Summary
Die Zerstörung bestimmter Zellen im Embryo ist ein mächtiges Werkzeug, um zelluläre Interaktionen zu untersuchen, die am Zellschicksal beteiligt sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt Techniken zur Laserablation von Zielzellen im frühen Embryo der Braunalge Saccharina latissima.
Abstract
Bei Saccharina latissima entwickelt sich der Embryo als einschichtiges Zellblatt, das als Lamina oder Klinge bezeichnet wird. Jede Embryozelle ist leicht zu beobachten, leicht von ihren Nachbarn zu unterscheiden und kann individuell anvisiert werden. Seit Jahrzehnten wird die Laserablation zur Untersuchung der Embryonalentwicklung eingesetzt. Hier wurde ein Protokoll zur zellspezifischen Laserablation für frühe Embryonen der Braunalge S. latissima entwickelt. Die vorgestellte Arbeit umfasst: (1) die Vorbereitung von Saccharina-Embryonen mit einer Beschreibung der kritischen Parameter, einschließlich der Kulturbedingungen, (2) die Laserablationseinstellungen und (3) die Überwachung des nachfolgenden Wachstums des bestrahlten Embryos mittels Zeitraffermikroskopie. Darüber hinaus werden Details zu den optimalen Bedingungen für den Transport der Embryonen von der Bildgebungsplattform zurück ins Labor gegeben, was die spätere Embryonalentwicklung tiefgreifend beeinflussen kann. Algen aus der Ordnung der Laminariales weisen ähnlich wie Saccharina ähnliche Embryogenesemuster auf; dieses Protokoll lässt sich somit leicht auf andere Arten in diesem Taxon übertragen.
Introduction
Die Laserablation wird seit Jahrzehnten zur Untersuchung der Embryonalentwicklung eingesetzt. Die Bestrahlung von Embryozellen mit einem Laserstrahl ermöglicht es, das Regenerationspotenzial und die Veränderung der Zelllinie während der Embryogenese zu überwachen und den Einfluss einer gezielten Ablation auf die Zellteilung und das Zellschicksal zu untersuchen. Die Modellorganismen, die in Laserablationsmethoden verwendet werden, sind typischerweise Tiere, wie Insekten 1,2, Nematoden 3,4, Wirbeltiere 5,6 und gelegentlich Pflanzen 7,8. Darüber hinaus wurde 1994 und 1998 ein Laser-Mikroablationsansatz an der Braunalge Fucus verwendet, um die Rolle der Zellwand bei der Photopolarisation des frühen Embryos 9,10 zu demonstrieren.
Braunalgen gehören zur Gruppe der Stramenopiles, die sich vor 1,6 Milliarden Jahren an der Wurzel des eukaryotischen Baumes abspalteten. Dadurch sind sie phylogenetisch unabhängig von anderen vielzelligen Organismen wie Tieren und Pflanzen11. Saccharina latissima gehört zur Ordnung der Laminariales, besser bekannt als Seetang, und sie gehören zu den größten Organismen der Erde und erreichen Größen von über 30 m. Saccharina sp. ist eine große Alge, die für viele Anwendungen wie Lebens- und Futtermittel verwendet wird, und ihre Polysaccharide werden für den Einsatz in der landwirtschaftlichen, pharmakologischen und kosmetischen Industrie weltweit extrahiert12, 13. Seine Kultivierung, hauptsächlich in Asien und in jüngster Zeit in Europa, erfordert die Vorbereitung von Embryonen in Brütereien, bevor Jungtiere im offenen Meer freigelassen werden. Wie alle Seetange hat es einen biphasischen Lebenszyklus, der aus einer mikroskopisch kleinen gametophytischen Phase besteht, in der ein haploider Gametophyt wächst und Gameten zur Befruchtung produziert, und einer diploiden makroskopischen sporophytischen Phase, in der sich eine große planare Klinge entwickelt, die von ihrem Festhalten am Meeresboden oder an Felsen befestigt ist. Der Sporophyt setzt bei der Reife haploide Sporen frei und schließt damit den Lebenszyklus14,15,16 ab.
S. latissima weist einige interessante morphologische Merkmaleauf 17. Sein Embryo entwickelt sich als einschichtiges planares Blatt15,18,19, bevor es eine mehrschichtige Struktur annimmt, die mit der Entstehung verschiedener Gewebetypen zusammenfällt. Darüber hinaus ist Laminariales eines der wenigen Taxa von Braunalgen, deren Embryonen an ihrem mütterlichen Gametophytengewebe haften bleiben (Desmarestiales und Sporochnales tun dies auch15). Dieses Feature bietet die Möglichkeit, die Rolle des mütterlichen Gewebes in diesem Entwicklungsprozess zu untersuchen und die mütterlichen Kontrollmechanismen in Braunalgen mit denen in Tieren und Pflanzen zu vergleichen.
