Summary

Detektion og indfangning i realtid af invasive cellesubpopulationer fra co-kulturer

Published: March 30, 2022
doi:

Summary

Vi beskriver en tilgang til at opdage og fange invasive celleunderpopulationer i realtid. Det eksperimentelle design bruger Real-Time Cellular Analysis ved at overvåge ændringer i cellernes elektriske impedans. Invasive kræft-, immun-, endotel- eller stromale celler i komplekse væv kan fanges, og virkningen af co-kulturer kan vurderes.

Abstract

Invasion og metastatisk spredning af kræftceller er den største dødsårsag fra kræft. Assays udviklet tidligt for at måle det invasive potentiale i kræftcellepopulationer genererer typisk en enkelt endepunktsmåling, der ikke skelner mellem kræftcelleunderpopulationer med forskelligt invasivt potentiale. Tumormikromiljøet består også af forskellige bosiddende stromal- og immunceller, der ændrer og deltager i kræftcellernes invasive opførsel. Invasion i væv spiller også en rolle i immuncellesubpopulationer, der afværger mikroorganismer eller eliminerer syge celler fra parenchymen og endotelcellerne under vævsombygning og angiogenese. Real-Time Cellular Analysis (RTCA), der bruger impedansbiosensorer til at overvåge celleinvasion, var et stort skridt fremad ud over endepunktsmåling af invasion: dette giver kontinuerlige målinger over tid og kan således afsløre forskelle i invasionshastigheder, der går tabt i slutpunktsanalysen. Ved hjælp af den nuværende RTCA-teknologi udvidede vi dobbeltkammerarrays ved at tilføje et yderligere kammer, der kan indeholde stromal- og / eller immunceller og gør det muligt at måle invasionshastigheden under påvirkning af udskillede faktorer fra co-dyrkede stromal- eller immunceller over tid. Ud over dette giver det unikke design mulighed for at løsne kamre til enhver tid og isolere den mest invasive kræftcelle eller andre celleunderpopulationer, der er til stede i heterogene blandinger af tumorisolater, der testes. Disse mest invasive kræftceller og andre celleunderpopulationer driver ondartet progression til metastatisk sygdom, og deres molekylære egenskaber er vigtige for dybtgående mekanistiske undersøgelser, udvikling af diagnostiske sonder til påvisning af dem og vurdering af sårbarheder. Således kan inkluderingen af lægemidler med små eller store molekyler bruges til at teste potentialet i terapier, der er målrettet mod kræft og / eller stromalcelleunderpopulationer med det formål at hæmme (f.eks. Kræftceller) eller forbedre (f.eks. Immunceller) invasiv adfærd.

Introduction

Celleinvasion er en vigtig proces, der gør det muligt for celler at krydse kældermembranbarrierer som reaktion på miljømæssige signaler fra stromalceller. Det er et afgørende skridt i flere udviklingsstadier for immunresponser, sårheling, vævsreparation og maligniteter, der kan udvikle sig fra lokale læsioner til invasive og metastatiske kræftformer1. Assays udviklet tidligt for at måle det invasive potentiale i cellepopulationer genererer typisk en enkelt endepunktsmåling eller kræver formærkning af invasive celler2. Integrationen af mikroelektronik og mikrofluidik teknikker er nu udviklet til at detektere forskellige aspekter af cellebiologi såsom levedygtighed, bevægelse og fastgørelse ved hjælp af den elektriske impedans af levende celler på mikroelektroder 3,4. Impedansmåling giver mulighed for en etiketfri, ikke-invasiv og kvantitativ vurdering af cellestatus3. Her beskriver vi et tre-kammer array baseret på designet af Real-Time Cellular Analysis (RTCA) -systemet, der blev udviklet af Abassi et al.5. Det tre-kammerede array giver mulighed for vurdering af samkulturerede celler på cellulær invasion og genopretning af invasive celler til yderligere analyser eller ekspansion.

