Summary
भ्रूण में विशिष्ट कोशिकाओं का विनाश सेल भाग्य में शामिल सेलुलर इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। वर्तमान प्रोटोकॉल भूरे रंग के शैवाल सैचरीना लैटिसिमा के शुरुआती भ्रूण में लक्षित कोशिकाओं के लेजर पृथक्करण के लिए तकनीकों का वर्णन करता है।
Abstract
सैकरीना लैटिसिमा में, भ्रूण एक मोनोलेयर्ड सेल शीट के रूप में विकसित होता है जिसे लैमिना या ब्लेड कहा जाता है। प्रत्येक भ्रूण कोशिका का निरीक्षण करना आसान है, आसानी से अपने पड़ोसियों से अलग है, और व्यक्तिगत रूप से लक्षित किया जा सकता है। दशकों से, भ्रूण के विकास का अध्ययन करने के लिए लेजर पृथक्करण का उपयोग किया गया है। यहां, भूरे रंग के शैवाल एस लैटिसिमा के शुरुआती भ्रूण के लिए सेल-विशिष्ट लेजर पृथक्करण के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। प्रस्तुत कार्य में शामिल हैं: (1) संस्कृति की स्थिति सहित महत्वपूर्ण मापदंडों के विवरण के साथ सैकरीना भ्रूण की तैयारी, (2) लेजर पृथक्करण सेटिंग्स, और (3) समय-चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विकिरणित भ्रूण के बाद के विकास की निगरानी। इसके अलावा, इमेजिंग प्लेटफॉर्म से प्रयोगशाला में भ्रूण के परिवहन के लिए इष्टतम स्थितियों पर विवरण प्रदान किए जाते हैं, जो बाद के भ्रूण के विकास को गहराई से प्रभावित कर सकते हैं। आदेश लामिनारियल्स से संबंधित शैवाल सैकरीना के समान भ्रूणजनन पैटर्न प्रदर्शित करते हैं; इस प्रोटोकॉल को इस प्रकार इस टैक्सोन में अन्य प्रजातियों में आसानी से स्थानांतरित किया जा सकता है।
Introduction
भ्रूण के विकास का अध्ययन करने के लिए दशकों से लेजर पृथक्करण का उपयोग किया गया है। लेजर बीम के साथ भ्रूण कोशिकाओं को विकिरणित करना पुनर्योजी क्षमता और भ्रूणजनन के दौरान कोशिका वंश के संशोधन की निगरानी करना और कोशिका विभाजन और कोशिका भाग्य पर लक्षित पृथक्करण के प्रभाव की जांच करना संभव बनाता है। लेजर पृथक्करण विधियों में उपयोग किए जाने वाले मॉडल जीव आमतौर पर जानवर होते हैं, जैसे कीड़े 1,2, नेमाटोड 3,4, कशेरुक 5,6, और कभी-कभी पौधे 7,8। इसके अलावा, प्रारंभिक भ्रूण 9,10 के फोटोपोलराइजेशन में सेल की दीवार की भूमिका को प्रदर्शित करने के लिए 1994 और 1998 में भूरे रंग के शैवाल फुकस पर एक लेजर माइक्रो-एब्लेशन दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था।
ब्राउन शैवाल स्ट्रैमेनोपाइल समूह से संबंधित हैं, जो 1.6 बिलियन साल पहले यूकेरियोटिक पेड़ की जड़ में अलग हो गए थे। नतीजतन, वे अन्य बहुकोशिकीय जीवों, जैसे जानवरों और पौधों से फाइटोलैनेटिक रूप से स्वतंत्र हैं11. सैकरिना लैटिसिमा लैमिनारियल्स के क्रम से संबंधित है, जिसे आमतौर पर केल्प्स के रूप में जाना जाता है, और वे पृथ्वी पर सबसे बड़े जीवों में से हैं, जो 30 मीटर से अधिक के आकार तक पहुंचते हैं सैकरीना एसपी एक बड़ा समुद्री शैवाल है जिसका उपयोग भोजन और फ़ीड जैसे कई अनुप्रयोगों के लिए किया जाता है, और इसके पॉलीसेकेराइड दुनिया भर में कृषि, औषधीय और कॉस्मेटिक उद्योगों में उपयोग के लिए निकाले जाते हैं12, 13. इसकी खेती, मुख्य रूप से एशिया में और हाल ही में यूरोप में, खुले समुद्र में किशोरों को छोड़ने से पहले हैचरी में भ्रूण की तैयारी की आवश्यकता होती है। सभी केल्प्स की तरह, इसमें एक सूक्ष्म गैमेटोफाइटिक चरण से बना एक द्विध्रुवीय जीवन चक्र होता है, जिसके दौरान एक अगुणित गैमेटोफाइट बढ़ता है और निषेचन के लिए युग्मक पैदा करता है, और एक द्विगुणित मैक्रोस्कोपिक स्पोरोफाइटिक चरण, जहां एक बड़ा प्लानर ब्लेड सीफ्लोर या चट्टानों से जुड़े अपने होल्डफास्ट से विकसित होता है। स्पोरोफाइट परिपक्वता पर अगुणित बीजाणुओं को छोड़ता है, जिससे जीवन चक्र 14,15,16 पूरा होता है।
एस लैटिसिमा कुछ दिलचस्प रूपात्मक विशेषताएं प्रस्तुत करता है17. इसका भ्रूण विभिन्न ऊतक प्रकारों के उद्भव के साथ मेल खाने वाली बहुस्तरीय संरचना प्राप्त करने से पहले एक मोनोलेयर्ड प्लानर शीट 15,18,19 के रूप में विकसित होता है। इसके अलावा, लैमिनारियल्स भूरे शैवाल के एकमात्र कर में से एक है जिसका भ्रूण अपने मातृ गैमेटोफाइटिक ऊतक से जुड़ा रहता है (डेसमेस्ट्रेस्टियल्स और स्पोरोचनेल्स बहुत15 करते हैं)। यह सुविधा इस विकास प्रक्रिया में मातृ ऊतक की भूमिका का अध्ययन करने और जानवरों और पौधों के साथ भूरे शैवाल में मातृ नियंत्रण तंत्र की तुलना करने का अवसर प्रदान करती है।
