Summary
胚中の特定の細胞の破壊は、細胞の運命に関与する細胞相互作用を研究するための強力なツールである。本プロトコールは、褐色藻類サッカリーナ・ラティッシマの初期胚における標的細胞のレーザーアブレーションのための技術を記載する。
Abstract
サッカリーナ・ラティッシマでは、胚は薄層または刃と呼ばれる単層細胞シートとして発達する。各胚細胞は観察が容易であり、その隣人と容易に区別でき、そして個別に標的化することができる。何十年もの間、レーザーアブレーションは胚発生を研究するために使用されてきました。ここでは、褐色藻類S. latissimaの初期胚について、細胞特異的レーザーアブレーションのプロトコルが開発された。提示された研究には、(1)サッカリナ胚の調製、培養条件を含む重要なパラメータの説明、(2)レーザーアブレーション設定、および(3)タイムラプス顕微鏡を用いた照射胚のその後の成長のモニタリングが含まれる。さらに、イメージングプラットフォームからラボに胚を輸送するための最適な条件に関する詳細が提供されており、その後の胚発生に深く影響する可能性があります。ラミナリア目に属する藻類は、サッカリナに似た胚発生パターンを示すため、このプロトコルはこの分類群の他の種に容易に転移することができる。
Introduction
レーザーアブレーションは、胚発生を研究するために何十年もの間使用されてきました。胚細胞にレーザー光を照射すると、胚発生中の再生能と細胞系譜の改変を監視し、標的アブレーションが細胞分裂と細胞運命に及ぼす影響を調べることができます。レーザーアブレーション法で使用されるモデル生物は、典型的には動物であり、例えば昆虫1,2、線虫3,4、脊椎動物5,6、および時には植物7,8である。さらに、1994年と1998年に褐色藻類のヒバコにレーザーマイクロアブレーションアプローチを使用して、初期胚の光偏光における細胞壁の役割を実証した9,10。
褐藻類は、16億年前に真核生物の木の根元で発散したグループStramenopilesに属します。その結果、それらは、動植物11などの他の多細胞生物から系統学的に独立している。Saccharina latissimaは、より一般的に昆布として知られているLaminarialesに属し、彼らは30メートル以上のサイズに達する、地球上で最大の生物の一つですサッカリナ属は、食品や飼料などの多くの用途に使用される大きな海藻であり、その多糖類は、世界中の農業、薬理学、化粧品産業で使用するために抽出されています12、13。その栽培は、主にアジアで、そして最近ではヨーロッパで、外洋に幼体を放出する前に孵化場で胚を準備する必要があります。すべての昆布と同様に、それは、一倍体配偶子が成長し、受精のために配偶子を生成する微視的な配偶子植物期と、海底または岩石に取り付けられたホールドファストから大きな平面ブレードが発達する二倍体の巨視的胞子植物期からなる二相性ライフサイクルを有する。この胞子植物は成熟時に一倍体胞子を放出し、それによってライフサイクル14、15、16を完了させる。
S. latissimaはいくつかの 興味深い形態学的特徴を提示する17。その胚は、異なる組織型の出現と一致する多層構造を獲得する前に、単層平面シート15、18、19として発達する。さらに、ラミナリア目は褐藻類の唯一の分類群の1つであり、その胚は母体の配偶子植物組織に付着したままである(デスマレスティアレスとスポロクナレスも15)。この機能は、この発生過程における母体組織の役割を研究し、褐藻類の母体制御機構を動物および植物の制御機構と比較する機会を提供する。
この記事では、初期の昆布胚におけるレーザーアブレーションのための最初の完全なプロトコルを提示します。UV nsパルス技術を含むこのプロトコルは、胚発生中のそれぞれの役割を研究するために、個々の胚細胞の特異的な破壊をもたらす。この手順は、ラミナリア目における胚発生中の細胞相互作用および細胞運命を調査するための信頼できるアプローチを提供する。
