Summary

Organisk lösningsmedelsbaserad proteinutfällning för robust proteomrening före masspektrometri

Published: February 07, 2022
doi:

Summary

Detta protokoll beskriver lösningsmedelsbaserad proteinutfällning under kontrollerade förhållanden för robust och snabb återhämtning och rening av proteomprover före masspektrometri.

Abstract

Medan flera framsteg inom masspektrometri (MS) -instrument har förbättrat kvalitativ och kvantitativ proteomanalys, är mer tillförlitliga front-end-metoder för att isolera, berika och bearbeta proteiner före MS avgörande för framgångsrik proteomkarakterisering. Låg, inkonsekvent proteinåtervinning och kvarvarande föroreningar som ytaktiva ämnen är skadliga för MS-analys. Proteinutfällning anses ofta vara opålitlig, tidskrävande och tekniskt utmanande att utföra jämfört med andra provberedningsstrategier. Dessa problem övervinns genom att använda optimala proteinutfällningsprotokoll. För acetonutfällning är kombinationen av specifika salter, temperaturkontroll, lösningsmedelssammansättning och utfällningstid avgörande, medan effektiviteten hos kloroform / metanol / vattenutfällning beror på korrekt pipettering och injektionsflaska manipulation. Alternativt är dessa utfällningsprotokoll strömlinjeformade och halvautomatiserade i en engångsspinnpatron. De förväntade resultaten av lösningsmedelsbaserad proteinutfällning i konventionellt format och med användning av en engångsfiltrerings- och extraktionspatron i två steg illustreras i detta arbete. Detta inkluderar detaljerad karakterisering av proteomblandningar genom bottom-up LC-MS / MS-analys. Den överlägsna prestandan hos SDS-baserade arbetsflöden demonstreras också i förhållande till icke-förorenat protein.

Introduction

Proteomanalys med masspektrometri har blivit allt strängare på grund av den förbättrade känsligheten, upplösningen, skanningshastigheten och mångsidigheten hos moderna MS-instrument. Ms framsteg bidrar till större proteinidentifieringseffektivitet och mer exakt kvantifiering 1,2,3,4,5. Med förbättrad MS-instrumentering kräver forskare en motsvarande konsekvent front-end-provberedningsstrategi som kan kvantitativ återhämtning av proteiner med hög renhet på minimal tid i alla stadier av arbetsflödet 6,7,8,9,10,11 . För att korrekt återspegla proteomstatusen för ett biologiskt system måste proteiner isoleras från den ursprungliga provmatrisen på ett effektivt och opartiskt sätt. För detta ändamål, inklusive ett denaturerande ytaktivt medel, såsom natriumdodecylsulfat (SDS), säkerställer effektiv proteinextraktion och solubilisering12. SDS stör emellertid starkt elektrosprayjonisering, vilket orsakar allvarlig MS-signalundertryckning om den inte elimineras ordentligt13.

Olika SDS-utarmningsstrategier är tillgängliga för efterföljande proteomanalys, såsom retention av proteiner över ett molekylviktsavgränsningsfilter som finns i engångsspinnpatroner 14,15,16. Den filterstödda provberedningsmetoden (FASP) gynnas eftersom den effektivt tömmer SDS under 10 ppm, vilket underlättar optimal MS. Proteinåtervinning med FASP är dock variabel, vilket föranledde utforskningen av andra tekniker. Kromatografiska metoder som selektivt fångar protein (eller ytaktivt medel) har utvecklats till olika praktiska patroner eller pärlbaserade format 17,18,19,20,21. Med tanke på dessa enkla och (idealiskt) konsekventa strategier för proteinrening förbises ofta det klassiska tillvägagångssättet för proteinutfällning med organiska lösningsmedel som ett lovande tillvägagångssätt för proteinisolering. Medan lösningsmedelsutfällning har visat sig tömma SDS under kritiska nivåer framgångsrikt, har proteinåtervinning varit ett långvarigt problem för detta tillvägagångssätt. Flera grupper har observerat en proteinåtervinningsbias, med oacceptabelt låga utfällningsutbyten som en funktion av proteinkoncentration, molekylvikt och hydrofobicitet22,23. På grund av mångfalden av nederbördsprotokoll som rapporterats i litteraturen utvecklades standardiserade nederbördsförhållanden. rapporterade först beroendet av jonstyrka på utfällningseffektiviteten hos proteiner i 80% aceton24. För alla undersökta proteiner visade sig tillsatsen av upp till 30 mM natriumklorid vara avgörande för att maximera utbytet (upp till 100% återhämtning). visade nyligen att kombinationen av ännu högre jonstyrka (upp till 100 mM) med förhöjd temperatur (20 ° C) under acetonutfällning gav nära kvantitativ återhämtning på 2-5 min25. En liten minskning av återvinningen av proteiner med låg molekylvikt (LMW) observerades. därför visade en efterföljande rapport från Baghalabadi m.fl. den framgångsrika återhämtningen av LMW-proteiner och peptider (≤5 kDa) genom att kombinera specifika salter, särskilt zinksulfat, med en högre nivå av organiskt lösningsmedel (97% aceton)26.

