Detta protokoll beskriver lösningsmedelsbaserad proteinutfällning under kontrollerade förhållanden för robust och snabb återhämtning och rening av proteomprover före masspektrometri.
Medan flera framsteg inom masspektrometri (MS) -instrument har förbättrat kvalitativ och kvantitativ proteomanalys, är mer tillförlitliga front-end-metoder för att isolera, berika och bearbeta proteiner före MS avgörande för framgångsrik proteomkarakterisering. Låg, inkonsekvent proteinåtervinning och kvarvarande föroreningar som ytaktiva ämnen är skadliga för MS-analys. Proteinutfällning anses ofta vara opålitlig, tidskrävande och tekniskt utmanande att utföra jämfört med andra provberedningsstrategier. Dessa problem övervinns genom att använda optimala proteinutfällningsprotokoll. För acetonutfällning är kombinationen av specifika salter, temperaturkontroll, lösningsmedelssammansättning och utfällningstid avgörande, medan effektiviteten hos kloroform / metanol / vattenutfällning beror på korrekt pipettering och injektionsflaska manipulation. Alternativt är dessa utfällningsprotokoll strömlinjeformade och halvautomatiserade i en engångsspinnpatron. De förväntade resultaten av lösningsmedelsbaserad proteinutfällning i konventionellt format och med användning av en engångsfiltrerings- och extraktionspatron i två steg illustreras i detta arbete. Detta inkluderar detaljerad karakterisering av proteomblandningar genom bottom-up LC-MS / MS-analys. Den överlägsna prestandan hos SDS-baserade arbetsflöden demonstreras också i förhållande till icke-förorenat protein.
Proteomanalys med masspektrometri har blivit allt strängare på grund av den förbättrade känsligheten, upplösningen, skanningshastigheten och mångsidigheten hos moderna MS-instrument. Ms framsteg bidrar till större proteinidentifieringseffektivitet och mer exakt kvantifiering 1,2,3,4,5. Med förbättrad MS-instrumentering kräver forskare en motsvarande konsekvent front-end-provberedningsstrategi som kan kvantitativ återhämtning av proteiner med hög renhet på minimal tid i alla stadier av arbetsflödet 6,7,8,9,10,11 . För att korrekt återspegla proteomstatusen för ett biologiskt system måste proteiner isoleras från den ursprungliga provmatrisen på ett effektivt och opartiskt sätt. För detta ändamål, inklusive ett denaturerande ytaktivt medel, såsom natriumdodecylsulfat (SDS), säkerställer effektiv proteinextraktion och solubilisering12. SDS stör emellertid starkt elektrosprayjonisering, vilket orsakar allvarlig MS-signalundertryckning om den inte elimineras ordentligt13.
Olika SDS-utarmningsstrategier är tillgängliga för efterföljande proteomanalys, såsom retention av proteiner över ett molekylviktsavgränsningsfilter som finns i engångsspinnpatroner 14,15,16. Den filterstödda provberedningsmetoden (FASP) gynnas eftersom den effektivt tömmer SDS under 10 ppm, vilket underlättar optimal MS. Proteinåtervinning med FASP är dock variabel, vilket föranledde utforskningen av andra tekniker. Kromatografiska metoder som selektivt fångar protein (eller ytaktivt medel) har utvecklats till olika praktiska patroner eller pärlbaserade format 17,18,19,20,21. Med tanke på dessa enkla och (idealiskt) konsekventa strategier för proteinrening förbises ofta det klassiska tillvägagångssättet för proteinutfällning med organiska lösningsmedel som ett lovande tillvägagångssätt för proteinisolering. Medan lösningsmedelsutfällning har visat sig tömma SDS under kritiska nivåer framgångsrikt, har proteinåtervinning varit ett långvarigt problem för detta tillvägagångssätt. Flera grupper har observerat en proteinåtervinningsbias, med oacceptabelt låga utfällningsutbyten som en funktion av proteinkoncentration, molekylvikt och hydrofobicitet22,23. På grund av mångfalden av nederbördsprotokoll som rapporterats i litteraturen utvecklades standardiserade nederbördsförhållanden. rapporterade först beroendet av jonstyrka på utfällningseffektiviteten hos proteiner i 80% aceton24. För alla undersökta proteiner visade sig tillsatsen av upp till 30 mM natriumklorid vara avgörande för att maximera utbytet (upp till 100% återhämtning). visade nyligen att kombinationen av ännu högre jonstyrka (upp till 100 mM) med förhöjd temperatur (20 ° C) under acetonutfällning gav nära kvantitativ återhämtning på 2-5 min25. En liten minskning av återvinningen av proteiner med låg molekylvikt (LMW) observerades. därför visade en efterföljande rapport från Baghalabadi m.fl. den framgångsrika återhämtningen av LMW-proteiner och peptider (≤5 kDa) genom att kombinera specifika salter, särskilt zinksulfat, med en högre nivå av organiskt lösningsmedel (97% aceton)26.