Dieser Artikel stellt das erste vollständige Protokoll für die Laserablation in einem frühen Seetangembryo vor. Dieses Protokoll mit UV-ns-gepulster Technik führt zur spezifischen Zerstörung einzelner Embryozellen, um ihre jeweilige Rolle während der Embryogenese zu untersuchen. Das Verfahren bietet einen zuverlässigen Ansatz zur Untersuchung von Zellinteraktionen und Zellschicksal während der Embryogenese in Laminariales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produktion von Saccharina latissima Gametophyten
- Sammle reife Sporophyten von S. latissima aus der Wildnis wie zuvor beschrieben20,21. Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Sporophyten frei von Epiphyten (kleine Organismen, die auf der Oberfläche der Klinge sichtbar sind) oder inneren Parasiten (in den gebleichten Bereichen oder Flecken auf der Klinge) sind.
- Schneiden Sie mit einem Skalpell den dunkelsten Teil in der Mitte der Klinge (fruchtbares sporenproduzierendes Gewebe22) in 1-5 quadratische Stücke (1 cm²) und vermeiden Sie dabei gebleichte Flecken, falls vorhanden.
- Entfernen Sie alle verbleibenden Epiphyten, indem Sie die geschnittenen Stücke vorsichtig mit der Rückseite eines Skalpells und etwas saugfähigem Papier reinigen.
- Legen Sie die gereinigten Stücke 45 Minuten lang in eine Glasschale, die mit sterilem natürlichem Meerwasser gefüllt ist (siehe Materialtabelle), um Sporen nach dem zuvor veröffentlichten Bericht22 freizusetzen.
- Entfernen Sie die Klingenstücke und filtern Sie das Meerwasser durch ein 40 μm Zellsieb, um Ablagerungen oder unerwünschte Organismen zu entfernen.
- Verdünnen Sie die Sporen im Filtrat auf eine Konzentration von 20-40 Sporen/ml in Kunststoff-Petrischalen22.
- Legen Sie die Sporenlösung in einen Kulturbehälter (siehe Materialtabelle), der mit den optimalen Kulturbedingungen (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, Photoperiode 16:8 L:D) konfiguriert ist.
- Lassen Sie die Sporen keimen und entwickeln Sie sich zu Gametophyten.
HINWEIS: Die Sporenkeimung ist nach 2 Tagen im Schrank sichtbar, und die erste Zellteilung der gametophytischen Zellen erfolgt normalerweise innerhalb der folgenden 48 h. - Ersetzen Sie das Wachstumsmedium nach 5 Tagen durch mikrofiltriertes natürliches Meerwasser, angereichert mit einer 0,5-fachen Provasoli-Lösung (NSW1/2) (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Um eine Wiederholung dieser Schritte zu vermeiden, können bestimmte männliche und weibliche Gametophyten ausgewählt und für mehrere Monate vegetativ vermehrt werden. Die Gametophyten bleiben vegetativ, wenn sie unter rotem Licht (4 μE.m-2.s-1 mit einer Wellenlänge von mindestens 580 nm)23 unter den gleichen oben beschriebenen Kulturbedingungen (Schritt 1.7) gezüchtet werden.
2. Fragmentierung und Induktion der Oogenese
- Ernten Sie Gametophyten mit einem Zellenschaber.
- Zerkleinern Sie mit einem kleinen Plastikstößel die gesammelten Gametophyten in einem 1,5-ml-Röhrchen in 4-5-zellige Stücke.
- Füllen Sie das Rohr mit 1 mL NSW1/2 (Schritt 1.9).
- Geben Sie 2,5 μL der zerkleinerten Gametophytlösung in 3 ml natürliches Meerwasser, angereichert mit 1x Provasoli-Lösung (NSW), und geben Sie sie in eine Petrischale.
HINWEIS: Für eine einfachere Handhabung wird eine 25 mm große Petrischale mit Glasboden empfohlen. - Die zubereiteten Speisen in einen Kulturschrank geben und bei 13 °C unter weißem Licht mit einer Intensität von 24 μE.m-2.s-1 (schwaches Licht, Photoperiode 16:8 L:D) eine Gametogenese induzieren.
HINWEIS: Die erste Gametangie (weibliche Oogonia und männliche Archegonie) kann nach 5 Tagen beobachtet werden. Das Männchen ist hyperverzweigt mit kleinen Zellen, und das Weibchen besteht aus größeren Zellen, die lange Filamentebilden 15,22. Die ersten Eier werden ~ 10 Tage später beobachtet, und die erste Teilung von Zygoten tritt normalerweise innerhalb der folgenden 2 Tage auf. - Sechs Tage nach der Beobachtung der ersten Eier das Geschirr auf hellere weiße Lichtverhältnisse umstellen: 50 μE.m-2.s-1, Photoperiode 16:8 L:D, immer noch bei 13 °C.