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Protocol
1. サッカリーナ・ラティッシマ・ガメトフィテスの生産
- S . latissima の成熟した胞子植物を野生から採取する(前述の20、21)。選択した胞子植物に着生植物(ブレードの表面に見える小さな生物)または内部寄生虫(漂白された領域またはブレード上の斑点に見られる)がないことを確認してください。
- メスを使用して、刃の中央の最も暗い部分(肥沃な胞子産生組織22)を1〜5個の正方形の部分(1cm²)に切断し、漂白された斑点がある場合は避ける。
- メスと吸収紙で切り取った部分を優しくきれいにして、残りの着生植物を取り除きます。
- 洗浄した小片を滅菌天然海水で満たされたガラス皿( 材料表を参照)に45分間置き、以前に発表された報告書22に従って胞子を放出する。
- ブレード片を取り外し、40μmのセルストレーナーで海水をろ過して、破片や不要な生物を除去します。
- 濾液中の胞子をプラスチック製のシャーレ22中で20〜40胞子/mL濃度に希釈する。
- 胞子溶液を、最適な培養条件(13°C、24μE.m-2.s-1、明期16:8 L:D)で構成された培養キャビネット(材料表参照)に入れます。
- 胞子が発芽して配偶子植物に発達するのを許します。
注:胞子の発芽はキャビネット内で2日後に表示され、配偶子植物細胞の最初の細胞分裂は通常48時間以内に起こる。 - 5日後に増殖培地を、0.5倍プロバソリ溶液(NSW1/2)で濃縮したマイクロろ過天然海水と交換する( 材料表を参照)。
注:これらのステップを繰り返さないように、特定の男性と女性の配偶子植物を選択し、数ヶ月間栄養的に繁殖させることができます。配偶子植物は、赤色光(波長580nm以上の4μE.m-2.s-1)23の下で上記と同じ培養条件下で増殖した場合、栄養状態のままである(ステップ1.7)。
2. 卵子形成の断片化と誘導
- セルスクレーパーで配偶子を収穫する。
- 小さなプラスチック乳棒を使用して、収集した配偶子植物を1.5mLチューブで4〜5セルの断片に粉砕する。
- チューブに 1 mL NSW1/2 を充填します (ステップ 1.9)。
- 破砕した配偶子糸状菌溶液2.5 μLを、1xプロバソリ溶液(NSW)で濃縮した天然海水3 mLに加え、ペトリ皿に入れます。
メモ:取り扱いを容易にするために、25 mmのガラス底のペトリ皿をお勧めします。 - 惣菜を培養キャビネットに入れ、13°Cで24μE.m-2.s-1(薄暗い光、明期16:8 L:D)の白色光下で配偶子形成を誘導する。
注:最初のガメタンジア(女性オオゴニアと男性アルケゴニア)は5日後に観察することができます。雄は小さな細胞で超分枝しており、雌は長いフィラメントを形成する大きな細胞で構成されています15,22。最初の卵は〜10日後に観察され、接合子の最初の分割は通常2日以内に起こる。 - 最初の卵を観察してから6日後、皿を明るい白色光条件(50μE.m-2.s-1、明期16:8 L:D、まだ13°C)に移します。
3. アブレーション用の胚を選別し、その後の成長をモニタリングするための画像取得
- アブレーション工程中に選択された胚を(再)位置特定するためにシャーレ全体を画像化し(ディッシュを眼顕微鏡に戻す必要はない)、選択された胚のその後の発達を監視する。
メモ:イメージングには倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡( 材料表を参照)を使用し(図1)、レーザーアブレーションはステップ5で説明します。 - ペトリ皿をステージの上に置き、視覚的なマークで向きを変えます(例えば、永久マーカーで線を引く)。
- 10x/0.45 の目的を使用して、胚に焦点を当てます。ペトリ皿の4つの基点の位置を記録する。