यह लेख प्रारंभिक केल्प भ्रूण में लेजर पृथक्करण के लिए पहला पूर्ण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यूवी एनएस-स्पंदित तकनीक से जुड़े इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप भ्रूणजनन के दौरान उनकी संबंधित भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए व्यक्तिगत भ्रूण कोशिकाओं का विशिष्ट विनाश होता है। प्रक्रिया लामिनारियल्स में भ्रूणजनन के दौरान सेल इंटरैक्शन और सेल भाग्य की जांच के लिए एक विश्वसनीय दृष्टिकोण प्रदान करती है।
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Protocol
1. सैकरीना लैटिसिमा गैमेटोफाइट्स का उत्पादन
- जंगली से एस लैटिसिमा के परिपक्व स्पोरोफाइट्स को इकट्ठा करें जैसा कि पहले20,21 वर्णित है। सुनिश्चित करें कि चयनित स्पोरोफाइट्स एपिफाइट्स (ब्लेड की सतह पर दिखाई देने वाले छोटे जीव) या आंतरिक परजीवी (ब्लेड पर प्रक्षालित क्षेत्रों या धब्बों में पाए जाते हैं) से रहित हैं।
- स्केलपेल का उपयोग करके, ब्लेड (उपजाऊ बीजाणु-उत्पादक ऊतक22) के केंद्र में सबसे गहरे हिस्से को 1-5 वर्ग टुकड़ों (1 सेमी²) में काट लें, यदि मौजूद हो तो किसी भी प्रक्षालित धब्बे से बचें।
- स्केलपेल और कुछ शोषक कागज के पीछे से कटे हुए टुकड़ों को धीरे-धीरे साफ करके किसी भी शेष एपिफाइट्स को हटा दें।
- पहले प्रकाशित रिपोर्ट22 के बाद बीजाणुओं को छोड़ने के लिए 45 मिनट के लिए बाँझ प्राकृतिक समुद्री जल (सामग्री की तालिका देखें) से भरे ग्लास डिश में साफ किए गए टुकड़ों को रखें।
- ब्लेड के टुकड़ों को निकालें और मलबे या अवांछित जीवों को हटाने के लिए 40 μm सेल छलनी के माध्यम से समुद्री जल को फ़िल्टर करें।
- प्लास्टिक पेट्री डिश में 20-40 बीजाणुओं / एमएल एकाग्रता के लिए छानना में बीजाणुओं को पतला करें22.
- इष्टतम संस्कृति स्थितियों (13 डिग्री सेल्सियस, 24 μE.m-2.s-1, फोटोपीरियड 16: 8 एल: डी) के साथ कॉन्फ़िगर किए गए एक संस्कृति कैबिनेट (सामग्री की तालिका देखें) में बीजाणु समाधान रखें।
- बीजाणुओं को अंकुरित होने दें और गैमेटोफाइट्स में विकसित करें।
नोट: बीजाणु अंकुरण कैबिनेट में 2 दिनों के बाद दिखाई देता है, और गैमेटोफाइटिक कोशिकाओं का पहला कोशिका विभाजन आमतौर पर निम्नलिखित 48 घंटे के भीतर होता है। - 0.5x प्रोवासोली समाधान (एनएसडब्ल्यू 1/2) के साथ समृद्ध सूक्ष्म फ़िल्टर्ड प्राकृतिक समुद्री जल के साथ 5 दिनों के बाद विकास माध्यम को बदलें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: इन चरणों को दोहराने से बचने के लिए, विशिष्ट पुरुष और महिला गैमेटोफाइट्स का चयन किया जा सकता है और कई महीनों तक वनस्पति रूप से प्रचारित किया जा सकता है। ऊपर वर्णित एक ही संस्कृति स्थितियों में लाल बत्ती (कम से कम 580 एनएम की तरंग दैर्ध्य के साथ 4 μE.m-2.s-1) 23 के तहत उगाए जाने पर गैमेटोफाइट्स वनस्पति रहते हैं (चरण 1.7)।
2. ओजेनेसिस का विखंडन और प्रेरण
- एक सेल खुरचनी के साथ हार्वेस्ट गैमेटोफाइट्स।
- एक छोटे प्लास्टिक मूसल का उपयोग करके, एकत्र किए गए गैमेटोफाइट्स को 1.5 एमएल ट्यूब में 4-5-सेल वाले टुकड़ों में कुचल दें।
- 1 एमएल एनएसडब्ल्यू 1/2 (चरण 1.9) के साथ ट्यूब भरें।
- कुचल गैमेटोफाइट समाधान के 2.5 μL 1x प्रोवासोली समाधान (एनएसडब्ल्यू) के साथ समृद्ध प्राकृतिक समुद्री जल के 3 मिलीलीटर में जोड़ें और उन्हें पेट्री डिश में रखें।
नोट: आसान हैंडलिंग के लिए 25 मिमी, ग्लास-बॉटम पेट्री डिश की सिफारिश की जाती है। - एक संस्कृति कैबिनेट में तैयार व्यंजनों को रखें और 24 μE.m-2.s-1 (मंद प्रकाश, फोटोपीरियड 16: 8 एल: डी) की तीव्रता के साथ सफेद प्रकाश के तहत 13 डिग्री सेल्सियस पर युग्मकजनन को प्रेरित करें।