I celleanalysatorsystemet invaderer celler gennem en ekstracellulær matrix belagt på en porøs membran og når et interdigiteret elektrodearray placeret på den modsatte side af barrieren. Da de invasive celler fortsætter med at fastgøre og optage dette elektrodearray over tid, ændres den elektriske impedans parallelt. Det nuværende system består af en celleinvasion og migration (CIM) 16-brønds plade med to kamre. Instrumentet RTCA-DP (dual purpose) (kaldet dual purpose cell analyzer fremover) indeholder sensorer til impedansmåling og integreret software til analyse og behandling af impedansdata. Impedansværdier ved baseline afhænger af ionisk styrke af medier i brøndene og ændres, når celler fastgøres til elektroderne. Impedansændringerne afhænger af antallet af celler, deres morfologi og i hvilket omfang celler fastgøres til elektroderne. En måling af brøndene med medier, før cellerne tilføjes, betragtes som baggrundssignalet. Baggrunden trækkes fra impedansmålinger efter at have nået ligevægt med celler, der fastgøres og spredes på elektroderne. En enhedsløs parameter for cellernes status på en elektrode betegnet celleindeks (CI) beregnes som følger: CI = (impedans efter ligevægt – impedans i fravær af celler) / nominel impedansværdi6. Når migreringshastigheder for forskellige cellelinjer sammenlignes, kan Delta CI bruges til at sammenligne cellestatus uanset forskellen i vedhæftning, der er repræsenteret i de første par målinger.

Det nydesignede trekammerarray bygger på det eksisterende design og bruger det øverste kammer fra dobbeltcelleanalysatorsystemet, der indeholder elektroderne. De modificerede mellem- og bundkamre er tilpasset til at passe samlingen ind i celleanalysatoren med dobbelt formål til impedansmåling og analyse ved hjælp af den integrerede software. De to store fremskridt, som det nye design giver i forhold til den eksisterende cim-plade med dobbelt kammer (kaldet celleanalysatorplade fremover) er: i) evnen til at komme sig og derefter analysere invasive celleunderpopulationer, der er til stede i heterogene celleblandinger og ii) muligheden for at vurdere virkningen af udskillede faktorer fra samkultiverede stromal- eller immunceller på celleinvasion (figur 1).

Denne teknologi kan være nyttig til at studere delpopulationer af celler med forskellige invasive kapaciteter. Dette omfatter a) invasive kræftceller, der invaderer omgivende væv eller blod og lymfekar eller ekstravaserer på metastatiske såningssteder i fjerne organer, b) celler fra immunsystemet, der invaderer væv for at tackle patogener eller syge celler, c) endotelceller, der invaderer væv for at danne nye blodkar under vævsomorganisering eller sårheling, samt (d) stromalceller fra tumormikromiljøet, der understøtter og invaderer sammen med kræftceller. Tilgangen tillader inkludering af stromal cross-talk, der kan modulere cellemotilitet og invasion. De gennemførlighedsundersøgelser, der er vist her, bruger dette modificerede array med fokus på kræftcelleinvasion og interaktionen med stroma som et modelsystem, herunder endotelinvasion som reaktion på differentielle signaler fra kræftceller. Fremgangsmåden kan ekstrapoleres for at isolere kræftceller og andre celletyper såsom subpopulationer af immunceller, fibroblaster eller endotelceller. Vi testede invasive og ikke-invasive etablerede brystkræftcellelinjer som et bevis på princippet. Vi brugte også celler fra patientafledt xenograft (PDX) invasion som reaktion på immunceller fra human knoglemarv for at vise gennemførlighed til fremtidig brug også i kliniske diagnostiske indstillinger. PDX er patienttumorvæv, der implanteres i immunkompromitteret eller humaniseret musemodel for at muliggøre undersøgelse af vækst, progression og behandlingsmuligheder for den oprindelige patient 7,8.

Protocol

Undersøgelsen blev gennemgået og betragtet som “fritaget” af Institutional Review Board of Georgetown University (IRB # 2002-022). Friskhøstet knoglemarvsvæv blev indsamlet fra kasserede sunde humane knoglemarvsopsamlingsfiltre, der var blevet afidentificeret. 1. Nyt kammerdesign (figur 2) Åbn en ny dobbeltkammercelleanalysatorplade. Sæt det øverste kammer til side med elektroder. Brug en fræsemaskine t…

Representative Results

Ved hjælp af det nydesignede trekammerarray blev invasion af cellerne testet i nærvær eller fravær af stromalceller såsom fibroblaster. MDA-MB-231 celleinvasion blev forbedret, når bestrålede schweiziske 3T3 fibroblaster (J2-stamme) blev podet i bundkammeret, hvilket muliggør udveksling af faktorer mellem de to cellelinjer. Interessant nok steg MDA-MB-231 invasionen, da 3T3-J2-celler blev fordoblet i antal (figur 3A). På den anden side synes invasionshastigheden af en invasiv klon a…

