Vi beskriver en tilgang til at opdage og fange invasive celleunderpopulationer i realtid. Det eksperimentelle design bruger Real-Time Cellular Analysis ved at overvåge ændringer i cellernes elektriske impedans. Invasive kræft-, immun-, endotel- eller stromale celler i komplekse væv kan fanges, og virkningen af co-kulturer kan vurderes.
Invasion og metastatisk spredning af kræftceller er den største dødsårsag fra kræft. Assays udviklet tidligt for at måle det invasive potentiale i kræftcellepopulationer genererer typisk en enkelt endepunktsmåling, der ikke skelner mellem kræftcelleunderpopulationer med forskelligt invasivt potentiale. Tumormikromiljøet består også af forskellige bosiddende stromal- og immunceller, der ændrer og deltager i kræftcellernes invasive opførsel. Invasion i væv spiller også en rolle i immuncellesubpopulationer, der afværger mikroorganismer eller eliminerer syge celler fra parenchymen og endotelcellerne under vævsombygning og angiogenese. Real-Time Cellular Analysis (RTCA), der bruger impedansbiosensorer til at overvåge celleinvasion, var et stort skridt fremad ud over endepunktsmåling af invasion: dette giver kontinuerlige målinger over tid og kan således afsløre forskelle i invasionshastigheder, der går tabt i slutpunktsanalysen. Ved hjælp af den nuværende RTCA-teknologi udvidede vi dobbeltkammerarrays ved at tilføje et yderligere kammer, der kan indeholde stromal- og / eller immunceller og gør det muligt at måle invasionshastigheden under påvirkning af udskillede faktorer fra co-dyrkede stromal- eller immunceller over tid. Ud over dette giver det unikke design mulighed for at løsne kamre til enhver tid og isolere den mest invasive kræftcelle eller andre celleunderpopulationer, der er til stede i heterogene blandinger af tumorisolater, der testes. Disse mest invasive kræftceller og andre celleunderpopulationer driver ondartet progression til metastatisk sygdom, og deres molekylære egenskaber er vigtige for dybtgående mekanistiske undersøgelser, udvikling af diagnostiske sonder til påvisning af dem og vurdering af sårbarheder. Således kan inkluderingen af lægemidler med små eller store molekyler bruges til at teste potentialet i terapier, der er målrettet mod kræft og / eller stromalcelleunderpopulationer med det formål at hæmme (f.eks. Kræftceller) eller forbedre (f.eks. Immunceller) invasiv adfærd.
Celleinvasion er en vigtig proces, der gør det muligt for celler at krydse kældermembranbarrierer som reaktion på miljømæssige signaler fra stromalceller. Det er et afgørende skridt i flere udviklingsstadier for immunresponser, sårheling, vævsreparation og maligniteter, der kan udvikle sig fra lokale læsioner til invasive og metastatiske kræftformer1. Assays udviklet tidligt for at måle det invasive potentiale i cellepopulationer genererer typisk en enkelt endepunktsmåling eller kræver formærkning af invasive celler2. Integrationen af mikroelektronik og mikrofluidik teknikker er nu udviklet til at detektere forskellige aspekter af cellebiologi såsom levedygtighed, bevægelse og fastgørelse ved hjælp af den elektriske impedans af levende celler på mikroelektroder 3,4. Impedansmåling giver mulighed for en etiketfri, ikke-invasiv og kvantitativ vurdering af cellestatus3. Her beskriver vi et tre-kammer array baseret på designet af Real-Time Cellular Analysis (RTCA) -systemet, der blev udviklet af Abassi et al.5. Det tre-kammerede array giver mulighed for vurdering af samkulturerede celler på cellulær invasion og genopretning af invasive celler til yderligere analyser eller ekspansion.
I celleanalysatorsystemet invaderer celler gennem en ekstracellulær matrix belagt på en porøs membran og når et interdigiteret elektrodearray placeret på den modsatte side af barrieren. Da de invasive celler fortsætter med at fastgøre og optage dette elektrodearray over tid, ændres den elektriske impedans parallelt. Det nuværende system består af en celleinvasion og migration (CIM) 16-brønds plade med to kamre. Instrumentet RTCA-DP (dual purpose) (kaldet dual purpose cell analyzer fremover) indeholder sensorer til impedansmåling og integreret software til analyse og behandling af impedansdata. Impedansværdier ved baseline afhænger af ionisk styrke af medier i brøndene og ændres, når celler fastgøres til elektroderne. Impedansændringerne afhænger af antallet af celler, deres morfologi og i hvilket omfang celler fastgøres til elektroderne. En måling af brøndene med medier, før cellerne tilføjes, betragtes som baggrundssignalet. Baggrunden trækkes fra impedansmålinger efter at have nået ligevægt med celler, der fastgøres og spredes på elektroderne. En enhedsløs parameter for cellernes status på en elektrode betegnet celleindeks (CI) beregnes som følger: CI = (impedans efter ligevægt – impedans i fravær af celler) / nominel impedansværdi6. Når migreringshastigheder for forskellige cellelinjer sammenlignes, kan Delta CI bruges til at sammenligne cellestatus uanset forskellen i vedhæftning, der er repræsenteret i de første par målinger.