नोट: पहला गैमेटैंगिया (मादा ओगोनिया और नर आर्केगोनिया) 5 दिनों के बाद देखा जा सकता है। नर छोटी कोशिकाओं के साथ हाइपर-ब्रांच्ड होता है, और मादा बड़ी कोशिकाओं से बना होता है जो लंबे फिलामेंट्स15,22 बनाते हैं। पहले अंडे ~ 10 दिनों के बाद देखे जाते हैं, और युग्मनज का पहला विभाजन आमतौर पर अगले 2 दिनों के भीतर होता है। - पहले अंडे को देखने के छह दिन बाद, व्यंजनों को उज्ज्वल सफेद प्रकाश स्थितियों में स्थानांतरित करें: 50 μE.m-2.s-1, फोटोपीरियड 16: 8 एल: डी, अभी भी 13 डिग्री सेल्सियस पर।
3. पृथक्करण के लिए भ्रूण का चयन करने और बाद के विकास की निगरानी के लिए छवि अधिग्रहण
- पूरे पेट्री डिश को (पुनः) पृथक्करण चरण के दौरान चयनित भ्रूण का पता लगाने के लिए छवि (ओकुलर माइक्रोस्कोप में पकवान वापस करने की कोई आवश्यकता नहीं है) और चयनित भ्रूण के बाद के विकास की निगरानी करें।
नोट: इमेजिंग (चित्रा 1) के लिए एक उल्टे लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें, और लेजर पृथक्करण चरण 5 में वर्णित है। - पेट्री डिश को मंच पर रखें और इसे एक दृश्य चिह्न के साथ उन्मुख करें (उदाहरण के लिए, एक स्थायी मार्कर के साथ एक रेखा खींचें)।
- भ्रूण पर ध्यान केंद्रित करने के लिए 10x / 0.45 उद्देश्य का उपयोग करें। पेट्री डिश के चार कार्डिनल बिंदुओं की स्थिति रिकॉर्ड करें।
- टाइल स्कैन शुरू करें। फ्लोरोसेंट छवियों को कम रिज़ॉल्यूशन पर प्राप्त करें: 256 x 256 पिक्सेल, द्विदिश स्कैनिंग के साथ 1.54 μs का पिक्सेल निवास समय, और 1.2% ट्रांसमिशन पर 561 एनएम लेजर का उपयोग करके 0.6x का डिजिटल ज़ूम।
नोट: पूरे 2.5 सेमी पेट्री डिश के लिए स्कैन समय 225 टाइल्स (चित्रा 2) के लिए ~ 6 मिनट है। यहां, ट्रांसमिशन और प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए 561 एनएम लेजर का उपयोग किया गया था। प्रतिदीप्ति संकेत को कॉन्फोकल फोटोमल्टीप्लायर (पीएमटी) पर 580-720 एनएम के बीच एकत्र किया गया था और प्रेषित प्रकाश को प्रेषित पीएमटी पर एकत्र किया गया था। 561 एनएम लेजर इस चरण में क्लोरोफिल की निगरानी भी कर सकता है, लेकिन यह अनावश्यक है क्योंकि यह केवल सिग्नल शोर और जीवों को सही ढंग से अलग करने में मदद करता है। - टाइल स्कैन छवि सहेजें और इसे छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में खुला रखें ( सामग्री की तालिका देखें) विंडो।
- उद्देश्य बदलें, पेट्री डिश को न निकालें।
नोट: 40x/1.2 पानी के उद्देश्य को मंच के किनारे ले जाया गया था ताकि विसर्जन माध्यम (पानी) को पेट्री डिश को अपनी प्रारंभिक स्थिति से स्थानांतरित किए बिना उद्देश्य में जोड़ा जा सके। - उपयुक्त भ्रूण का चयन करने के लिए पहले अधिग्रहित टाइल स्कैन छवि के माध्यम से नेविगेट करें। एक बार जब इस छवि पर भ्रूण की पहचान हो जाती है, तो चरण को भ्रूण की सटीक स्थिति में ले जाएं और उच्च रिज़ॉल्यूशन पर उस भ्रूण की प्रेषित /
नोट: उच्च-रिज़ॉल्यूशन सेटिंग्स: 512 x 512 पिक्सेल, 0.130 μm/पिक्सेल, 0.208 μs पिक्सेल मोनो-दिशात्मक स्कैनिंग और 0.9% ट्रांसमिशन पर 561 एनएम लेजर का उपयोग करके 2x डिजिटल ज़ूम के साथ समय रहते हैं। - लेजर पृथक्करण (चित्रा 2 बी) के लिए प्रत्येक भ्रूण उम्मीदवार के लिए टाइल स्कैन छवि एनोटेट और लेजर पृथक्करण चरण के लिए आगे बढ़ें।
4. लेजर अंशांकन
- लेजर को कैलिब्रेट करें और "क्लिक एंड फायर मोड" और स्पंदित 355 एनएम लेजर में लेजर-ड्राइवर सॉफ़्टवेयर के साथ छवि अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर को सिंक्रनाइज़ करें।
नोट: अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर की लाइव छवि में स्थिति के साथ लेजर-ड्राइवर सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें) में माउस कर्सर की स्थिति के बीच सही सिंक्रनाइज़ेशन सुनिश्चित करने के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है। - लेजर-ड्राइवर सॉफ़्टवेयर पैकेज खोलें और छवि अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर पैकेज में लाइव पर क्लिक करें।
- लेजर-ड्राइवर सॉफ़्टवेयर पैकेज में अधिग्रहण प्रारंभ करें पर क्लिक करके दोनों सॉफ़्टवेयर पैकेज सिंक्रनाइज़ करें। लाइव इमेज अब यूवी लेजर-ड्राइवर सॉफ्टवेयर में भी दर्ज की गई है।
