Summary
Denne protokollen beskriver løsningsmiddelbasert proteinutfelling under kontrollerte forhold for robust og rask gjenvinning og rensing av proteomprøver før massespektrometri.
Abstract
Mens flere fremskritt innen massespektrometri (MS) instrumenter har forbedret kvalitativ og kvantitativ proteomanalyse, er mer pålitelige front-end tilnærminger for å isolere, berike og behandle proteiner foran MS avgjørende for vellykket proteomkarakterisering. Lav, inkonsekvent proteingjenvinning og gjenværende urenheter som overflateaktive stoffer er skadelig for MS-analyse. Proteinutfelling anses ofte som upålitelig, tidkrevende og teknisk utfordrende å utføre sammenlignet med andre prøveprepareringsstrategier. Disse bekymringene overvinnes ved å bruke optimale proteinutfellingsprotokoller. For acetonutfelling er kombinasjonen av spesifikke salter, temperaturkontroll, løsningsmiddelsammensetning og utfellingstid kritisk, mens effektiviteten av kloroform / metanol / vannutfelling avhenger av riktig pipettering og manipulering av hetteglass. Alternativt er disse nedbørsprotokollene strømlinjeformet og halvautomatisert i en engangsspinnpatron. De forventede resultatene av løsningsmiddelbasert proteinutfelling i konvensjonelt format og bruk av en engangs, to-trinns filtrerings- og ekstraksjonspatron er illustrert i dette arbeidet. Dette inkluderer detaljert karakterisering av proteomiske blandinger ved bottom-up LC-MS / MS-analyse. Den overlegne ytelsen til SDS-baserte arbeidsflyter er også demonstrert i forhold til ikke-forurenset protein.
Introduction
Proteomanalyse ved massespektrometri har blitt stadig strengere på grunn av den forbedrede følsomheten, oppløsningen, skannehastigheten og allsidigheten til moderne MS-instrumenter. MS-fremskritt bidrar til større proteinidentifikasjonseffektivitet og mer presis kvantifisering 1,2,3,4,5. Med forbedret MS-instrumentering krever forskere en tilsvarende konsistent front-end prøveprepareringsstrategi som er i stand til kvantitativ utvinning av proteiner med høy renhet på minimal tid på tvers av alle stadier av arbeidsflyten 6,7,8,9,10,11 . For å nøyaktig gjenspeile proteomstatusen til et biologisk system, må proteiner isoleres fra den opprinnelige prøvematrisen på en effektiv og objektiv måte. For dette formål, inkludert et denaturerende overflateaktivt middel, slik som natriumdodecylsulfat (SDS), sikrer effektiv proteinekstraksjon og oppløsning12. SDS forstyrrer imidlertid sterkt elektrosprayionisering, noe som forårsaker alvorlig MS-signalundertrykkelse hvis den ikke elimineres riktig13.
Ulike SDS-uttømmingsstrategier er tilgjengelige for påfølgende proteomanalyse, for eksempel oppbevaring av proteiner over et molekylvekt cutoff filter inneholdt i engangsspinnpatroner 14,15,16. Den filterstøttede prøveprepareringsmetoden (FASP) favoriseres da den effektivt tømmer SDS under 10 ppm, noe som letter optimal MS. Imidlertid er proteinutvinning med FASP variabel, noe som førte til utforskning av andre teknikker. Kromatografiske tilnærminger som selektivt fanger protein (eller overflateaktivt middel) har utviklet seg til forskjellige praktiske patroner eller perlebaserte formater 17,18,19,20,21. Gitt disse enkle og (ideelt) konsistente strategiene for proteinrensing, blir den klassiske tilnærmingen til proteinutfelling med organiske løsningsmidler ofte oversett som en lovende tilnærming til proteinisolasjon. Mens løsningsmiddelutfelling er vist å tømme SDS under kritiske nivåer med hell, har proteinutvinning vært en langvarig bekymring for denne tilnærmingen. Flere grupper har observert en proteinutvinningsskjevhet, med uakseptabelt lave nedbørsutbytter som en funksjon av proteinkonsentrasjon, molekylvekt og hydrofobisitet22,23. På grunn av mangfoldet av nedbørsprotokoller rapportert i litteraturen, ble standardiserte nedbørsforhold utviklet. I 2013 rapporterte Crowell og medarbeidere først avhengigheten av ionstyrke på nedbørseffektiviteten til proteiner i 80% aceton24. For alle undersøkte proteiner ble tilsetningen av opptil 30 mM natriumklorid vist å være avgjørende for å maksimere utbyttet (opptil 100% utvinning). Mer nylig viste Nickerson og medarbeidere at kombinasjonen av enda høyere ionstyrke (opptil 100 mM) med forhøyet temperatur (20 °C) under acetonutfelling ga nær kvantitativ utvinning i 2-5 min25. En liten nedgang i utvinningen av proteiner med lav molekylvekt (LMW) ble observert. Derfor viste en påfølgende rapport fra Baghalabadi og medarbeidere vellykket gjenvinning av LMW-proteiner og peptider (≤5 kDa) ved å kombinere spesifikke salter, spesielt sinksulfat, med et høyere nivå av organisk løsningsmiddel (97% aceton)26.
Mens raffinering av nedbørsprotokollen gir en mer pålitelig proteinrensingsstrategi for MS-basert proteomikk, er suksessen til konvensjonell nedbør avhengig av brukerteknikk. Et hovedmål med dette arbeidet er å presentere en robust nedbørsstrategi som letter isoleringen av proteinpelleten fra den forurensende supernatanten. En engangsfiltreringspatron ble utviklet for å eliminere pipettering ved å isolere aggregert protein over et porøstPTFE-membranfilter 27. MS-forstyrrende komponenter i supernatanten fjernes effektivt i et kort sentrifugeringstrinn med lav hastighet. Engangsfilterpatronen tilbyr også en utskiftbar SPE-patron, som muliggjør påfølgende prøveopprydding etter resolubilisering og valgfri proteinfordøyelse, i forkant av massespektrometri.