3. Bildaufnahme zur Auswahl von Embryonen für die Ablation und Überwachung des nachfolgenden Wachstums
- Stellen Sie sich die gesamte Petrischale vor, um die während des Ablationsschritts ausgewählten Embryonen (neu) zu lokalisieren (keine Notwendigkeit, die Schale zum Augenmikroskop zurückzubringen) und die nachfolgende Entwicklung der ausgewählten Embryonen zu überwachen.
HINWEIS: Verwenden Sie ein inverses Laserscanning-Konfokalmikroskop (siehe Materialtabelle) für die Bildgebung (Abbildung 1), und die Laserablation wird in Schritt 5 beschrieben. - Stellen Sie die Petrischale auf die Bühne und orientieren Sie sie mit einer visuellen Markierung (z. B. zeichnen Sie eine Linie mit einem Permanentmarker).
- Verwenden Sie das 10x/0,45-Ziel, um sich auf einen Embryo zu konzentrieren. Notieren Sie sich die Position der vier Himmelsrichtungen der Petrischale.
- Starten Sie den Kachelscan. Erfassen Sie übertragene/fluoreszierende Bilder der gesamten Petrischale mit niedriger Auflösung: 256 x 256 Pixel, eine Pixelverweilzeit von 1,54 μs mit bidirektionalem Scannen und ein digitaler Zoom von 0,6x mit einem 561-nm-Laser bei einer Transmission von 1,2%.
HINWEIS: Die Scanzeit für eine ganze 2,5 cm große Petrischale beträgt ~6 min für 225 Fliesen (Abbildung 2). Hier wurde der 561-nm-Laser für die Transmissions- und Fluoreszenzbildgebung eingesetzt. Das Fluoreszenzsignal wurde zwischen 580 und 720 nm auf den konfokalen Photomultipliern (PMT) und das durchgelassene Licht auf der transmittierten PMT gesammelt. Der 561-nm-Laser kann bei diesem Schritt auch Chlorophyll überwachen, aber es ist unnötig, weil es nur hilft, das Signalrauschen und die Organismen richtig zu unterscheiden. - Speichern Sie das Kachelscanbild und halten Sie es im Fenster der Bilderfassungssoftware (siehe Materialtabelle) geöffnet.
- Ändern Sie das Ziel, entfernen Sie die Petrischale nicht.
HINWEIS: Das 40x/1.2 Wasserobjektiv wurde zur Seite der Bühne bewegt, so dass das Tauchmedium (Wasser) dem Objektiv hinzugefügt werden konnte, ohne die Petrischale aus ihrer Ausgangsposition zu bewegen. - Navigieren Sie durch das zuvor aufgenommene Kachelscanbild, um den geeigneten Embryo auszuwählen. Sobald ein Embryo auf diesem Bild identifiziert wurde, bewegen Sie das Stadium in die genaue Position des Embryos und erfassen Sie übertragene / fluoreszierende Bilder dieses Embryos mit hoher Auflösung.
HINWEIS: Hochauflösende Einstellungen: 512 x 512 Pixel, 0,130 μm/Pixel, 0,208 μs Pixelverweilzeit mit monodirektionalem Scannen und 2x digitaler Zoom mit einem 561 nm Laser bei 0,9% Transmission. - Kommentieren Sie das Kachelscanbild für jeden Embryonenkandidaten für die Laserablation (Abbildung 2B) und fahren Sie mit dem Laserablationsschritt fort.
4. Laserkalibrierung
- Kalibrieren Sie den Laser und synchronisieren Sie die Bilderfassungssoftware mit der Lasertreiber-Software im "Click & Fire-Modus" und einem gepulsten 355-nm-Laser.
HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um eine perfekte Synchronisation zwischen der Position des Mauszeigers in der Lasertreibersoftware (siehe Tabelle der Materialien) und der Position im Livebild der Erfassungssoftware zu gewährleisten. - Öffnen Sie das Lasertreiber-Softwarepaket und klicken Sie im Bilderfassungssoftwarepaket auf Live .
- Synchronisieren Sie beide Softwarepakete, indem Sie im Lasertreiber-Softwarepaket auf Erfassung starten klicken. Das Livebild wird nun auch in der UV-Laser-Treiber-Software aufgenommen.
- Definieren Sie einen Interessenbereich (AOI), indem Sie auf die Schaltfläche AOI auswählen klicken und auf die Bildränder (rechts, links, oben und unten) im UV-Lasertreiber-Softwarepaket klicken.