- चुनें एओआई बटन पर क्लिक करके और यूवी लेजर-ड्राइवर सॉफ़्टवेयर पैकेज में छवि के किनारों (दाएं, बाएं, ऊपर और नीचे) पर क्लिक करके ब्याज के क्षेत्र ( एओआई ) को परिभाषित करें।
नोट:: इस अंशांकन चरण के बाद, पिक्सेल आकार, छवि स्वरूप, और अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर पैकेज में ज़ूम के लिए सेटिंग्स स्थिर रहना चाहिए। - पकवान पर एक खाली क्षेत्र का चयन करें और कांच के तल पर ध्यान केंद्रित करने के लिए नमूना फोकल विमान के नीचे 20 μm करने के लिए मंच के स्तर को कम करें।
- प्रारंभ अंशांकन पर क्लिक करके पृथक्करण लेजर और इमेजिंग लेजर प्रक्षेपवक्र सेट करें और मैनुअल अंशांकन चुनें।
- ग्लास कवरस्लिप में छेद के अनुरूप लाइव छवि के केंद्र में एक काला डॉट देखने के लिए पर्याप्त लेजर पावर का चयन करें (सभी शटर खुले होने चाहिए)।
- माउस कर्सर के साथ इस केंद्रीय काले डॉट पर क्लिक करें और संरेखण प्रक्रिया को पूरा करने के लिए सॉफ्टवेयर द्वारा प्रस्तावित 18 अतिरिक्त डॉट्स पर क्लिक करें।
- एक ही कवरस्लिप पर "क्लिक एंड फायर मोड" में अंशांकन की जांच करें।
नोट: लेजर अंशांकन इमेजिंग मापदंडों पर निर्भर करता है। एक बार लेजर कैलिब्रेट हो जाने के बाद, सुनिश्चित करें कि इमेजिंग पैरामीटर (यानी, 512 x 512 पिक्सेल, 0.130 μm / पिक्सेल, 0.208 μs पिक्सेल मोनो-दिशात्मक स्कैनिंग और 2x डिजिटल ज़ूम के साथ निवास समय) नहीं बदले हैं।
5. लेजर पृथक्करण
- ब्याज के एक भ्रूण का चयन करें। छवि-अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर में एक समय-चूक रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें।
- उच्च रिज़ॉल्यूशन (यानी, 512 x 512 पिक्सेल, 0.130 μm / पिक्सेल, 1.54 μs पिक्सेल मोनो-दिशात्मक स्कैनिंग और 0.9% ट्रांसमिशन पर 561 एनएम लेजर का उपयोग करके 2x डिजिटल ज़ूम) पर 40x / 1.2 डब्ल्यू उद्देश्य के साथ प्रेषित / प्रतिदीप्ति छवियों को प्राप्त करें। अधिकतम गति पर समय चूक रिकॉर्डिंग प्राप्त करें।
- समय चूक रिकॉर्डिंग की शुरुआत में क्षेत्र से ज़ूम आउट करें। एओआई पर ज़ूम इन करें।
- भ्रूण में ब्याज की कोशिका पर हानिकारक विकिरण को लागू करने के लिए लेजर-ड्राइवर सॉफ़्टवेयर के "क्लिक एंड फायर" फ़ंक्शन का उपयोग करें। निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: 45% लेजर ट्रांसमिशन (अधिकतम 40 μW के अनुरूप) और 1 एमएस पल्स समय अवधि (चरण 4)।
नोट: लेजर शूटिंग के दौरान वीडियो रिकॉर्डिंग की सिफारिश की है। - 688 एनएम के तहत, साइटोप्लाज्म से ऑटोफ्लोरोसेंट क्लोरोप्लास्ट के निष्कासन की निगरानी करें।
- यदि सेल सामग्री सेल में रहती है, तो सेल में उल्लंघन के आकार को बढ़ाने के लिए एक बार फिर "क्लिक एंड फायर" फ़ंक्शन का उपयोग करें। दोहराएं, शॉट्स की संख्या को कम से कम रखें जब तक कि अधिकांश सेल सामग्री जारी नहीं की जाती है।
- भ्रूण स्थिर होने के बाद समय-चूक रिकॉर्डिंग बंद करो (यानी, कोई और इंट्रासेल्युलर आंदोलन का पता नहीं लगाया जा सकता है (~ 1-5 मिनट)।
- यदि आवश्यक हो, तो टाइल स्कैन छवि पर एनोटेशन अपडेट करें।
6. विकिरणित भ्रूण के विकास की निगरानी
नोट: निगरानी कई दिनों में की जाती है।
- लेजर पृथक्करण के बाद विकसित होने वाले भ्रूणों की संख्या की निगरानी करके जीवित रहने की दर निर्धारित करें और उनकी तुलना मरने वालों से करें।
नोट: कुछ भ्रूण विभिन्न कारणों से पृथक्करण के तुरंत बाद मर जाते हैं। एक उच्च और तेजी से मृत्यु दर आमतौर पर अनुचित लेजर मापदंडों या प्रयोग या बाद के परिवहन के दौरान तनाव के लिए उच्च / - हर दिन लेजर शॉट भ्रूण की लंबाई को मापने और बरकरार भ्रूण की तुलना करके विकास में देरी का निर्धारण करें।
नोट: लेजर-शॉट जीवों की वृद्धि दर आमतौर पर अनुपचारित जीवों की तुलना में धीमी होती है। हालांकि, कुछ (अनुचित) लेजर सेटिंग्स एक सप्ताह से अधिक समय तक विकास को रोक सकती हैं, उसके बाद विकास फिर से शुरू हो सकता है। - एब्लेटेड कोशिकाओं से सटे कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की निगरानी करके आसन्न क्षति का पता लगाएं। कुछ मामलों में, पोस्ट-बर्स्ट डिप्रेसराइजेशन पड़ोसी कोशिकाओं को फटने का कारण बन सकता है।