Medan raffinering av nederbördsprotokollet ger en mer tillförlitlig proteinreningsstrategi för MS-baserad proteomik, är framgången för konventionell nederbörd starkt beroende av användarteknik. Ett primärt mål med detta arbete är att presentera en robust nederbördsstrategi som underlättar isoleringen av proteinpelleten från den förorenande supernatanten. En engångsfiltreringspatron utvecklades för att eliminera pipettering genom att isolera aggregerat protein ovanför ett poröst PTFE-membranfilter27. MS-störande komponenter i supernatanten avlägsnas effektivt i ett kort centrifugeringssteg med låg hastighet. Engångsfilterpatronen erbjuder också en utbytbar SPE-patron, vilket underlättar efterföljande provrensning efter resolubilisering och valfri proteinuppslutning, före masspektrometri.

En serie rekommenderade arbetsflöden för proteomutfällning presenteras här, inklusive modifierade aceton- och kloroform/metanol/vatten28-protokoll , i ett konventionellt (injektionsflaskabaserat) och ett halvautomatiskt format i en engångsfiltrerings- och extraktionspatron i två tillstånd. De resulterande proteinåtervinningarna och SDS-utarmningseffektiviteten framhävs, tillsammans med bottom-up LC-MS / MS-proteomtäckning, för att visa det förväntade resultatet från varje protokoll. De praktiska fördelarna och nackdelarna med varje tillvägagångssätt diskuteras.

Protocol

1. Materiella överväganden och förberedning av prover Använd endast lösningsmedel med hög renhet (aceton, kloroform, metanol) (>99,5%) och kemikalier, fria från överskott av fukt. Förbered natriumklorid- och zinksulfatlösningar (1 M) i vatten.OBS: Saltlösningar kan förvaras på obestämd tid vid rumstemperatur, så länge de är fria från föroreningar eller mikrobiell tillväxt. Använd den minsta injektionsflaskan med mikrocentrifug av polypropen (PP) som …

Representative Results

Figur 4 sammanfattar den förväntade SDS-utarmningen efter injektionsflaskans eller patronunderstödda utfällning av proteiner i en engångsfilterpatron med aceton. Konventionell inkubation över natten (-20 °C) i aceton jämförs med protokollet för snabb acetonutfällning vid rumstemperatur (steg 2) samt CMW-utfällning (steg 4). Rest sds kvantifierades med analys av metylenblått aktiva substanser (MBAS)29. Kortfattat kombinerades 100 μL prov med 100 μL MBAS-…

Discussion

Optimal MS-karakterisering uppnås när kvarvarande SDS är uttömt under 10 ppm. Medan alternativa metoder, såsom FASP och matsmältning på pärlor, erbjuder kvantitativ SDS-utarmning med variabel återhämtning 31,32,33, är det primära målet med nederbörd att maximera renhet och avkastning samtidigt. Detta beror på att effektivt isolera supernatanten (som innehåller SDS) utan att störa proteinpelleten. Med flaskbasera…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete finansierades av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. (Waterloo, Kanada) och SPARC BioCentre (Molecular Analysis) vid Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada) för deras bidrag till förvärvet av MS-data.

Materials

Acetone Fisher Scientific AC177170010 ≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4 HPLC grade
Ammonium Bicarbonate Millipore Sigma A6141-1KG solid
Beta mercaptoethanol Millipore Sigma M3148-25ML Molecular biology grade
Bromophenol blue Millipore Sigma B8026-5G Bromophenol blue sodium salt
Chloroform Fisher Scientific C298-400 Chloroform
Formic Acid Honeywell 56302 Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer ThermoFisher Scientific for analysis of standard protein mixture
Glycerol Millipore Sigma 356352-1L-M For molecular biology, > 99%
Isopropanol Fisher Scientific A4641 HPLC grade
Methanol Fisher Scientific A452SK-4 HPLC grade
Microcentrifuge Fisher Scientific 75-400-102 up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-130 tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL) Fisher Scientific 02-681-321 rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL) Fisher Scientific 21-197-28 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL) Fisher Scientific 07-200-302 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL) Fisher Scientific 07-200-303 Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes Fisher Scientific 13-710-903 Micropipet Trio pack
Pepsin Millipore Sigma P0525000 Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG Proteoform Scientific PXG-0002 50 complete units per box
Sodium Chloride Millipore Sigma S9888-1KG ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate ThermoFisher Scientific 28312 powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer Bruker for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid ThermoFisher Scientific L06374.AP 99%
Tris Fisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Trypsin Millipore Sigma 9002-07-7 From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea Bio-Rad 1610731 solid
Water (deionized) Sartorius Arium Mini Water Purification System 76307-662 Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate Millipore Sigma 307491-100G solid

References

  1. Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
  2. Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
  3. Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
  4. Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
  5. Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
  6. Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
  7. Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
  8. Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318 (2021).
  9. Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856 (2021).
  10. Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524 (2020).
  11. Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051 (2021).
  12. Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
  13. Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
  14. Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  15. Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
  16. Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
  17. Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
  18. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  19. Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
  20. Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
  21. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
  22. Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
  23. Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
  24. Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
  25. Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
  26. Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
  27. Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
  28. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  29. Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
  30. Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, 768 (1977).
  31. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  32. Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
  33. Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983 (2021).
  34. Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
  35. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  36. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  37. Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
  38. Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
  39. Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
  40. Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
  41. Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
  42. Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
  43. Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
  44. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  45. Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
  46. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).

Play Video

Cite This Article
Nickerson, J. L., Baghalabadi, V., Dang, Z., Miller, V. A., Little, S. L., Doucette, A. A. Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (180), e63503, doi:10.3791/63503 (2022).

View Video