HINWEIS: Nach diesem Kalibrierungsschritt müssen die Einstellungen für Pixelgröße, Bildformat und Zoom im Erfassungssoftwarepaket konstant bleiben. - Wählen Sie einen leeren Bereich auf der Schale und senken Sie den Pegel des Tisches auf 20 μm unterhalb der Probenbrennebene, um sich auf den Glasboden zu konzentrieren.
- Legen Sie die Ablationslaser- und Bildgebungslaser-Trajektorien fest, indem Sie auf Kalibrierung starten klicken und Manuelle Kalibrierung wählen.
- Wählen Sie eine Laserleistung, die hoch genug ist, um einen schwarzen Punkt in der Mitte des Livebildes zu sehen, der dem Loch im Glasdeckel entspricht (alle Fensterläden müssen geöffnet sein).
- Klicken Sie mit dem Mauszeiger auf diesen zentralen schwarzen Punkt und klicken Sie auf 18 zusätzliche Punkte , die von der Software vorgeschlagen werden, um den Ausrichtungsvorgang abzuschließen.
- Überprüfen Sie die Kalibrierung im "Click & Fire-Modus" auf demselben Deckblatt.
HINWEIS: Die Laserkalibrierung hängt von den Bildgebungsparametern ab. Stellen Sie nach der Kalibrierung des Lasers sicher, dass sich die Bildgebungsparameter (d. h. 512 x 512 Pixel, 0,130 μm/Pixel, 0,208 μs Pixelverweilzeit bei monodirektionalem Scannen und 2-fachem Digitalzoom) nicht geändert haben.
5. Laserablation
- Wählen Sie einen Embryo von Interesse. Starten Sie eine Zeitrafferaufnahme in der Bildaufnahmesoftware.
- Erfassen Sie Sende-/Fluoreszenzbilder mit einem 40x/1,2-W-Objektiv bei hoher Auflösung (d. h. 512 x 512 Pixel, 0,130 μm/Pixel, 1,54 μs Pixelverweilzeit mit monodirektionalem Scannen und 2-fachem Digitalzoom mit einem 561-nm-Laser bei 0,9 % Transmission). Erfassen Sie die Zeitrafferaufzeichnung mit maximaler Geschwindigkeit.
- Verkleinern Sie den Bereich zu Beginn der Zeitrafferaufzeichnung. Vergrößern Sie den AOI.
- Verwenden Sie die Funktion "Click & Fire" der Lasertreibersoftware, um die schädliche Bestrahlung auf die Zelle von Interesse im Embryo anzuwenden. Verwenden Sie die folgenden Parameter: 45% Lasertransmission (entspricht maximal 40 μW) und 1 ms Pulszeitdauer (Schritt 4).
HINWEIS: Videoaufnahmen während der Laseraufnahme werden empfohlen. - Überwachen Sie unter 688 nm den Ausstoß autofluoreszierender Chloroplasten aus dem Zytoplasma.
- Wenn der Zellinhalt in der Zelle verbleibt, verwenden Sie erneut die Funktion "Click & Fire", um die Größe des Verstoßes in der Zelle zu erhöhen. Wiederholen Sie den Vorgang, und beschränken Sie die Anzahl der Aufnahmen auf ein Minimum, bis der größte Teil des Zellinhalts freigegeben wurde.
- Stoppen Sie die Zeitrafferaufzeichnung, nachdem sich der Embryo stabilisiert hat (d.h. es kann keine weitere intrazelluläre Bewegung festgestellt werden (~1-5 min).
- Aktualisieren Sie bei Bedarf die Anmerkungen auf dem Kachelscanbild.
6. Überwachung des Wachstums bestrahlter Embryonen
HINWEIS: Die Überwachung erfolgt über mehrere Tage.
- Bestimmen Sie die Überlebensrate, indem Sie die Anzahl der Embryonen überwachen, die sich nach der Laserablation entwickeln, und vergleichen Sie sie mit denen, die sterben.
HINWEIS: Einige Embryonen sterben aus verschiedenen Gründen unmittelbar nach der Ablation. Eine hohe und schnelle Sterblichkeitsrate ist in der Regel ein Zeichen für ungeeignete Laserparameter oder eine höhere/längere Stressbelastung während des Experiments oder des anschließenden Transports. - Bestimmen Sie die Wachstumsverzögerung, indem Sie jeden Tag die Länge der lasergeschossenen Embryonen messen und mit intakten Embryonen vergleichen.