- सूक्ष्मजीव संदूषण के लिए जाँच करें। माध्यम में सूक्ष्मशैवाल और बैक्टीरिया के विकास की निगरानी करें। यदि डिश में रोगाणुओं का एक असामान्य स्तर मौजूद है, तो इसे त्याग दें और चरण 2 या चरण 3 से प्रोटोकॉल दोहराएं।
नोट: लेजर पृथक्करण के बाद, क्षतिग्रस्त एस लैटिसिमा भ्रूण पहले से ही अत्यधिक तनावग्रस्त हैं, और अतिरिक्त बाहरी तनाव मृत्यु दर में वृद्धि का कारण बन सकता है। बैक्टीरियल या वायरल प्रकोप संभव हैं क्योंकि इलाज किए गए भ्रूण एक्सेनिक स्थितियों में नहीं बढ़ सकते हैं। - फेनोटाइप का अध्ययन करके और लक्षित क्षेत्र के विकास में भूमिका को समझकर शॉट जीवों के वैश्विक विकास की जांच करें।
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Representative Results
लैटिसिमा के गैमेटोफाइट्स उगाए गए थे, और युग्मकजनन को युग्मनज और भ्रूण का उत्पादन करने के लिए प्रेरित किया गया था। गैमेटोजेनेसिस के प्रेरण के बारह दिन बाद, भ्रूण लेजर पृथक्करण से गुजरे। यहां, प्रयोग का उद्देश्य एस लैटिसिमा भ्रूण के समग्र विकास में विशिष्ट कोशिकाओं की भूमिका का आकलन करना था। सबसे एपिकल सेल, सबसे बेसल सेल और औसत कोशिकाओं को लक्षित किया गया था। टाइल स्कैनिंग के बाद, पूरे पेट्री डिश (चित्रा 2 ए), ब्याज का एक भ्रूण, लेजर शूटिंग (चित्रा 2 बी) के लिए एक उपयुक्त उम्मीदवार के रूप में पहचाना गया था। इस भ्रूण की एक विशिष्ट कोशिका को 1 एमएस (मूवी 1) के लिए अधिकतम 40 μW लेजर पावर (यहां उपयोग किए जाने वाले उपकरणों के लिए अधिकतम शक्ति के 45% के अनुरूप) के साथ स्पंदित यूवी लेजर बीम के साथ चुना, लक्षित और शूट किया गया था। कोशिका ने अपनी सामग्री (क्लोरोप्लास्ट और साइटोप्लाज्म) जारी की। दिलचस्प बात यह है कि आसन्न कोशिकाओं ने अंतरकोशिकीय अंतरिक्ष में विस्तार करके विकिरणित कोशिका के फटने का जवाब दिया। विकिरणित भ्रूण की स्थिति 10 दिनों (चित्रा 3) से अधिक बाद की निगरानी के लिए दर्ज की गई थी। अधिकांश विकिरणित भ्रूण विकसित होते रहे लेकिन विकास परिवर्तन (भ्रूण का आकार) दिखाया। समग्र विकास तंत्र को नियंत्रित करने में प्रत्येक विकिरणित कोशिका के लिए एक विशिष्ट कार्य को जिम्मेदार ठहराए जाने से पहले रूपात्मक परिवर्तनों का एक विस्तृत विश्लेषण करने की आवश्यकता है।
इसके विपरीत, भ्रूण अन्य लेजर मापदंडों के साथ परीक्षण किया (उदाहरण के लिए, 60% -80% लेजर शक्ति की शूटिंग अवधि के लिए 33 एमएस; मूवी 2) ने जल्दी से गंभीर तनाव के संकेत दिखाए जैसे कि सेल विरंजन, लुप्त होती, या आकार परिवर्तन (गोलाई)। प्रयोग (चित्रा 4) के बाद पांच दिनों के भीतर इस तरह से गोली मार दी लगभग सभी भ्रूण की मृत्यु हो गई।
चित्र 1: लेजर पृथक्करण सूक्ष्मदर्शी सेट-अप की तस्वीर। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: एक पूरे पेट्री डिश का एनोटेट टाइल स्कैन( ए) लेजर पृथक्करण के लिए उपयोग किए जाने वाले पूरे पेट्री डिश का टाइल स्कैन। ट्रांसमिशन पीएमटी का उपयोग ब्राइटफील्ड स्कैन प्राप्त करने के लिए किया गया था। एक बार ब्याज का भ्रूण स्थित हो जाने के बाद, उपयोगकर्ता टाइल स्कैन में भ्रूण की स्थिति पर क्लिक करता है, और सॉफ्टवेयर सीधे भ्रूण पर चरण की स्थिति रखता है। (बी) टाइल स्कैन को भ्रूण को ट्रैक करने और निगरानी करने के लिए, बाद के चरणों में भ्रूण का पता लगाने के लिए विशेष रूप से एनोटेट किया जा सकता है। यहां, छवि पेट्री डिश के नीचे से जुड़े एक भ्रूण को दिखाती है, जिसे 561 एनएम लेजर का उपयोग करके आसानी से स्थित किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: विकिरण के बाद बढ़ते एस लैटिसिमा भ्रूण की समय श्रृंखला। यह फिल्म 1 में दिखाया गया है। भ्रूण के सबसे एपिकल सेल के लेजर पृथक्करण ने भ्रूण की आसन्न कोशिकाओं को ब्लीच नहीं किया। वे बढ़ते और विभाजित होते रहे, कुछ दिनों के बाद एक सामान्य भ्रूण बनाते रहे। छवियों को हर 24 घंटे में लिया गया था, पृथक्करण के 2-9 दिन बाद। स्केल बार 50 μm है और सभी तस्वीरों के लिए समान है। डी 2-डी 9 दिन -2 से दिन -9 से मेल खाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: सबऑप्टिमल मापदंडों का उपयोग करके लेजर पृथक्करण के बाद एस लैटिसिमा भ्रूण मृत्यु की समय श्रृंखला। लेजर विकिरण के लिए ओवरएक्सपोजर आसानी से लक्ष्य भ्रूण और पड़ोसी लोगों की उच्च मृत्यु दर का कारण बन सकता है। मूवी 2 में गोली मार दी भ्रूण की एक समय श्रृंखला दिखाया गया है, प्रत्येक तस्वीर के ऊपर संकेत पृथक्करण के बाद के समय के साथ (पृथक्करण के 3-6 दिन बाद)। स्केल बार 30 μm है और प्रत्येक तस्वीर पर लागू होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