En rekke anbefalte arbeidsflyter for proteomutfelling presenteres her, inkludert modifiserte aceton- og kloroform/metanol/vann28-protokoller , i et konvensjonelt (hetteglassbasert) og et halvautomatisk format i en engangs to-tilstandsfiltrerings- og ekstraksjonspatron. De resulterende proteingjenvinningene og SDS-uttømmingseffektivitetene fremheves, sammen med bottom-up LC-MS / MS proteomdekning, for å demonstrere det forventede resultatet fra hver protokoll. De praktiske fordelene og ulempene forbundet med hver tilnærming diskuteres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Materielle hensyn og prøveforberedelse
- Bruk bare løsemidler med høy renhet (aceton, kloroform, metanol) (>99,5%) og kjemikalier, fri for overflødig fuktighet.
- Forbered natriumklorid- og sinksulfatløsninger (1 M) i vann.
MERK: Saltløsninger kan lagres på ubestemt tid ved romtemperatur, så lenge de er fri for forurensning eller mikrobiell vekst. - Bruk det minste mikrosentrifugehetteglasset av polypropylen (PP) som er tilstrekkelig til å beholde det nødvendige volumet av prøver og løsemidler for å indusere utfelling.
- Sørg for at SDS-konsentrasjonen i prøven som skal utfelles, ikke er større enn 2 % (w/v). Hvis SDS er høyere, fortynn prøven med vann.
- Sørg for en proteinkonsentrasjon mellom 0,01 og 10 g/L for optimal nedbørseffektivitet.
MERK: Den optimale massen for nedbør varierer mellom 1-100 μg protein. - Sørg for at alle løsemidler og løsninger er fri for partikler før bruk. Utfør enten filtreringstrinn (<0,5 μm) eller sentrifugeringstrinn (10 000 x g i 1 minutt ved romtemperatur) for å fjerne uoppløste partikler.
- Hvis reduksjon av disulfidbinding og alkylering er nødvendig, utfør disse trinnene før proteinutfelling. Overskytende reduksjons- og alkyleringsreagenser vil bli fjernet gjennom utfellingsprosessen.
- Utfell proteinene ved å velge og utføre en av protokollene (trinn 2, 3, 4 eller 5).
2. Rask (hetteglassbasert) proteinutfelling med aceton
- Rør 90 μL (partikkelfritt) protein eller proteomoppløsning inn i et PP mikrosentrifugerør. Tilsett deretter 10 μL 1 M vandig NaCl.
MERK: Hvis ionstyrken til proteomekstraktet allerede overstiger 100 mM, er det ikke nødvendig med ekstra salt. - Pipet 400 μL aceton inn i prøven. Sett lokk på hetteglasset og knips forsiktig på hetteglasset for å kombinere oppløsningsvæskene. Kraftig blanding er ikke nødvendig.
MERK: Volumet av protein, salt og aceton kan økes så lenge det relative forholdet mellom hver opprettholdes. - La hetteglasset ruge ved romtemperatur, uforstyrret, i minst 2 minutter.
MERK: Lengre inkubasjoner, inkludert de ved redusert temperatur (f.eks. konvensjonell acetonutfelling benytter utfelling over natten i fryseren), kan føre til dannelse av større (synlige) aggregerte proteinpartikler (figur 1A), som generelt ikke forbedrer total proteingjenvinning. - Etter inkubering, plasser prøver i en sentrifuge, og noter retningen på hetteglasset. Spinn i minimum 2 minutter, ved 10 000 x g eller høyere ved romtemperatur.
- Fjern hetten på hetteglasset og dekanter supernatanten forsiktig ved å sakte snu hetteglasset til en avfallsbeholder. Berør det vendte hetteglasset på et papirhåndkle for å trekke opp gjenværende oppløsningsvæske fra hetteglasset.
FORSIKTIG: Avfallsløsemidler skal oppbevares og kastes i henhold til passende protokoller. - For SDS-holdige prøver, dispenser 400 μL fersk aceton, vær forsiktig så du ikke forstyrrer pelleten.
MERK: Trinn 2.6 er valgfritt.- Sentrifuger prøven umiddelbart (10 000 x g eller mer i 1 minutt ved romtemperatur), og plasser hetteglasset i rotoren i samme retning som det første sentrifugeringet. Deformer vaskeoppløsningsvæsken som beskrevet i trinn 2.5.
- La prøven tørke helt med hetten åpen (~1 min). Sett hetten på hetteglasset og fortsett med slik oppløsning av pellets (trinn 6).
3. Utfelling av peptider med lav molekylvekt (LMW) (ZnSO4 + aceton)
- Dispenser 54 μL proteomekstrakt til et 2 ml PP hetteglass, og tilsett deretter 6 μL 1 M ZnSO4.
MERK: Optimal gjenvinning av LMW-peptider (≤5 kDa) oppnås ved å tilsette aceton til en endelig 97 volumprosent. Forutsatt et 2 ml PP hetteglass, er det maksimale innledende prøvevolumet 54 μL. - Tilsett 1940 μL aceton til en endelig 97 volumprosent. Virvle forsiktig for å blande, og la stå uforstyrret på benken i minimum 2 min.
- Sentrifuge (10 000 x g i 1 minutt ved romtemperatur) og fjern supernatanten ved å snu hetteglasset og deretter berøre hetteglasset til et papirhåndkle.
- For SDS-holdige prøver, dispenser 400 μL fersk aceton, vær forsiktig så du ikke forstyrrer pelleten.
MERK: Trinn 3.4 er valgfritt.- Sentrifuger prøven umiddelbart i henhold til trinn 3.3, og plasser hetteglasset i rotoren i samme retning som det første sentrifugeringet. Dekanter vaskeoppløsningsvæsken som beskrevet i trinn 3.3.