HINWEIS: Die Wachstumsrate von lasergeschossenen Organismen ist im Allgemeinen langsamer als die von unbehandelten Organismen. Einige (unangemessene) Lasereinstellungen können jedoch das Wachstum für mehr als eine Woche hemmen, wobei das Wachstum danach wieder einsetzt. - Finden Sie den angrenzenden Schaden heraus, indem Sie die Reaktion von Zellen überwachen, die an die abgetragenen Zellen angrenzen. In einigen Fällen kann die Druckentlastung nach dem Ausbruch dazu führen, dass benachbarte Zellen platzen.
- Überprüfen Sie auf Mikrobenkontaminationen. Überwachen Sie das Wachstum von Mikroalgen und Bakterien im Medium. Wenn eine ungewöhnliche Menge an Mikroben in der Schale vorhanden ist, verwerfen Sie sie und wiederholen Sie das Protokoll aus Schritt 2 oder Schritt 3.
HINWEIS: Nach der Laserablation sind beschädigte S. latissima-Embryonen bereits stark beansprucht, und zusätzlicher äußerer Stress kann zu einer erhöhten Mortalität führen. Bakterielle oder virale Ausbrüche sind möglich, weil die behandelten Embryonen nicht unter axenischen Bedingungen wachsen können. - Überprüfen Sie die globale Entwicklung der Schussorganismen, indem Sie den Phänotyp untersuchen und die Rolle bei der Entwicklung der Zielregion verstehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gametophyten von S. latissima wurden gezüchtet, und die Gametogenese wurde induziert, um Zygoten und Embryonen zu produzieren. Zwölf Tage nach der Induktion der Gametogenese unterzogen sich die Embryonen einer Laserablation. Hier zielte das Experiment darauf ab, die Rolle bestimmter Zellen in der Gesamtentwicklung von S. latissima-Embryonen zu bewerten. Die apikalste Zelle, die basalste Zelle und die medianen Zellen wurden ins Visier genommen. Nach dem Scannen der Fliesen wurde die gesamte Petrischale (Abbildung 2A), ein interessanter Embryo, als geeigneter Kandidat für das Laserschießen identifiziert (Abbildung 2B). Eine spezifische Zelle dieses Embryos wurde ausgewählt, gezielt und mit einem gepulsten UV-Laserstrahl mit maximal 40 μW Laserleistung (entspricht 45% der maximalen Leistung für die hier verwendeten Geräte) für 1 ms (Film 1) geschossen. Die Zelle setzte ihren Inhalt (Chloroplasten und Zytoplasma) frei. Interessanterweise reagierten benachbarte Zellen auf das Platzen der bestrahlten Zelle, indem sie sich in den Interzellularraum ausdehnten. Die Position der bestrahlten Embryonen wurde für die anschließende Überwachung über 10 Tage aufgezeichnet (Abbildung 3). Die meisten der bestrahlten Embryonen entwickelten sich weiter, zeigten aber eine Wachstumsveränderung (Embryoform). Eine detaillierte Analyse der morphologischen Veränderungen muss durchgeführt werden, bevor jeder bestrahlten Zelle eine bestimmte Funktion bei der Steuerung des gesamten Entwicklungsmechanismus zugeschrieben werden kann.
Im Gegensatz dazu wurden Embryonen mit anderen Laserparametern getestet (z. B. 33 ms für die Aufnahmedauer von 60% -80% Laserleistung; Film 2) zeigte schnell Anzeichen von starkem Stress wie Zellbleichen, Ausbleichen oder Formveränderungen (Rundung). Fast alle auf diese Weise geschossenen Embryonen starben innerhalb von fünf Tagen nach dem Experiment ab (Abbildung 4).