Discussion

Vi har ændret designet af et dobbeltkammeret array til at omfatte et tredje kammer til overvågning af celleinvasion i realtid i nærværelse af stromalceller. Vi har observeret forskellige virkninger af co-dyrkede fibroblaster på invasive og ikke-invasive kræftceller, hvilket indikerer, at arrayet kan bruges til at skelne mellem kræftcellesubpopulationer, der reagerer forskelligt på faktorer produceret af samkulturerede stromale celler. Arrayet blev også brugt til at overvåge endotelcelleinvasion i stromalvæv, e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke Dr. Alana Welms, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, for at give os de patientafledte xenografts (HCI-010). Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud R01CA205632, R21CA226542 og delvist af en bevilling fra Agilent Technologies.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Thermofisher 25300-054
Adhesive Norland Optical Adhesive NOA63
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A9418
Cell lifter Sarstedt 83.1832
Cholera Toxin from Vibrio cholerae Thermofisher 12585-014
CIM-plate Agilent 5665817001 Cell analyzer plate
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma C0130
Dispase StemCell 7913
DMEM Thermofisher 11995-065
DMEM-F12 Thermofisher 11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated Omega Scientific FB-12
HEPES Thermofisher 15630106
Horse serum (HS) Gibco 16050-122
Human EGF Peprotech AF-100-15
Human umbilical Vein endothelail cells (HUVEC) LONZA (RRID:CVCL_2959) C-2517A
HUVEC media LONZA CC-3162
Hydrocortisone Sigma H4001
Insulin Transferrin Selenium Ethanolamine (ITSX) (100x) Thermofisher 51500056
Insulin, Human Recombinant, Zinc Solution Sigma C8052
J2 Fibroblasts Stemcell (RRID:CVCL_W667) 100-0353
LymphoPrep Stemcell 7851 Density gradient medium for the isolation of mononuclear cells
Matrigel Corning 354230 Basement membrane matrix
MCFDCIS.com cells ( DCIS) RRID:CVCL_5552
MDA-MB-231 cells RRID:CVCL_0062
Milling machine Bridgeport Series 1 Vertical
Phosphate-buffered saline (1x) Thermofisher 10010049
Polyethersulfone (PES) membrane Sterlitech PCTF029030
RBC lysis solution Stemcell 7800
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004
RTCA DP analyzer Agilent 3X16 Dual purpose cell analyzer
Trypsin Sigma T4799

References

  1. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  2. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115 (3), 453-466 (1962).
  3. Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors & Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
  4. Stylianou, D. C., et al. Effect of single-chain antibody targeting of the ligand-binding domain in the anaplastic lymphoma kinase receptor. Oncogene. 28 (37), 3296-3306 (2009).
  5. Abassi, Y. A., Wang, X., Xu, X. Real time electronic cell sensing system and applications for cytotoxcity profiling and compound assays. United States Patent. , 1-88 (2013).
  6. Abassi, Y. A., et al. Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays. Journal of Immunological Methods. 292 (1-2), 195-205 (2004).
  7. Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 2 (2), 247-250 (2007).
  8. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  9. Sharif, G. M., et al. An AIB1 isoform alters enhancer access and enables progression of early-stage triple-negative breast cancer. Cancer Research. 81 (16), 4230-4241 (2021).
  10. Caileau, R., Olive, M., Cruciger, Q. V. Long-term human breast carcinoma cell lines of metastatic origin: preliminary characterization. In Vitro. 14 (11), 911-915 (1978).
  11. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
  12. Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. Journal of the National Cancer Institute. 92 (14), 1185-1186 (2000).
  13. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., zenaa, W. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 1-19 (2020).
  14. Nkosi, D., Sun, L., Duke, L. C., Meckes, D. G. Epstein-Barr virus LMP1 manipulates the content and functions of extracellular vesicles to enhance metastatic potential of recipient cells. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009023 (2020).
  15. Eisenberg, M. C., et al. Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20078-20083 (2011).

Play Video

Cite This Article
Sharif, G. M., Der, L., Riegel, A. T., Paranjape, M., Wellstein, A. Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures. J. Vis. Exp. (181), e63512, doi:10.3791/63512 (2022).

View Video