- Re-solubilize den resulterende tørr pellet i et vandig løsningsmiddel med kort virvel eller sonikering (~ 5 min).
4. Proteinutfelling med kloroform/metanol/vann (CMW)
- Dispenser 100 μL av proteinet eller proteomoppløsningen i et PP hetteglass. Tilsett 400 μL metanol, etterfulgt av 100 μL kloroform. Kork hetteglasset og virvelen kort for å blande.
MERK: Ved CMW-nedbør foretrekkes 1,5 ml hetteglass med smal bunn (figur 2A).
FORSIKTIG: Kloroformvæske skal håndteres i en egnet ventilasjonshette. Alle løsningsmidler som kommer i kontakt med kloroform, skal behandles som halogenert avfall når de kastes. - Dispenser raskt 300 μL vann direkte inn i midten av hetteglasset. Hetten på hetteglasset. La prøven sitte uforstyrret på benken i 1 min.
MERK: Oppløsningen vil umiddelbart vises uklar hvit. Unngå å blande hetteglasset etter tilsetning av vann. - Plasser pp-hetteglasset i en sentrifuge og spinn i minst 5 minutter (10 000 x g eller mer ved romtemperatur).
MERK: Når sentrifugert, vil to synlige løsningsmiddellag dannes (topplag = metanol / vann; bunn = kloroform). En fast proteinpellets dannes ved løsningsmiddelgrensesnittet (figur 2A). - Bruk en stor (1 ml) mikropipettespiss og hold hetteglasset på ~45°, og fjern ~700 μL av oppløsningsvæsken fra det øvre laget med jevn hastighet.
- Bruk en mindre (200 μL) mikropipettespiss for å fortsette å fjerne det øvre laget av oppløsningsvæsken fra det ~45° vippede hetteglasset. Rør i én kontinuerlig bevegelse til det øvre laget av oppløsningsvæsken danner en dråpe i hetteglasset.
- Tilsett 400 μL fersk metanol til prøvehetteglasset, uten å forstyrre pelleten, ved å dispensere oppløsningsvæsken ned på siden av hetteglasset.
- Hetten på hetteglasset. Kombiner lagene med oppløsningsvæske ved å vugge hetteglasset forsiktig for å virvle oppløsningsvæskene sammen.
MERK: Det er viktig å unngå å forstyrre pelleten. Hetteglasset skal ikke virvles. - Merk retningen på hetteglasset i rotoren, sentrifuge i minst 10 minutter (10 000 x g ved romtemperatur). Proteinpelleten fester seg til bunnen av hetteglasset (figur 2B).
- Tipp hetteglasset på 45°, med pelleten vendt ned. Plasser pipettespissen langs den øvre kanten av hetteglasset og fjern supernatanten med en 1 ml mikropipettespiss med en langsom, men kontinuerlig hastighet. Oppbevar ~20 μL oppløsningsvæske i hetteglasset.
- Vask proteinpelletsen for SDS-holdige prøver ved sakte å dispensere 400 μL fersk metanol. Hetteglasset skal ikke virvles.
- Fortsett direkte med sentrifugering (10 000 x g i 2 minutter ved temperatur), og plasser hetteglasset i rotoren med samme retning som det første sentrifugeringet.
- Fjern oppløsningsvæsken i henhold til trinn 4.9. La prøven lufttørke i en avtrekksmasse til det gjenværende løsningsmidlet fordamper.
- Se de anbefalte prosedyrene for omstrukturering i trinn 6.
5. Proteinutfelling ved hjelp av en engangsfiltreringspatron
MERK: Hver løsemiddelbaserte utfellingsprotokoll beskrevet i trinn 2-5 kan utføres i en totrinns filtrerings- og ekstraksjonspatron (se Materialtabell).
- Med pluggen festet til den øvre filtreringspatronen (figur 3A), dispenser ønsket volum av det ekstraherte proteomet, saltet og løsningsmidlet som beskrevet i ett av de tre alternativene nedenfor.
- (Alternativ 1) For proteinutfelling med aceton, kombiner 90 μL protein eller proteomoppløsning, 10 μL 1 M vandig NaCl og 400 μL aceton. Rug i minimum 2 min på benken.
MERK: Et synlig bunnfall vil utvikle seg for konsentrerte proteinprøver (1 g/L) (figur 3B). - (Alternativ 2) For LMW-peptidutfelling kombinerer du 15 μL av prøven, 1,5 μL 1 M ZnSO4 og 485 μL aceton. Rug i minimum 2 min på benken.
MERK: En saltkonsentrasjon på 90 mM i den vandige prøven vil ikke påvirke utvinningen i forhold til 100 mM anbefalt i trinn 3. - (Alternativ 3) For CMW-nedbør, tilsett 50 μL proteomekstrakt, 200 μL metanol og 50 μL kloroform. Sett hetten på hetteglasset og virvelen kort for å kombinere.
- Dispenser raskt 150 μL vann direkte inn i midten av hetteglasset. Rug i 1 min på benken.
- (Alternativ 1) For proteinutfelling med aceton, kombiner 90 μL protein eller proteomoppløsning, 10 μL 1 M vandig NaCl og 400 μL aceton. Rug i minimum 2 min på benken.
- Sentrifuge i 2 minutter ved 2 500 x g ved romtemperatur med pluggen fortsatt festet til filtreringspatronen.
- Snu kassetten, skru deretter av og fjern støpselet fra kassettbasen.
- Plasser filtreringspatronen i et rent hetteglass og sett den tilbake i sentrifugen. Spinn i 3 minutter ved 500 x g ved romtemperatur. Kast gjennomstrømningsoppløsningsvæsken fra det nedre hetteglasset.