Medan raffinering av nederbördsprotokollet ger en mer tillförlitlig proteinreningsstrategi för MS-baserad proteomik, är framgången för konventionell nederbörd starkt beroende av användarteknik. Ett primärt mål med detta arbete är att presentera en robust nederbördsstrategi som underlättar isoleringen av proteinpelleten från den förorenande supernatanten. En engångsfiltreringspatron utvecklades för att eliminera pipettering genom att isolera aggregerat protein ovanför ett poröst PTFE-membranfilter27. MS-störande komponenter i supernatanten avlägsnas effektivt i ett kort centrifugeringssteg med låg hastighet. Engångsfilterpatronen erbjuder också en utbytbar SPE-patron, vilket underlättar efterföljande provrensning efter resolubilisering och valfri proteinuppslutning, före masspektrometri.
En serie rekommenderade arbetsflöden för proteomutfällning presenteras här, inklusive modifierade aceton- och kloroform/metanol/vatten28-protokoll , i ett konventionellt (injektionsflaskabaserat) och ett halvautomatiskt format i en engångsfiltrerings- och extraktionspatron i två tillstånd. De resulterande proteinåtervinningarna och SDS-utarmningseffektiviteten framhävs, tillsammans med bottom-up LC-MS / MS-proteomtäckning, för att visa det förväntade resultatet från varje protokoll. De praktiska fördelarna och nackdelarna med varje tillvägagångssätt diskuteras.
Optimal MS-karakterisering uppnås när kvarvarande SDS är uttömt under 10 ppm. Medan alternativa metoder, såsom FASP och matsmältning på pärlor, erbjuder kvantitativ SDS-utarmning med variabel återhämtning 31,32,33, är det primära målet med nederbörd att maximera renhet och avkastning samtidigt. Detta beror på att effektivt isolera supernatanten (som innehåller SDS) utan att störa proteinpelleten. Med flaskbasera…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. (Waterloo, Kanada) och SPARC BioCentre (Molecular Analysis) vid Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada) för deras bidrag till förvärvet av MS-data.
Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002 % aldehyde |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC grade |
Ammonium Bicarbonate | Millipore Sigma | A6141-1KG | solid |
Beta mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molecular biology grade |
Bromophenol blue | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol blue sodium salt |
Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
Formic Acid | Honeywell | 56302 | Eluent additive for LC-MS |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | for analysis of standard protein mixture | |
Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | For molecular biology, > 99% |
Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC grade |
Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC grade |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | up to 21,000 xg |
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | tapered bottom |
Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | rounded bottom |
Micropipette Tips (0.1-10 μL) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipette Tips (1-200 μL) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipette Tips (200-1000 μL) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Micropipet Trio pack |
Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilized powder, >3200 units/ mg |
ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 complete units per box |
Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS reagent, >99 % |
Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher Scientific | 28312 | powdered solid |
timsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | for analysis of liver proteome extract | |
Trifluoroacetic Acid | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | From bovine pancreas, TPCK-treated |
Urea | Bio-Rad | 1610731 | solid |
Water (deionized) | Sartorius Arium Mini Water Purification System | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm) |
Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solid |