Abbildung 1: Foto des Laserablationsmikroskop-Aufbaus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Kommentierter Fliesenscan einer ganzen Petrischale. (A) Kachelscan der gesamten Petrischale, die für die Laserablation verwendet wird. Die Transmission PMT wurde verwendet, um einen Hellfeld-Scan zu erhalten. Sobald ein Embryo von Interesse gefunden wurde, klickt der Benutzer auf die Position des Embryos im Kachelscan, und die Software positioniert das Stadium direkt über dem Embryo. (B) Der Kachelscan kann dann speziell annotiert werden, um den Embryo in den nachfolgenden Schritten zu lokalisieren, den Embryo zu verfolgen und zu überwachen. Hier zeigt das Bild einen Embryo, der am Boden der Petrischale befestigt ist und mit dem 561-nm-Laser leicht lokalisiert werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Zeitreihe des wachsenden S. latissima-Embryos nach Bestrahlung. Dies wird in Film 1 gezeigt. Die Laserablation der apikalsten Zelle des Embryos bleichte die benachbarten Zellen des Embryos nicht aus. Sie wuchsen und teilten sich weiter und bildeten nach einigen Tagen einen normalen Embryo. Die Bilder wurden alle 24 h, 2-9 Tage nach der Ablation aufgenommen. Der Maßstab beträgt 50 μm und ist für alle Fotos gleich. D2-D9 entspricht Tag-2 bis Tag-9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Zeitreihe des Embryotodes von S. latissima nach Laserablation unter Verwendung suboptimaler Parameter. Eine übermäßige Exposition gegenüber Laserbestrahlung kann leicht zu höheren Todesraten des Zielembryos und auch der benachbarten Embryonen führen. Eine Zeitreihe des in Film 2 aufgenommenen Embryos wird gezeigt, wobei die Zeit nach der Ablation über jedem Foto angegeben ist (3-6 Tage nach der Ablation). Der Maßstabsbalken beträgt 30 μm und gilt für jedes Foto. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Film 1: Laserablation der apikalsten Zelle eines 8-zelligen Embryos von S. latissima. Der Fokus wurde zunächst auf den Embryo gelegt, der aus einem Bouquet von Saccharina-Sporophyten ausgewählt wurde (an verschiedenen Feldern, zuerst breit, dann schmal). Die apikalste Zelle des Embryos wurde dann mit 45% Laserleistung für 1 ms geschossen. Die apikale Zelle platzte schnell und setzte ihren Inhalt frei. Die benachbarten Zellen, befreit vom Turgor der geplatzten Zelle, füllten den leeren Raum. Nach 5 min haben die Zelle und ihr Inhalt aufgehört, sich zu bewegen und haben einen Zustand des Gleichgewichts erreicht. Der Film wurde 4 mal beschleunigt (von 1 Bild pro 632 ms auf 6 fps). Die Nachverfolgung der Embryonalentwicklung ist in Abbildung 3 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Film 2: Signifikantes Bleichen von Zellen, die an eine Berstzelle angrenzen, verursacht durch suboptimale Lasereinstellungen. Die Verwendung einer Laserleistung von 60% -80% für 1 ms oder einer Laserleistung von 45% für 10 ms führte zu einer signifikanten Bleiche benachbarter Zellen und einer viel niedrigeren Überlebensrate. Die für den Laser verwendeten Einstellungen sollten kein Bleichen oder eine teilweise Beschädigung benachbarter Zellen verursachen. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, indem die Leistung und/oder Dauer des Laserpulses reduziert und der Punkt anvisiert wurde, der am weitesten von den benachbarten Zellen entfernt war. Hier wird die apikalste Zelle eines 4-zelligen Embryos von S. latissima geschossen (80% Laserleistung, 1 ms) (seitliche/obere Ansicht). Eine Überbleichung der unteren und lateralen Zellen ist leicht zu beobachten. Die anschließende Entwicklung des Embryos ist in Abbildung 4 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 1: Schematisches Flussdiagramm des gesamten Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die lokale zelluläre Laserablation ermöglicht eine zeitliche und räumliche Ablation mit hoher Präzision. Seine Effizienz kann jedoch durch die Nichtzugänglichkeit von Zielzellen beeinträchtigt werden; Zum Beispiel sind alle Zellen von einem dreidimensionalen Embryo. Dieses Protokoll wurde am Embryo der Alge Saccharina latissima entwickelt, die eine einschichtige Lamina entwickelt, in der alle Zellen leicht identifiziert und einzeln mit einem Laserstrahl zerstört werden können.
Laserleistung und Wellenlänge
NIR fs-gepulster Laser wird häufig in Entwicklungsstudien an Tieren24,25 verwendet. Bei Braunalgen wie Saccharina konnte der Laser die Zelle jedoch nicht platzen lassen, ohne den gesamten Embryo zu verbrennen. Diese Reaktion kann mit der hohen Aktivität der Chloroplasten-Lichterntemaschinen zusammenhängen.
Unter Verwendung des ns-gepulsten UV-Lasers für die Ablation wurden zwei Ansätze getestet: (1) die Verwendung eines Hochleistungspulses über einen kurzen Zeitraum oder (2) die Verwendung einer geringeren Laserbelichtung über einen längeren Zeitraum. Die vom Laser gelieferte Energie, eine Kombination aus Laserleistung und Pulsdauer, beeinflusst die Energie, die an die bestrahlte Zelle abgegeben wird. Die abgegebene Energie kann auch die umgebenden Zellen durch Reflexion und Beugung beeinflussen. Daher wurden die niedrigsten Einstellungen der beiden Parameter ausgewählt, die reproduzierbare Ergebnisse lieferten, um unerwünschte Kollateraleffekte zu reduzieren. Die Laserleistung zwischen 25-40 μ W.cm-2 mit einem Puls von 1 ms schien optimal zu sein. Mit diesen Parametern wurde die Wirkung des UV-Lasers auf einer sehr lokalen Ebene eingedämmt, ohne sichtbares Bleichen in den umgebenden Zellen, aber effizient genug, um die Zielzelle zum Platzen zu bringen. Diese Parameter wurden wiederholt ohne direkte tödliche Wirkung auf die Embryonen angewendet. Längere Pulszeiten oder eine höhere Laserleistung verursachten das Ausbleichen der umgebenden Zellen oder sogar den Tod des Embryos, während niedrigere Werte nicht ausreichten, um die Zellwand zu brechen.