MERK: Hvis noe oppløsningsmiddel forblir i den øvre filtreringspatronen, gå tilbake til sentrifugen og utfør et ekstra spinn. - Vask proteinpelletsen ved å tilsette 400 μL aceton til filtreringspatronen (for CMW-utfelling, trinn 5.1.3, tilsett 400 μL metanol).
- Sentrifuge i 3 minutter ved 500 x g ved romtemperatur eller til det ikke er noe oppløsningsmiddel igjen i den øvre sylinderampullen.
- Solubiliser nedbørspelleten på nytt som beskrevet i trinn 6.
6. Resolubilisering av proteinpellets
- Fukt membranen ved foten av filtreringspatronen ved å dispensere 2-5 μL isopropanol direkte til membranen umiddelbart før resolubiliseringsprotokollene beskrevet nedenfor.
- Følg en av følgende resolubiliseringsmetoder.
- (Alternativ 1) Tilsett minst 20 μL vandig buffer som inneholder ≥2 % SDS til filtreringskassetten. Cap og virvel kraftig (~ 1 min). Alternativt sonikat (>10 min) for å spre proteinpelleten.
- Varm opp prøven til 95 °C i 5 minutter). Gjenta blandingstrinnet etter oppvarming.
MERK: Laemmli gelbelastningsbuffer kan oppløse proteinpelleten på nytt. Imidlertid er SDS-holdige prøver uforenlige med trypsinfordøyelse og reversert fase LC og MS.
- Varm opp prøven til 95 °C i 5 minutter). Gjenta blandingstrinnet etter oppvarming.
- (Alternativ 2) Klargjør en oppløsning av 80 % (v/v) maursyre i vann. Prechill syreoppløsningen (-20 ° C), samt filtreringspatronen som inneholder utfelt protein.
- Dispenser 50 μL kald maursyre i patronen; hette og virvel i 30 s. Sett tilbake i fryseren (-20 °C) i 10 minutter.
- Vortex patronen igjen i 30 s. Gjenta deretter avkjølings- og blandingssyklusen en gang til (10 min, -20 °C, 30 s virvel).
- Tilsett vann til en endelig 500 μL, fortynn maursyren til 8%.
MERK: Den kalde maursyreprotokollen er uforenlig med påfølgende trypsinfordøyelse, men er kompatibel med LC-MS.
- (Alternativ 3) Tilsett 50 μL nytilberedt 8 M urea i vann til filtreringspatronen. Sonikere i 30 min.
- La sylinderampullen ruge på benken i 1 time (opptil over natten).
- Fortynn 8 M urea minst 5 ganger med vann eller passende buffer.
MERK: Når den er fortynnet, er urea-oppløsningsprotokollen kompatibel med påfølgende trypsinfordøyelse, samt LC-MS.
- (Alternativ 1) Tilsett minst 20 μL vandig buffer som inneholder ≥2 % SDS til filtreringskassetten. Cap og virvel kraftig (~ 1 min). Alternativt sonikat (>10 min) for å spre proteinpelleten.
7. Protein fordøyelse
- For bottom-up MS-analyse, underlagt de re-solubiliserte proteiner til enzymatisk fordøyelse ved hjelp av en av de to metodene nevnt nedenfor.
- (Alternativ 1) Ved resolubilisering av maursyre reduseres startvolumet på 80 % maursyre i trinn 6.2.2.1 til 25 mikroliter. I trinn 6.2.2.3 skal 375 mikroliter vann fortynne maursyren til 5 % (v/v).
- Dispenser pepsin i sylinderampullen i et omtrentlig forhold mellom protein og enzym på 50:1. Med en plugg festet til filtreringspatronen, inkuber prøven over natten ved romtemperatur.
- (Alternativ 2) For resolubilisering i urea, sørg for en pH mellom 8 og 8,3 med inkludering av 100 mM Tris eller ammoniumbikarbonat i trinn 6.2.3.2.
- Tilsett trypsin i et omtrentlig protein til enzymmasseforhold på 50: 1. Med en plugg festet til sylinderampullen inkuberes prøven over natten i et varmtvannsbad ved 37 °C.
- Avslutt fordøyelsen ved å forsure løsningen med 10% TFA til en endelig 1%.
- Gjenopprett det pepsin- eller trypsinfordøyde proteinet ved å fjerne pluggen fra filterbunnen og sentrifugere sylinderampullen i et rent hetteglass (2 min, 5000 x g, romtemperatur).
8. SPE opprydding
MERK: For ytterligere prøveavsalting etter fordøyelse eller løsemiddelutveksling, kan prøven bli gjenstand for reversert faseopprydding som beskrevet.
- Prime en SPE-patron (se materialtabell) ved å passere 300 μL metanol (2 min, 400 x g) etterfulgt av 300 μL 5% acetonitril / 0,1% TFA (2 min, 400 x g).
- Koble den primede SPE-patronen til bunnen av filtreringspatronen som inneholder re-solubilisert eller fordøyd protein.
- Spinn proteinet gjennom SPE-sylinderampullen (5 min, 800 x g ved romtemperatur). Hvis oppløsningsvæsken forblir i den øvre sylinderampullen, sett sylinderampullen tilbake til sentrifugen og gjenta sentrifugen.
MERK: Hvis prøven sendes gjennom SPE-kassetten en gang til, kan det øke utvinningen. - Tilsett 300 μL 5 % acetonitril/0,1 % TFA i vann til sylinderampullen. For å vaske, flyt gjennom SPE-kassetten (2 min, 2000 x g). Kast gjennomstrømningen.
- For LMW-proteiner eller fordøyde peptider, eluer prøven ved å strømme 300 μL 50% acetonitril / 0,1% TFA (5 min, 2500 x g).
- For intakte proteiner, følg trinn 8.5 med et ekstra elueringstrinn ved bruk av 300 μL med 75 % acetonitril/0,1 % TFA. Kombiner de to resulterende ekstraktene.