Det nydesignede trekammerarray bygger på det eksisterende design og bruger det øverste kammer fra dobbeltcelleanalysatorsystemet, der indeholder elektroderne. De modificerede mellem- og bundkamre er tilpasset til at passe samlingen ind i celleanalysatoren med dobbelt formål til impedansmåling og analyse ved hjælp af den integrerede software. De to store fremskridt, som det nye design giver i forhold til den eksisterende cim-plade med dobbelt kammer (kaldet celleanalysatorplade fremover) er: i) evnen til at komme sig og derefter analysere invasive celleunderpopulationer, der er til stede i heterogene celleblandinger og ii) muligheden for at vurdere virkningen af udskillede faktorer fra samkultiverede stromal- eller immunceller på celleinvasion (figur 1).
Denne teknologi kan være nyttig til at studere delpopulationer af celler med forskellige invasive kapaciteter. Dette omfatter a) invasive kræftceller, der invaderer omgivende væv eller blod og lymfekar eller ekstravaserer på metastatiske såningssteder i fjerne organer, b) celler fra immunsystemet, der invaderer væv for at tackle patogener eller syge celler, c) endotelceller, der invaderer væv for at danne nye blodkar under vævsomorganisering eller sårheling, samt (d) stromalceller fra tumormikromiljøet, der understøtter og invaderer sammen med kræftceller. Tilgangen tillader inkludering af stromal cross-talk, der kan modulere cellemotilitet og invasion. De gennemførlighedsundersøgelser, der er vist her, bruger dette modificerede array med fokus på kræftcelleinvasion og interaktionen med stroma som et modelsystem, herunder endotelinvasion som reaktion på differentielle signaler fra kræftceller. Fremgangsmåden kan ekstrapoleres for at isolere kræftceller og andre celletyper såsom subpopulationer af immunceller, fibroblaster eller endotelceller. Vi testede invasive og ikke-invasive etablerede brystkræftcellelinjer som et bevis på princippet. Vi brugte også celler fra patientafledt xenograft (PDX) invasion som reaktion på immunceller fra human knoglemarv for at vise gennemførlighed til fremtidig brug også i kliniske diagnostiske indstillinger. PDX er patienttumorvæv, der implanteres i immunkompromitteret eller humaniseret musemodel for at muliggøre undersøgelse af vækst, progression og behandlingsmuligheder for den oprindelige patient 7,8.
Vi har ændret designet af et dobbeltkammeret array til at omfatte et tredje kammer til overvågning af celleinvasion i realtid i nærværelse af stromalceller. Vi har observeret forskellige virkninger af co-dyrkede fibroblaster på invasive og ikke-invasive kræftceller, hvilket indikerer, at arrayet kan bruges til at skelne mellem kræftcellesubpopulationer, der reagerer forskelligt på faktorer produceret af samkulturerede stromale celler. Arrayet blev også brugt til at overvåge endotelcelleinvasion i stromalvæv, e…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Dr. Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, for at give os de patientafledte xenografts (HCI-010). Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud R01CA205632, R21CA226542 og delvist af en bevilling fra Agilent Technologies.
0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
Adhesive | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
Cell lifter | Sarstedt | 83.1832 | |
Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Thermofisher | 12585-014 | |
CIM-plate | Agilent | 5665817001 | Cell analyzer plate |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130 | |
Dispase | StemCell | 7913 | |
DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
Horse serum (HS) | Gibco | 16050-122 | |
Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
HUVEC media | LONZA | CC-3162 | |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) | Thermofisher | 51500056 | |
Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution | Sigma | C8052 | |
J2 Fibroblasts | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
LymphoPrep | Stemcell | 7851 | Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells |
Matrigel | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
MCFDCIS.com cells ( DCIS) | RRID:CVCL_5552 | ||
MDA-MB-231 cells | RRID:CVCL_0062 | ||
Milling machine | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
Phosphate-buffered saline (1x) | Thermofisher | 10010049 | |
Polyethersulfone (PES) membrane | Sterlitech | PCTF029030 | |
RBC lysis solution | Stemcell | 7800 | |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
RTCA DP analyzer | Agilent | 3X16 | Dual purpose cell analyzer |
Trypsin | Sigma | T4799 |