Algenmaterial und Kulturbedingungen
Obwohl diese Technik präzises Schießen auf subzellulärer Ebene ermöglicht, muss der Experimentator vier kritische Faktoren berücksichtigen, um eine zuverlässige Interpretation der Ergebnisse zu ermöglichen. Diese Punkte müssen sowohl vor als auch nach dem Laserablationsexperiment berücksichtigt werden.
Der erste zu berücksichtigende Faktor ist die Populationsdichte der Embryonen. Negatives Crowding wirkt sich auf die Entwicklungsrate von S. latissima26 aus. Niedrige Dichten sorgen für (1) eine bessere Pulswiederholbarkeit, da die Anwesenheit anderer Embryonen im Laserpfad seine Leistung verringern kann, und (2) eine einfachere Überwachung der vom Laser aufgenommenen Embryonen, die etwas langsamer wachsen als intakte Embryonen; Letzteres bedeckte schnell die geschossenen Embryonen. Der zweite kritische Faktor dieses Protokolls ist die Temperatur, bei der das Experiment durchgeführt wird. Der Laserstrahl selbst erwärmt die Probe, aber die Temperatur des Raumes und die lokale Umgebung des Mikroskops tragen zu den Gesamttemperaturbedingungen bei, die die Probe erlebt, nahe 18-22 ° C. Hier wurde der Raum des Mikroskops nicht gekühlt, da diese Geräte hauptsächlich für tierische Zellen verwendet werden, die Umgebungstemperaturen tolerieren. Glücklicherweise konnten Saccharina-Embryonen Temperaturen von 22 °C (9 °C höher als die optimale Kulturtemperatur von 13 °C) bis zu 4 h standhalten. Geräte zur Aufrechterhaltung einer niedrigen Umgebungstemperatur, wie z. B. eine ausreichende Belüftung oder ein Kühlplattenhalter, können jedoch dazu beitragen, das Risiko nachteiliger Auswirkungen auf das Überleben und die Entwicklung der Algenembryonen zu verringern. Darüber hinaus kann eine langsame Vorakklimatisierung der Gametophyten auf 16 °C unter rotem Licht den Embryonen helfen, Temperaturspitzen während des Ablationsprozesses standzuhalten. Drittens wird den Embryonen zusätzlich zum Temperaturanstieg für die Dauer des Experiments eine geeignete Lichtquelle entzogen. Darüber hinaus können die Chloroplasten teilweise durch den 561-nm-Laser gebleicht werden. Die geringstmögliche Leistung des 561-nm-Lasers hilft, diesen Effekt zu reduzieren. Viertens ist auch der Transport ein kritischer Faktor, der berücksichtigt werden muss, da nicht in allen Labors Laserablationsgeräte verfügbar sind. Temperaturspitzen und äußere Bewegungen oder Stöße sollten vermieden werden, um die Verdrängung, den Verlust oder den Tod des Algenmaterials zu verhindern. Wann immer möglich, müssen die Transportboxen gekühlt, vibrationsfest (z.B. stoßdämpfender Schaumstoff) und mit Leuchten ausgestattet sein. Mehrere Transportboxen, die diese Anforderungen erfüllen, sind im Handel erhältlich.
Selbst wenn all diese Faktoren so weit wie möglich kontrolliert werden, kann es dennoch zu schwachen, aber potenziell erheblichen Umweltbelastungen kommen. Diese Möglichkeit muss bei der Analyse und Interpretation der Reaktion des Embryos auf die Laserablation in Betracht gezogen werden.