MERK: Trinn 8.6 er valgfritt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 oppsummerer forventet SDS-deplesjon etter hetteglassbasert eller patron-tilrettelagt utfelling av proteiner i en engangsfilterpatron ved bruk av aceton. Konvensjonell inkubering over natten (-20 °C) i aceton sammenlignes med den raske acetonutfellingsprotokollen ved romtemperatur (trinn 2), samt CMW-utfelling (trinn 4). Resterende SDS ble kvantifisert ved metylenblå virkestoff (MBAS) analyse29. Kort fortalt ble 100 μL-prøve kombinert med 100 μL MBAS-reagens (250 mg metylenblått, 50 g natriumsulfat, 10 ml svovelsyre, fortynnet i vann til 1,0 L), etterfulgt av tilsetning av 400 μL kloroform og absorbansmåling av det organiske laget ved 651 nm på et UV/Vis-spektrofotometer. Alle tilnærminger reduserer SDS for å muliggjøre optimal MS-analyse.
Kvantitativ og reproduserbar proteingjenvinning oppnås etter rask acetonutfelling og CMW-utfelling, som vist i figur 5 gjennom SDS PAGE-analyse av et prosessert totalcellelysat i gjær. Utfelling i en engangsfiltreringspatron eliminerer behovet for å forsiktig pipe den SDS-holdige supernatanten mens du beholder de aggregerte proteinene over et membranfilter. Konsistent utvinning oppnås med alle nedbørsprotokoller, uten synlige bånd oppdaget i supernatantfraksjonene over tre uavhengige replikasjoner.
Figur 6 kvantifiserer forventet avkastning, inkludert resolubilisering av utfelte proteinpellets ved bruk av kald maursyre (trinn 6). CMW-utfelling gir kvantitativ gjenvinning ved å nøye bevare pelleten i en hetteglassbasert tilnærming (trinn 5), som tilsvarer den som oppnås ved bruk av patronen (henholdsvis 100 ± 4% vs. 101 ± 3%). Gjenvinning av acetonutfelte proteinpellets drar nytte av en filtreringspatron, med en 15-20 % forbedring i utbyttet observert. I hetteglass er isolering av aceton supernatanten fra det aggregerte proteinet i hovedsak avhengig av overholdelse av pelleten til PP-røroverflaten; filtreringspatronen eliminerer denne bekymringen, da filteret sikrer høy gjenvinning av utfelt protein uten pipettering.
For effektivt å gjenvinne LMW-proteiner og peptider, modifiseres acetonutfellingsprotokollen ved å erstatte NaCl for ZnSO4 og øke løsningsmiddelprosenten til 97%. Kombinere dette spesifikke saltet og høyere nivåer av organisk løsningsmiddel er nødvendig for høy gjenvinning av LMW-proteiner og peptider26. Som vist i figur 7, viser patronbasert proteinutfelling overlegen gjenvinning av en pepsinfordøyd prøve av okseplasma i forhold til hetteglassbasert utfelling. Engangsspinnpatronen kan gjenvinne over 90 % av LMW-peptidene. Mer signifikante forskjeller i utbytte er notert i patronen ved bruk av NaCl, noe som bekrefter viktigheten av salttype for å maksimere utbyttet. Å inkludere ZnSO4 i motsetning til NaCl resulterer i en aggregert proteinpellets som lettere fanges av spinnpatronfilteret.
For å vurdere effekten av utfellende proteiner over et bredt dynamisk område, ble en blanding av tre standardproteiner behandlet: β-galaktosidase (β-gal) fra E. coli, cytokrom c (Cyt c) fra storfe og enolase (Eno) fra S. cerevisiae. Masseforholdet mellom β-gal:Cyt c:Eno var 10 000:10:1. Prøvene inneholdt i utgangspunktet 2 % SDS før sylinderampullebasert utfelling (trinn 5) og ble re-solubilisert og fordøyd med trypsin (trinn 6 og 7). Prøver fremstilt i hetteglass fungerte som en kontroll, uten SDS og utelot nedbør. Alle prøvene var gjenstand for tilsvarende SPE-opprydding (trinn 8). Bottom-up MS ble utført, med MS /MS-spektra søkt mot en kombinert database som inneholder alle proteiner fra de tre involverte artene (se Materialtabell for instrument- og programvareplattformer). En peptid falsk oppdagelsesrate på 1% ble ansatt. Alle tre proteinene ble identifisert av MS, med henholdsvis 666, 28 og 35 unike peptider for β-gal, Cyt c og Eno. Figur 8 kvantifiserer det relative forholdet (peptidtoppintensitet) fra hver prøve, med et forhold over 1 som reflekterer en høyere peptidforekomst for prøver behandlet i engangsfilterpatronene. Resultatene viser fordelene ved å inkorporere SDS i en proteomikkarbeidsflyt, minimere proteintap (f.eks. fra potensiell adsorpsjon til prøveflasken) og maksimere peptidutbyttet.