फिल्म 1: एस लैटिसिमा के 8-कोशिका वाले भ्रूण के सबसे एपिकल सेल का लेजर पृथक्करण। फोकस को पहले सैकरीना स्पोरोफाइट्स (विभिन्न क्षेत्रों में, पहले चौड़ा, फिर संकीर्ण) के गुलदस्ते के बीच चुने गए भ्रूण पर समायोजित किया गया था। भ्रूण के सबसे एपिकल सेल को तब 1 एमएस के लिए 45% लेजर पावर का उपयोग करके गोली मार दी गई थी। एपिकल सेल तेजी से फट गया और इसकी सामग्री जारी की। आसन्न कोशिकाओं, फट सेल के टर्गर से मुक्त, खाली जगह भर दिया। 5 मिनट के बाद, सेल और इसकी सामग्री ने आगे बढ़ना बंद कर दिया है और संतुलन की स्थिति में पहुंच गए हैं। फिल्म को 4 बार त्वरित किया गया है (1 छवि प्रति 632 एमएस से 6 एफपीएस तक)। भ्रूण के विकास का अनुवर्ती चित्रा 3 में दिखाया गया है। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
मूवी 2: सबऑप्टिमल लेजर सेटिंग्स के कारण फट सेल से सटे कोशिकाओं का महत्वपूर्ण विरंजन। 1 एमएस के लिए 60% -80% की लेजर शक्ति या 10 एमएस के लिए 45% की लेजर शक्ति का उपयोग करने से आसन्न कोशिकाओं का महत्वपूर्ण विरंजन और बहुत कम जीवित रहने की दर हुई। लेजर के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स को आसन्न कोशिकाओं को विरंजन या आंशिक क्षति का कारण नहीं बनना चाहिए। लेजर पल्स की शक्ति और / या अवधि को कम करके और आसन्न कोशिकाओं से दूर बिंदु को लक्षित करके सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त किए गए थे। यहां, एस लैटिसिमा के 4-सेल वाले भ्रूण की सबसे एपिकल सेलको गोली मार दी जाती है (80% लेजर पावर, 1 एमएस) (पार्श्व / निचले और पार्श्व कोशिकाओं का ओवरब्लीचिंग आसानी से अवलोकन योग्य है। भ्रूण के बाद के विकास चित्रा 4 में दिखाया गया है। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्रा 1: पूरे प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध फ्लोचार्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
स्थानीय सेलुलर लेजर पृथक्करण परिशुद्धता के एक उच्च स्तर के साथ अस्थायी और स्थानिक पृथक्करण के लिए अनुमति देता है। हालांकि, इसकी दक्षता लक्ष्य कोशिकाओं की गैर-पहुंच से बाधित हो सकती है; उदाहरण के लिए, सभी कोशिकाएं त्रि-आयामी भ्रूण की हैं। यह प्रोटोकॉल शैवाल सैचरीना लैटिसिमा के भ्रूण पर विकसित किया गया था, जो एक मोनोलेयर्ड लैमिना विकसित करता है जिसमें सभी कोशिकाओं को लेजर बीम के साथ व्यक्तिगत रूप से आसानी से प्रतिष्ठित और नष्ट किया जा सकता है।
लेजर शक्ति और तरंग दैर्ध्य
एनआईआर एफएस-स्पंदित लेजर का उपयोग आमतौर पर जानवरों पर विकासात्मक अध्ययन में किया जाता है24,25. हालांकि, भूरे शैवाल जैसे कि सैकरीना के मामले में, लेजर पूरे भ्रूण को जलाए बिना कोशिका को फट नहीं सकता था। यह प्रतिक्रिया क्लोरोप्लास्ट प्रकाश हार्वेस्टर की उच्च गतिविधि से संबंधित हो सकती है।
पृथक्करण के लिए एनएस-स्पंदित यूवी लेजर का उपयोग करते हुए, दो दृष्टिकोणों का परीक्षण किया गया था: (1) थोड़े समय में उच्च शक्ति नाड़ी का उपयोग करना या (2) लंबे समय तक कम लेजर एक्सपोजर का उपयोग करना। लेजर द्वारा वितरित ऊर्जा, लेजर शक्ति और नाड़ी अवधि का एक संयोजन, विकिरणित सेल को दी गई ऊर्जा को प्रभावित करता है। वितरित ऊर्जा प्रतिबिंब और विवर्तन द्वारा आसपास की कोशिकाओं को भी प्रभावित कर सकती है। इसलिए, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम देने वाले दो मापदंडों की सबसे कम सेटिंग्स को किसी भी अवांछित संपार्श्विक प्रभाव को कम करने के लिए चुना गया था। 1 एमएस की नाड़ी के साथ 25-40 μ W.cm -2 के बीच लेजर शक्ति इष्टतम प्रतीत होती है। इन मापदंडों का उपयोग करते हुए, यूवी लेजर का प्रभाव आसपास की कोशिकाओं में कोई दृश्य विरंजन के साथ एक बहुत ही स्थानीय स्तर पर निहित था, लेकिन लक्ष्य सेल को फटने का कारण बनने के लिए पर्याप्त कुशल था। इन मापदंडों को भ्रूण पर किसी भी प्रत्यक्ष घातक प्रभाव के बिना बार-बार लागू किया गया था। लंबे समय तक नाड़ी समय या उच्च लेजर शक्ति ने आसपास की कोशिकाओं के विरंजन या यहां तक कि भ्रूण की मृत्यु का कारण बना, जबकि कोशिका की दीवार को तोड़ने के लिए कम मूल्य अपर्याप्त थे।