Neben den Umgebungsbedingungen, die während des gesamten Experiments stabil gehalten werden müssen, ist es auch eine Herausforderung, die bestrahlten Organismen während des gesamten Überwachungsschritts im Auge zu behalten. Das Wachstum der verschiedenen Embryonen verändert die ursprüngliche Landschaft im Laufe der Zeit. Wenn kein automatisiertes Mikroskop für die Überwachung des Experiments verwendet werden kann, kann die Verfolgung des Embryos nach der Laserablation leicht zeitaufwendig werden und große Datenmengen erzeugen. Videoaufnahmen während des ersten Laserablationspulses werden dringend empfohlen, um die unmittelbare Reaktion des Embryos auf den Puls zu verfolgen. Diese schnelle Überwachung des Pulseinschlags ist von erheblicher Bedeutung, da der Puls, wenn er auf die Mitte der Zelle gerichtet war, in einigen Fällen dazu führte, dass die Zielzelle schnell platzte, höchstwahrscheinlich aufgrund des Unterschieds der Osmolarität zwischen dem Inneren der Zelle und dem Medium (Meerwasser). Wenn die Leckage zu schnell war, platzten auch die benachbarten Zellen. Das Schießen auf die distalste Region der Zielzelle erwies sich als eine effiziente Möglichkeit, den Burst-Effekt auf benachbarten Zellen zu puffern. Ein weiterer effizienter Weg, um heftige Ausbrüche zu vermeiden, besteht darin, die Osmolarität des Mediums mit Saccharose27 zu erhöhen. Der Unterschied in der Osmolarität ist jedoch notwendig, um den Inhalt der Zielzelle zu eliminieren. Daher ist die Aufrechterhaltung eines ausreichenden Osmolaritätspotentials erforderlich. In einigen Fällen blockierten Chloroplasten und andere Verbindungen die durch die Laserablation entstandene Öffnung, was dazu führte, dass sich die Zellen vom Laserschuss erholten, wobei das Wachstum nach einigen Tagen wieder einsetzte. Zusätzliche Impulse, die darauf gerichtet waren, die Öffnung zu entstopfen, erwiesen sich als ausreichend, um eine Obstruktion zu verhindern.
Begrenzungen
Es muss ein Kompromiss zwischen der Laserleistung, die hoch genug sein sollte, um die Zellen zu entleeren, und dem Überleben der benachbarten Zellen, die in Algenembryonen besonders empfindlich auf Hitzestress und Photobleichen reagieren, getroffen werden. Daher ist eine genaue Überwachung der Zellen nach dem Laserschuss der Schlüssel, um diesen Schritt zu kontrollieren und sicherzustellen, dass die Zielzellen tot sind. Andernfalls kann die Interpretation der Zielzellen über das Schicksal der Nachbarzellen und damit die anschließende Entwicklung des Embryos irreführend sein.
Das Punktieren von Zellen mit einer Nadel scheint eine Alternative zu sein, bei der die Algenzellen keinen Hitze- oder Lichtstress erfahren würden. Dieser Ansatz wäre jedoch eine Herausforderung, da braune Algenembryozellen in Meerwasser eintauchen und keinen Kontakt mit einer festen Oberfläche haben. Die dicke und elastische Zellwand widersteht dem Eindringen der Nadel, selbst wenn der Embryo mit einem Mikromanipulator in einem Standard-Mikroinjektionssystem in Kontakt mit einer festen Glasoberfläche gehalten wird.
Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll das komplette experimentelle Verfahren und die Einstellungen für die Laserablation und das Monitoring von Braunalgenembryonen und die kritischen Schritte für ein erfolgreiches Experiment (Ergänzende Abbildung 1). Dieser einzigartige Ansatz ist eine vielversprechende Methode, um Zellinteraktionen und das Zellschicksal in den frühen Embryonen von Braunalgen zu untersuchen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Das PhD-Stipendium von S.B. wird von der Region Bretagne (ARED-Fördernummer COH20020) und der Sorbonne Université finanziert. I.T.is PhD-Stipendium wird von der Region Bretagne (ARED-Fördernummer COH18020) und der Norvegian NMBU University finanziert. Dieses Projekt wurde vom CNRS durch die interdisziplinären MITI-Programme finanziell unterstützt. MRic ist Mitglied der nationalen Infrastruktur France-BioImaging, die von der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR-10-INBS-04) unterstützt wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | - | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | - | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
- Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), New York, N.Y. 290-293 (1991).
- Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
- Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
- Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
- Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
- Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , https://eurekamag.com/research/003/488/003488317.php 237-250 (1998).
- Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), New York, N.Y. 1421-1423 (1994).
- Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
- Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
- Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
- Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
- Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), Hokkaido Imperial University. 221-260 (1936).
- Fritsch, F. E. The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , Cambridge University Press. Cambridge. (1945).
- Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
- Theodorou, I., Charrier, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology - Established and Emerging. Boutet, A., Schierwater, B. , Francis & Taylor Group, CRC Press. ISBN 9780367444471 485 (2021).
- Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
- Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
- Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 14986427. ISBN-13: 978-1498796422 37-59 (2018).
- Bartsch, I. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 149879627. ISBN-13: 978-1498796422 61-78 (2018).
- Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
- Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
- de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
- Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
- Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
- Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, É, Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).