Bovin lever ble anskaffet på en lokal matbutikk. Proteinene ble isolert ved å trekke ut vevet med en løsning på 1% SDS. Deretter ble det gjenvunnede proteomet utfelt, re-solubilisert (urea) og fordøyd med trypsin, alt i en engangspatron. Bottom-up LC-MS / MS ble utført, noe som resulterte i identifisering av et gjennomsnitt på ~ 8000 proteiner (~ 30.000 peptider). Falske funnrater på 0,5% og 1,0% for peptidspektra og proteingrupper, ble ansatt, og søkte i storfedatabasen. Den tekniske reproduserbarheten av denne kassettbaserte arbeidsflyten vurderes gjennom overlappende proteinidentifikasjoner. De replikerende MS-injeksjonene av en vanlig fordøyd prøve oppnår i gjennomsnitt 78 ± 0,5% overlapping med de identifiserte proteinene. Til sammenligning oppnådde prøver uavhengig fremstilt i diskrete patroner 76 ± 0,5% overlapping. Disse dataene antyder at bidraget fra prøvepreparering mot den totale variabiliteten av analysen er liten, i forhold til det som allerede er bidratt av LC-MS instrumentell tilnærming. Okseproteinene identifisert fra tre tekniske replikasjoner (behandlet uavhengig i tre engangspatroner) ble videre karakterisert med hensyn til deres molekylvekt, hydrofobisitet og isoelektriske punkt, vist i figur 9. En toveis ANOVA kunne ikke bestemme statistiske forskjeller i de identifiserte proteomene på tvers av de tekniske replikasjonene. Til slutt sammenligner figur 10 antall identifiserte peptider per protein på tvers av de tre replikasjonsprøvepreparatene. Korrelasjonskoeffisientene i disse grafene (0,94-0,95) viser den høye konsistensen av prøveprepareringsmetoden for bottom-up MS-analyse.
Figur 1: Acetonutfelte proteiner. Prøver som inneholder 100 og 1000 μg protein kombinert med 100 mM NaCl og utfelt med 80% aceton (A) etter 5 min nedbørstid og (B) etter utfelling og påfølgende sentrifugering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Proteinutfelling med kloroform/metanol/vann. En prøve som inneholder 50 μg protein utfelt i henhold til trinn 4. (A) Umiddelbart etter trinn 4.4. (B) Umiddelbart etter trinn 4.8. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bilder av en engangs to-trinns filtrerings- og ekstraksjonspatron for proteinutfelling. En prøve som inneholdt 100 μg protein ble kombinert med 100 mM NaCl og 80% aceton i (A) den monterte filtrerings- og SPE-patronen og (B) utfelt i 5 minutter til proteinaggregater ble synlige. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sds-uttømmingseffektivitet etter proteinutfelling. Prosentandelen av SDS fjernet er vist fra acetonutfelling med den konvensjonelle protokollen (over natten ved -20 ° C), den raske protokollen (2 min inkubasjon ved romtemperatur), eller ved kloroform / metanol / vann (CMW) utfelling av et S. cerevisiae lysat, både i konvensjonelt (hetteglass) og patronformat. Disse prøvene inneholdt i utgangspunktet 0,5% SDS (5000 ppm), og utledet >99,8% SDS-fjerning er nødvendig for optimal MS-analyse. Resterende SDS kvantifiseres av metylenblå aktive stoffer (MBAS) analyse. Feilfelt representerer standardavviket fra tekniske replikasjoner (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Total proteomutvinning gjennom nedbør. SDS PAGE viser utvinningen av S. cerevisiae totalt proteinlysat, utfelt av (A) konvensjonell acetonutfelling, (B) kloroform / metanol / vannutfelling og (C) rask acetonutfelling. Proteinbånd observeres utelukkende i pelletsfraksjonen, uten synlige bånd i supernatanten (Super.). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Overlegen proteingjenvinning i en filtreringspatron. For utfelling av S. cerevisiae totalt proteinlysat, letter engangsspinnpatronen kvantitativ utvinning med aceton og CMW-utfelling. Høy utvinning er også mulig med hetteglassbasert nedbør, selv om forsiktig prøvemanipulering og pipettering er nødvendig. LC-UV-vurdert proteingjenvinning etter resolubilisering av pelleten med kald maursyre er vist her. Feilfelt representerer standardavviket fra tekniske replikasjoner (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Høyt utfellingsutbytte for peptider med lav molekylvekt. En modifisert acetonutfellingsprotokoll for peptider og proteiner ≤5 kDa innebærer kobling av 100 mM ZnSO4 med 97% aceton for å oppnå de høyeste utbyttene. Nedbør tilrettelagt av en engangsfiltreringspatron demonstrerer forbedret utvinning sammenlignet med konvensjonell hetteglassbasert nedbør over alle tre nedbørsforhold. Feilfelt representerer standardavviket fra tekniske replikasjoner (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Høyere utvinning av standardproteiner i SDS-basert arbeidsflyt. Tukey Box-and-Whisker plotter30 av relativ MS-signalintensitet for peptider gjenvunnet fra SDS-holdige proteiner behandlet i en engangsfiltreringspatron i forhold til en kontrollprøve (ingen SDS, ingen nedbør). Proteinene som brukes spenner over et bredt konsentrasjonsdynamisk område- β-galaktosidase: cytokrom c: enolase = 10,000: 10: 1. Hver kvartil i boksene inneholder 25 % av fordelingen, mens feilfeltene omfatter 95 % av fordelingen. Gjennomsnitt er indikert med "+" og median med en horisontal linje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Identifiserte proteinfordelinger fra tekniske replikasjoner. Tukey Box-and-Whisker-plott karakteriserer (A) molekylvekten, (B) hydrofobisitet og (C) isoelektrisk punkt av proteiner identifisert ved bottom-up LC-MS / MS etter tredoble preparater av et storfe leverlysat i en to-trinns filtrerings- og ekstraksjonspatron. Det var ingen statistisk forskjell i disse karakteristika ved toveis ANOVA (p < 0,05). Hver kvartil i boksene inneholder 25 % av fordelingen, mens feilfeltene omfatter 95 % av fordelingen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Korrelasjon av peptid-IDer per protein gjennom den SDS-baserte forberedelsesarbeidsflyten på tvers av preparative replikasjoner. Analyse av bottom-up proteomreproduserbarhet på tvers av (A) prøve 1 og 2, (B) prøve 2 og 3, og (C) prøve 1 og 3 basert på antall peptid MS identifikasjoner per protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optimal MS-karakterisering oppnås når gjenværende SDS tømmes under 10 ppm. Mens alternative tilnærminger, som FASP og fordøyelse på perler, tilbyr kvantitativ SDS-uttømming med variabel utvinning 31,32,33, er hovedmålet med nedbør å maksimere renhet og utbytte samtidig. Dette avhenger av å effektivt isolere supernatanten (som inneholder SDS) uten å forstyrre proteinpelleten. Med hetteglassbasert nedbør, når hoveddelen av supernatanten fjernes ved pipettering, er det stadig mer sannsynlig at noen av de aggregerte pelletsene ved et uhell går tapt. Av denne grunn er det viktig å etterlate en mer signifikant del av det gjenværende løsningsmidlet (~ 20 μL) og legge til et vasketrinn34. Vasketrinnet fortynner og fjerner gjenværende oppløsningsvæske fra hetteglasset. Spesielt med CMW er det unødvendig å virvle prøveflasken når pelleten har dannet seg. Forstyrrelse av pelleten gjennom kraftig omrøring har den uønskede effekten av å øke sannsynligheten for tap fra utilsiktet pipettering. Hvis virvel er inkludert (som anbefalt i tidligere protokoller)35, er det potensial for at deler av CMW-pelleten fester seg til undersiden av hetteglasshetten. Når den er sentrifugert, forblir pelleten festet på hetteglasshetten og kan resultere i ~50 % tap.