शैवाल सामग्री और संस्कृति की स्थिति
यद्यपि उपकोशिकीय स्तर पर सटीक शूटिंग की अनुमति देते हुए, इस तकनीक के लिए प्रयोगकर्ता को परिणामों की विश्वसनीय व्याख्या की अनुमति देने के लिए चार महत्वपूर्ण कारकों को संबोधित करने की आवश्यकता होती है। इन बिंदुओं को लेजर पृथक्करण प्रयोग से पहले और बाद में दोनों पर विचार किया जाना चाहिए।
संबोधित करने वाला पहला कारक भ्रूण जनसंख्या घनत्व है। नकारात्मक भीड़ एस लैटिसिमा26 की विकास दर को प्रभावित करती है। कम घनत्व (1) बेहतर नाड़ी पुनरावृत्ति प्रदान करते हैं क्योंकि लेजर पथ में अन्य भ्रूणों की उपस्थिति इसकी शक्ति को कम कर सकती है, और (2) लेजर द्वारा शूट किए गए भ्रूण की आसान निगरानी, जो बरकरार भ्रूण की तुलना में थोड़ी धीमी गति से बढ़ती है; उत्तरार्द्ध जल्दी से शॉट भ्रूण को कवर करता है। इस प्रोटोकॉल का दूसरा महत्वपूर्ण कारक तापमान है जिस पर प्रयोग किया जाता है। लेजर बीम स्वयं नमूने को गर्म करता है, लेकिन कमरे का तापमान और माइक्रोस्कोप का स्थानीय वातावरण नमूने द्वारा अनुभव की गई समग्र तापमान स्थितियों में जोड़ता है, 18-22 डिग्री सेल्सियस के करीब। यहां, माइक्रोस्कोप के कमरे को प्रशीतित नहीं किया गया था क्योंकि इस उपकरण का उपयोग मुख्य रूप से पशु कोशिकाओं के लिए किया जाता है जो परिवेश के तापमान को सहन करते हैं। सौभाग्य से, सैकरीना भ्रूण 4 घंटे तक 22 डिग्री सेल्सियस (13 डिग्री सेल्सियस के इष्टतम संस्कृति तापमान से 9 डिग्री सेल्सियस अधिक) के तापमान का सामना करने में सक्षम थे। हालांकि, कम परिवेश के तापमान को बनाए रखने में मदद करने के लिए उपकरण, जैसे कि पर्याप्त वेंटिलेशन या शीतलन प्लेट धारक, शैवाल भ्रूण के अस्तित्व और विकास पर प्रतिकूल प्रभाव के जोखिम को कम करने में मदद कर सकते हैं। इसके अलावा, लाल बत्ती के तहत 16 डिग्री सेल्सियस तक गैमेटोफाइट्स की धीमी गति से पूर्व-अभिवृद्धि भ्रूण को पृथक्करण प्रक्रिया के दौरान तापमान स्पाइक्स का सामना करने में मदद कर सकती है। तीसरा, तापमान में वृद्धि के अलावा, भ्रूण प्रयोग की अवधि के लिए एक उपयुक्त प्रकाश स्रोत से वंचित हैं। इसके अलावा, क्लोरोप्लास्ट को 561 एनएम लेजर द्वारा आंशिक रूप से प्रक्षालित किया जा सकता है। 561 एनएम लेजर पर सबसे कम संभव शक्ति का उपयोग करने से इस प्रभाव को कम करने में मदद मिलती है। चौथा, परिवहन भी ध्यान में रखने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है क्योंकि लेजर पृथक्करण उपकरण सभी प्रयोगशालाओं में उपलब्ध नहीं है। अल्गल सामग्री के विघटन, हानि या मृत्यु को रोकने के लिए तापमान स्पाइक्स और बाहरी आंदोलनों या झटके से बचा जाना चाहिए। जब भी संभव हो, परिवहन बक्से को प्रशीतित, कंपन प्रतिरोधी (जैसे, सदमे-अवशोषित फोम), और रोशनी से लैस करने की आवश्यकता होती है। इन आवश्यकताओं को पूरा करने वाले कई परिवहन बक्से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।
यहां तक कि अगर इन सभी कारकों को यथासंभव नियंत्रित किया जाता है, तो कमजोर लेकिन संभावित रूप से महत्वपूर्ण पर्यावरणीय तनाव अभी भी हो सकता है। लेजर पृथक्करण के लिए भ्रूण प्रतिक्रिया का विश्लेषण और व्याख्या करने में इस संभावना पर विचार किया जाना चाहिए।
