercheurs ont rapporté que les ATPases AAA+ (ATPase associées à diverses activités cellulaires) contenant des bromodomaines jouent un rôle dans la dynamique de la chromatine en tant que chaperons d’histones 14,15,16,17. L’ATAD2 humain (protéine 2 contenant le domaine AAA de la famille des ATPase) favorise l’accessibilité de la chromatine pour améliorer l’expression des gènes18. En tant que co-régulateur transcriptionnel, l’ATAD2 régule la chromatine des facteurs transcriptionnels oncogènes14, et la surexpression d’ATAD2 est liée à un mauvais pronostic dans de nombreux types de cancer19. Yta7, l’homologue de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) d’ATAD2, diminue la densité des nucléosomes dans la chromatine15. En revanche, Abo1, l’homologue Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) d’ATAD2, augmente la densité des nucléosomes16. À l’aide d’une technique unique d’imagerie à molécule unique, le rideau d’ADN, la question de savoir si Abo1 contribue à l’assemblage ou au désassemblage des nucléosomes est abordée17,20.

Traditionnellement, les propriétés biochimiques des biomolécules ont été examinées par des expériences en masse telles que le test de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) ou la co-immunoprécipitation (co-IP), dans lesquelles un grand nombre de molécules sont sondées, et leurs propriétés moyennes sont caractérisées21,22. Dans les expériences en vrac, les sous-états moléculaires sont voilés par l’effet d’ensemble-moyenne, et l’exploration des interactions biomoléculaires est limitée. En revanche, les techniques à molécule unique contournent les limites des expériences en vrac et permettent la caractérisation détaillée des interactions biomoléculaires. En particulier, les techniques d’imagerie à molécule unique ont été largement utilisées pour étudier les interactions ADN-protéine et protéine-protéine23. L’une de ces techniques est le rideau d’ADN, une technique unique d’imagerie à molécule unique basée sur la microfluidique et la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRFM)24,25. Dans un rideau d’ADN, des centaines de molécules d’ADN individuelles sont ancrées à la bicouche lipidique, ce qui permet le mouvement bidimensionnel des molécules d’ADN en raison de la fluidité lipidique. Lorsque l’écoulement hydrodynamique est appliqué, les molécules d’ADN se déplacent le long de l’écoulement sur la bicouche et restent coincées à une barrière de diffusion, où elles sont alignées et étirées. Alors que l’ADN est coloré avec des agents intercalants, des protéines marquées par fluorescence sont injectées, et TIRFM est utilisé pour visualiser les interactions protéine-ADN en temps réel au niveau d’une seule molécule23. La plate-forme de rideau d’ADN facilite l’observation des mouvements des protéines tels que la diffusion, la translocation et la collision 26,27,28. De plus, le rideau d’ADN peut être utilisé pour la cartographie des protéines sur l’ADN avec des positions, des orientations et des topologies définies ou appliqué à l’étude de la séparation de phase des protéines et des acides nucléiques 29,30,31.

Dans ce travail, la technique du rideau d’ADN est utilisée pour fournir des preuves de la fonction des chaperons grâce à la visualisation directe de protéines spécifiques. De plus, comme DNA curtain est une plate-forme à haut débit, elle facilite une collecte de données suffisante pour assurer la fiabilité statistique. Ici, il est décrit comment effectuer le test de rideau d’ADN en détail pour étudier le rôle moléculaire de l’AAA+ ATPase Abo1 contenant du bromodomaine de S. pombe .

Protocol

1. Préparation de la cellule d’écoulement Préparer une lame de silice fondue nettoyée contenant des motifs de nano-tranchées à la suite du rapport25 publié précédemment.Percez deux trous de 1 mm de diamètre dans une lame de silice fondue nettoyée (figure 1A) à l’aide d’un foret diamanté (voir tableau des matériaux). Déposer 250 nm d’aluminium épais (Al) sur la lame à l’aide d’u…

Representative Results

Ce travail décrit la procédure de préparation des cellules en flux pour le test de rideau d’ADN (Figure 1A). Le test de rideau d’ADN a facilité l’étude de l’assemblage des dimères d’histones H3-H4 sur l’ADN par Abo1. Tout d’abord, la formation d’un rideau d’ADN a été vérifiée en colorant les molécules d’ADN avec YOYO-1, un colorant intercalant. Des lignes vertes ont été montrées dans des réseaux parallèles, indiquant que YOYO-1 s’intercalait en molécule…

Discussion

En tant que technique d’imagerie à molécule unique, le rideau d’ADN a été largement utilisé pour sonder les réactions métaboliques de l’ADN43. Le rideau d’ADN est un système hybride qui concatène la fluidité lipidique, la microfluidique et le TIRFM. Contrairement à d’autres techniques à molécule unique, le rideau d’ADN permet une visualisation en temps réel à haut débit des interactions protéine-ADN. Par conséquent, la technique du rideau d’ADN est adaptée pour son…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs apprécient l’aimable soutien apporté à Abo1 et Cy5-H3-H4 par le professeur Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., et Juwon Jang, Ph.D., à KAIST, en Corée du Sud. Ce travail est soutenu par la subvention de la Fondation nationale de recherche (NRF-2020R1A2B5B01001792), le fonds de recherche intra-muros (1.210115.01) de l’Institut national des sciences et technologies d’Ulsan et l’Institut des sciences fondamentales (IBS-R022-D1).