Rask utfelling kan utføres med høy gjenvinning av fortynnede proteomprøver, ideelt mellom 0,01-2 mg / ml, eller en tilsvarende proteinmasse mellom 1-200 μg. Kvantitative og reproduserbare gjenvinninger fra under 0,01 mg/ml protein kan imidlertid dra nytte av lengre nedbørstider fra 10 minutter til 1 time, noe som viser gjennomstrømningsbegrensninger i nedbørsarbeidsflyten. Overraskende nok viser mer konsentrerte prøver (10 mg/ml) en statistisk reduksjon i utbyttet, antagelig fra utilsiktede pipetteringstap. Forutsatt > 10 μg protein, bør en synlig pellet observeres på siden av hetteglasset (figur 1B). Mindre mengder, ned til 1 μg, er utfordrende å se. Dette utfordrer kapasiteten til å pipettere supernatanten uten å forstyrre proteinpelletsen. Hetteglasset kan inverteres (sakte) med aceton for å separere løsningsmidlet fra pelleten. For CMW fester ikke pelleten seg tilstrekkelig til hetteglasset, og favoriserer dermed pipettering fremfor dekantering av supernatanten. Ved hetteglassbasert utfelling anbefales det å arbeide med minst mulig mikrosentrifugerør for å lette de tiltenkte prøve- og løsningsmiddelvolumene. Utfelling i engangsfiltreringspatronen som brukes i dette arbeidet gir en maksimal volumkapasitet på 500 μL, noe som muliggjør proteinutfelling med 80% aceton på prøvevolumer opp til 100 μL. Prøve-, salt- og løsningsmiddelvolumer kan justeres tilsvarende hvis de anbefalte konsentrasjonene opprettholdes.
Renheten av proteinpelleten gjenvunnet fra organisk løsningsmiddelbasert utfelling er begrenset av kompleksiteten til prøvematrisen, bufferkomponentene og utfellingsforholdene. For eksempel har spesifikke bufferkomponenter som glycin (brukt til SDS PAGE-separasjoner) vist seg å utfelle med protein ved bruk av 80% aceton. Imidlertid forblir glycin løselig gjennom CMW-utfelling. Aceton har blitt rapportert å utfelle DNA-fragmenter36,37, som potensielt tilfører uønskede bakgrunns urenheter til den gjenvunnede pelleten. Utfelling av proteiner og peptider med lav molekylvekt krever et forhøyet nivå av organisk løsningsmiddel og en bestemt salttype for å maksimere utbyttet. Mens flere salter har blitt utforsket, gir ZnSO4 konsekvent høye produkter. Dette saltet vil utfelle i 97% aceton i fravær av protein. Dermed inneholder den resulterende proteinpelleten en høy konsentrasjon av salt. Det bemerkes at bruk av 90% aceton i volum også vil oppnå høye peptidutbytter, selv om det forventes en statistisk signifikant nedgang (~ 5%) i utvinning. Dette gjør det imidlertid mulig å behandle et mer signifikant prøvevolum (opptil 180 μL, med 20 μL på 1 M ZnSO4) i hvert 2 ml hetteglass. Utover matriks urenheter som utfelles sammen med proteinpelleten, må det angis at løsningsmiddelutfelling i seg selv forårsaker denaturering av prøven38,39. Derfor er denne protokollen ikke anvendelig for preparater av funksjonelle proteiner eller innfødte MS-arbeidsflyter. Aceton har også blitt rapportert å forårsake kovalente proteinmodifikasjoner ved glycinrester40 og indusere et +98 u masseskift, spekulert i å være et biprodukt av aldolkondensasjon aceton41.
Ved bruk av en filtreringspatron for proteinutfelling er isolering av proteinpelleten avhengig av oppbevaring av aggregater over et PTFE-membranfilter. Porøsiteten til denne membranen overstiger porøsiteten til et molekylvekt cutoff filter (som sett i FASP), noe som tillater proteinisolering med reduserte spinntider. Rask løsningsoverføring ved lave spinnhastigheter er avhengig av riktig fukting av PTFE-membranen; Organiske løsningsmidler strømmer lett gjennom, selv om et tørt PTFE-filter hindrer vandige løsningsmidler. Hvis filtreringspatronen ser ut til å være tilstoppet, bør membranen fuktes på nytt ved direkte påføring av et lite volum organisk løsningsmiddel (f.eks. isopropanol) på filteret. Avhengig av størrelsen på proteinpelleten og prøvevolumet som brukes, kan det være nødvendig med ytterligere sentrifugering eller spinn ved høyere hastigheter (opptil 3000 x g) for å sikre at alt løsningsmiddel har passert gjennom filtreringspatronen.