पर्यावरणीय परिस्थितियों के अलावा जिन्हें पूरे प्रयोग में स्थिर रखा जाना चाहिए, निगरानी चरण के दौरान विकिरणित जीवों का ट्रैक रखना भी एक चुनौती है। विभिन्न भ्रूणों की वृद्धि समय के साथ मूल परिदृश्य को बदल देती है। जब तक एक स्वचालित माइक्रोस्कोप प्रयोग की निगरानी के लिए समर्पित नहीं किया जा सकता है, लेजर पृथक्करण के बाद भ्रूण का पालन आसानी से समय लेने वाला हो सकता है और बड़ी मात्रा में डेटा उत्पन्न कर सकता है। प्रारंभिक लेजर पृथक्करण नाड़ी के दौरान वीडियो रिकॉर्डिंग अत्यधिक नाड़ी के लिए भ्रूण की तत्काल प्रतिक्रिया को ट्रैक करने की सिफारिश कर रहे हैं। नाड़ी प्रभाव की यह तेजी से निगरानी महत्वपूर्ण महत्व की है क्योंकि कुछ उदाहरणों में, नाड़ी, जब कोशिका के बीच में लक्षित होती है, तो लक्ष्य कोशिका तेजी से फट जाती है, सबसे अधिक संभावना कोशिका के इंटीरियर और मध्यम (समुद्री जल) के बीच परासरणता के अंतर के कारण होती है। जब रिसाव बहुत तेज था, तो पड़ोसी कोशिकाएं भी फट गईं। लक्षित सेल के सबसे दूरस्थ क्षेत्र में शूटिंग किसी भी आसन्न कोशिकाओं पर फट प्रभाव को बफर करने का एक कुशल तरीका साबित हुआ। हिंसक फटने से बचने का एक और कुशल तरीका सुक्रोज27 के साथ माध्यम की परासरणता को बढ़ाना है। हालांकि, लक्षित सेल की सामग्री को खत्म करने के लिए परासरण में अंतर आवश्यक है। इस प्रकार, पर्याप्त परासरण क्षमता बनाए रखने की आवश्यकता है। कुछ मामलों में, क्लोरोप्लास्ट और अन्य यौगिकों ने लेजर पृथक्करण द्वारा किए गए उद्घाटन को बाधित कर दिया, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाएं लेजर शॉट से ठीक हो गईं, कुछ दिनों के बाद विकास फिर से शुरू हो गया। उद्घाटन को खोलने पर निर्देशित अतिरिक्त दालें रुकावट को रोकने के लिए पर्याप्त साबित हुईं।
सीमाओं
लेजर पावर के बीच एक ट्रेड-ऑफ मारा जाना चाहिए, जो कोशिकाओं को अपनी सामग्री को खाली करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए, और पड़ोसी कोशिकाओं का अस्तित्व, जो शैवाल भ्रूण में गर्मी तनाव और फोटोब्लीचिंग के प्रति विशेष रूप से संवेदनशील हैं। इसलिए, लेजर शॉट के बाद कोशिकाओं की करीबी निगरानी इस कदम को नियंत्रित करने और यह सुनिश्चित करने की कुंजी है कि लक्ष्य कोशिकाएं मृत हैं। अन्यथा, पड़ोसी कोशिकाओं के भाग्य पर लक्षित कोशिकाओं की व्याख्या, और इस प्रकार भ्रूण के बाद के विकास, भ्रामक हो सकते हैं।
सुई के साथ पंचरिंग कोशिकाएं एक विकल्प प्रतीत हो सकती हैं जिसमें शैवाल कोशिकाओं को किसी भी गर्मी या हल्के तनाव का अनुभव नहीं होगा। हालांकि, यह दृष्टिकोण चुनौतीपूर्ण होगा क्योंकि भूरे रंग की शैवाल भ्रूण कोशिकाएं समुद्री जल में डूबी हुई हैं और किसी भी ठोस सतह के साथ कोई संपर्क नहीं है। मोटी और लोचदार कोशिका भित्ति एक मानक माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम में माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके एक ठोस, कांच की सतह के संपर्क में भ्रूण को बनाए रखने पर भी सुई प्रवेश का विरोध करती है।
संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल लेजर पृथक्करण और भूरे शैवाल भ्रूण की निगरानी और एक सफल प्रयोग (पूरक चित्रा 1) के लिए महत्वपूर्ण कदम के लिए पूर्ण प्रयोगात्मक प्रक्रिया और सेटिंग्स का वर्णन करता है। यह अनूठा दृष्टिकोण भूरे शैवाल के शुरुआती भ्रूण में सेल इंटरैक्शन और सेल भाग्य का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक तरीका है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
एसबी के पीएचडी अनुदान को क्षेत्र ब्रेटाग्ने (एआरईडी अनुदान संख्या सीओएच 20020) और सोरबोन यूनिवर्सिटी द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। I.T.is पीएचडी अनुदान क्षेत्र ब्रेटाग्ने (एआरईडी अनुदान संख्या सीओएच 18020) और नॉर्वेजियन एनएमबीयू विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित है। इस परियोजना को एमआईटीआई अंतःविषय कार्यक्रमों के माध्यम से सीएनआरएस से वित्तीय सहायता मिली है। एमआरआईसी फ्रेंच नेशनल रिसर्च एजेंसी (एएनआर -10-आईएनबीएस -04) द्वारा समर्थित राष्ट्रीय बुनियादी ढांचे फ्रांस-बायोइमेजिंग का सदस्य है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | - | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | - | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
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