Materials

1 mL luer-lock syringe BecktonDickinson 301321
1' x 3' fused-silca slide glass G. Finkenbeiner 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness
10 mL luer-lock syringe BecktonDickinson 302149
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) Avanti 850375 This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 Biotinyl cap PE Avanti 870273 This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 PEG2000 PE Avanti 880130 This is a component of biotinylated lipid stock
3 mL luer-lock syringe BecktonDickinson 302832
6-way sample injection valve IDEX MX series II
950K PMMA All-resist 671.04
Acetone SAMCHUN A1759
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma A2383
Aluminum (Al) TASCO, South Korea LT50AI414 Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch
Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa Millipore Z648027
Ampicillin Mbcell MB-A4128 Antibiotics
AZ 300 MIF developer Merck 10454110521 Used for removing aluminum
Blade DORCO DN52 12 mm x 6 m
Boron trichloride (BCl3) UNIONGAS Purity: >99.99%
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
Catalase Sigma C40-1g This is a component of 100x gloxy stock
Chlorine (Cl2) UNIONGAS Purity: >99.99%
Clear double-sided tape 3M 313770
D-(+)-glucose Sigma G7528
DC sputter Sorona SRM-120 Used for deposition aluminum on a slide
Diamond-coated drill bit Eurotool DIB-211.00 Used for making holes in a fusced silica slide
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
Dove-prism Korea Electro-Optics Co. Ltd. 1906-106 Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating
Drill Dremel Dremel 3000 Used for making holes in a fusced silica slide
Electron Bean Lithography Nanobeam Ltd. NB3
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-1KG
Fingertight fittings IDEX F-300 It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Flangeless male nut IDEX P-235 It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Freeze Dryer, HyperCOOL Labogene HC3110 Used for lyophilizing liquid proteins
Glucose oxidase Sigma G2133-50KU This is a component of 100x gloxy stock
Guanidinium hydrochloride Acros Organics 364790025
Hamilton syringe Hamilton Company 80065 This syringe is used for sample injection
Hellmanex III Sigma Z805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg Cytiva 28-9893-36 Used for FPLC (size exclusion)
Hot plate stirrer Corning PC-420D
Hydrochloric acid Sigma H1759 Used for Tris-HCl
Index matching oil ZEISS 444970-9000-000
Inductively coupled plasma-reactive ion etching Top Technology Ltd. FabStar
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Glentham Life Sciences GC6586-100g Used for induction of β-galactosidase activity
Lambda phage DNA NEB N0311
LB broth BD difco 244610 Media for E.coli cell growth
Luer adapter 10-32 IDEX P-659 This connects luer-lock syringe and tubing
Magnesium chloride hexahydrate fisher bioreagents BP214
Methyl isobutyl ketone (MIBK) KAYAKU ADVANCED MATERIALS Used for developing solution
Microscope (Eclipse Ti2) Nikon Eclipse Ti2 Inverted fluorescence microscope
Microscope glass coverslip MARIENFELD 101142 22 x 50 mm (No. 1)
Microscope slide DURAN GROUP DU.2355013 Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm
Nanoport IDEX N-333-01
Objective lens Nikon CFI Plan Apochromat VC 60XC WI Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli Thermo Fisher Scientific C6060-03 Competent cell for overexpressing proteins
Oxygen (O2) NOBLEGAS, South Korea Purity: >99.99%
PFA tubing natural IDEX 1512L It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche 11359061001 Protease inhibitor
Sephacryl S-200 High Resolution Cytiva 17-0584-01 Used for FPLC (size exclusion)
Shut-off valve IDEX P-732
Sodium acetate Sigma 791741
Sodium chloride (NaCl) Sigma S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma s5881
Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa Spectrum laboratories 132660
Streptavidin Thermo Fisher Scientific S888
Sulfur tetralfluoride (SF4) NOBLEGAS, South Korea Purity: >99.99%
Syringe pump KD Scientific 78-8210
Tetrafluoromethane (CF4) NOBLEGAS, South Korea Purity: >99.99%
TritonX-100 Sigma T9284
Trizma base Sigma T1503 Used for Tris-HCl
TSKgel SP-5PW TOSOH 14715 Used for FPLC (ion exchange)
Union assembly IDEX P-760 This connects tubings
Urea Sigma U5378
Vacuum oven Jeio Tech OV-11
YOYO-1 Thermo Fisher Scientific Y3601 This intercalation dye is diluted in DMSO
β-mercaptoethanol (BME) Sigma M6250

References

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Kang, Y., Bae, S., An, S., Lee, J. Y. Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique. J. Vis. Exp. (181), e63501, doi:10.3791/63501 (2022).

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