Proteingjenvinning fra utfelling med optimale forhold er til syvende og sist begrenset av utfordringen med re-løselighet av pellets, med få løsningsmiddelalternativer som er kompatible med nedstrømsbehandling og LC-MS. I tillegg bidrar flere nedbørsforhold som lange eksponeringer for lave temperaturer og overtørking av en tettpakket pellets til re-solubiliseringsutfordringer40. Det bemerkes at CMW-proteinpellets generelt er mindre oppløselige enn acetonpellets. Maksimert re-solubiliseringseffektivitet av utfelt protein med 80 % kald maursyre (trinn 6.2.2) er tidligere rapportert42; den kalde temperaturen forhindrer proteinmodifisering, som ellers forekommer i konsentrert maursyre 43,44. Fortynning av syrekonsentrasjonen bremser også modifikasjonsreaksjonen. Maursyre anbefales ved ovenfra-og-ned MS-tilnærminger eller før enzymatisk fordøyelse med pepsin. Bruk av dette løsningsmidlet krever lite fysisk behandling; tilsetningen av bare 5 μL (nok til å dekke proteinpelleten) kan være tilstrekkelig når den kombineres med virvel, kort sonikering eller gjentatt pipettering. På samme måte, for prøver som skal analyseres av SDS PAGE, er re-oppløsning i SDS-inneholdende Laemmli-buffer svært effektiv, kombinert med beskjeden blanding av prøven før oppvarming. Imidlertid er disse løsningsmidlene begge uforenlige med trypsin. Resolubilisering med 8 M urea anbefales før trypsinfordøyelse, slik at urea er tilberedt (samme dag). Et minimumsvolum på 50 μL buffer anbefales for protein re-solubilization i filtrering patronen for å maksimere kontakten mellom kaotropisk løsningsmiddel og pellet, samt å hjelpe oppløsning under sonikering, gjenta pipettering og / eller vortexing. Alternative tilnærminger utnytter trypsin for å re-oppløse proteinet, noe som betyr at proteinet ikke trenger å være fullstendig oppløst før enzymtilsetning. Imidlertid kan denne tilnærmingen forstyrre fordøyelsen, favorisere de mer løselige artene mens hydrofobe proteiner opplever kortere fordøyelsestid45. Tilsetning av 8 M urea, sammen med grunnleggende buffere som Tris eller ammoniumbikarbonat, krever et prøveoppryddingstrinn etter fordøyelsen. For slike prøvetilsetninger er reversert fasekolonneopprydding ideell. Engangsfiltreringspatronen som ble brukt i denne studien, er supplert med en utskiftbar SPE-kassett med omvendt fase. Denne sylinderampullen er også ideell for løsemiddelutveksling, når det gjelder resolubiliseringsprotokollen for maursyre. Det er viktig å merke seg at enhver fast faseutvinningsmetode er forbundet med iboende tap i prøveutvinning. Derfor bør brukeren veie fordelene med utvinning og den ekstra rensingen for eksperimentet.
Det forventes at disse protokollene vil gjøre det mulig for proteomikkforskere å strømlinjeforme sine vaskemiddelbaserte arbeidsflyter, og utnytte SDS for proteomekstraksjon. Forberedende strategier som muliggjør konsekvent gjenoppretting av hele proteomet er kritiske. En totrinns spinnpatron forenkler muligheten for rask, robust og reproduserbar prøveisolering av proteom. En slik tilnærming vil være mottagelig for applikasjoner som krever streng analyse uten å ofre prøvegjennomstrømninger, for eksempel kliniske innstillinger eller store forskningsinitiativer46. Fremtidige anvendelser av disse tilnærmingene kan omfatte biomarkøroppdagelse, deteksjon, nøyaktig kvantifisering og oppdagelse av narkotika- og narkotikamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Doucette-laboratoriet unnfanget og patenterte ProTrap XG som ble brukt i denne studien. AAD er også en av grunnleggerne av Proteoform Scientific, som kommersialiserte prøveprepareringspatronen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. Forfatterne takker Bioinformatics Solutions (Waterloo, Canada) og SPARC BioCentre (Molecular Analysis) ved Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) for deres bidrag til oppkjøpet av MS-data.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002 % aldehyde |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC grade |
| Ammonium Bicarbonate | Millipore Sigma | A6141-1KG | solid |
| Beta mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molecular biology grade |
| Bromophenol blue | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol blue sodium salt |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
| Formic Acid | Honeywell | 56302 | Eluent additive for LC-MS |
| Fusion Lumos Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | for analysis of standard protein mixture | |
| Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | For molecular biology, > 99% |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC grade |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC grade |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | up to 21,000 xg |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | tapered bottom |
| Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | rounded bottom |
| Micropipette Tips (0.1-10 μL) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (1-200 μL) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipette Tips (200-1000 μL) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universal pipet tip, non-sterile |
| Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Micropipet Trio pack |
| Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilized powder, >3200 units/ mg |
| ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 complete units per box |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS reagent, >99 % |
| Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher Scientific | 28312 | powdered solid |
| timsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | for analysis of liver proteome extract | |
| Trifluoroacetic Acid | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | From bovine pancreas, TPCK-treated |
| Urea | Bio-Rad | 1610731 | solid |
| Water (deionized) | Sartorius Arium Mini Water Purification System | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm) |
| Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solid |
References
- Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
- Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
- Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
- Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
- Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
- Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
- Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
- Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318 (2021).
- Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856 (2021).
- Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524 (2020).
- Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051 (2021).
- Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
- Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
- Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
- Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
- Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
- Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
- Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
- Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
- Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
- Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
- Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
- Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
- Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
- Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
- Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
- Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
- Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
- Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, at http://www.jstor.org/stable/2529486 768 (1977).
- Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
- Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
- Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983 (2021).
- Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
- Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
- Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
- Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
- Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
- Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
- Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
- Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
- Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
- Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
- Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).