- タイル スキャンを開始します。ペトリ皿全体の透過/蛍光画像を低解像度で取得します:256 x 256ピクセル、双方向スキャンで1.54 μsのピクセル滞留時間、1.2%の透過率で561 nmレーザーを使用して0.6倍のデジタルズーム。
メモ:2.5cmのペトリ皿全体のスキャン時間は、225枚のタイルで約6分です(図2)。ここでは、透過および蛍光イメージングに561nmレーザーを使用した。蛍光シグナルは共焦点光電子増倍管(PMT)で580-720nmの間で収集され、透過光は透過PMTで収集された。561nmレーザーは、この段階でクロロフィルを監視することもできますが、信号ノイズと生物を正しく区別するのに役立つだけなので、不要です。 - タイルスキャン画像を保存し、画像取得ソフトウェア( 材料表を参照)ウィンドウで開いたままにします。
- 目的を変更し、ペトリ皿を取り外さないでください。
注:40x/1.2水対物レンズはステージの側面に移動し、ペトリ皿を初期位置から動かさずに浸漬媒体(水)を対物レンズに追加できるようにしました。 - 以前に取得したタイル スキャン イメージ内を移動して、適切な胚を選択します。この画像で胚が同定されたら、ステージを胚の正確な位置に移動し、その胚の透過/蛍光画像を高解像度で取得します。
メモ:高解像度設定:512 x 512ピクセル、0.130 μm/ピクセル、0.208 μsピクセルの滞留時間(単方向スキャン付き)、および561 nmレーザーを使用した2倍デジタルズーム(透過率0.9%)。 - レーザーアブレーション用の各胚候補のタイルスキャン画像に注釈を付け(図2B)、レーザーアブレーション工程に進む。
4. レーザーキャリブレーション
- レーザーを較正し、画像取得ソフトウェアを「クリック&ファイアモード」のレーザードライバソフトウェアとパルス355nmレーザーと同期させます。
メモ:この手順は、レーザードライバソフトウェア内のマウスカーソルの位置( 材料表を参照)と集録ソフトウェアのライブイメージ内の位置とが完全に同期するようにするために重要です。 - レーザードライバソフトウェアパッケージを開き、画像集録ソフトウェアパッケージの[ Live ]をクリックします。
- レーザードライバソフトウェアパッケージの 集録開始 をクリックして、両方のソフトウェアパッケージを同期します。ライブ画像は、UVレーザードライバーソフトウェアにも記録されるようになりました。
- 関心領域(AOI)を定義するには、[ AOIの選択 ]ボタンをクリックし、UVレーザードライバソフトウェアパッケージの画像の端(右、左、上、下)をクリックします。
メモ:このキャリブレーション手順の後、集録ソフトウェアパッケージのピクセルサイズ、画像形式、ズームの設定は一定にする必要があります。 - 皿の空いている領域を選択し、ステージのレベルをサンプル焦点面の20 μm下に下げて、ガラス底に焦点を合わせます。
- アブレーションレーザーとイメージングレーザー軌道を設定するには、[キャリブ レーションの開始 ]をクリックし、[ 手動キャリブレーション]を選択します。
- ガラスカバースリップの穴に対応するライブ画像の中央に黒い点が表示されるほど高いレーザーパワーを選択します(すべてのシャッターが開いている必要があります)。
- この中央の黒い点をマウスカーソルでクリックし、ソフトウェアによって提案された 18個の追加の点 をクリックして、位置合わせ手順を完了します。
- 同じカバースリップの「クリック&ファイアモード」でキャリブレーションを確認します。
メモ:レーザーキャリブレーションは、イメージングパラメータによって異なります。レーザーを較正したら、イメージングパラメータ(512 x 512ピクセル、0.130 μm/ピクセル、単方向スキャンと2倍デジタルズームによる0.208 μsピクセルの滞留時間)が変更されていないことを確認します。
5. レーザーアブレーション
- 目的の胚を選択します。画像取得ソフトウェアでタイムラプス記録を開始します。
- 40x/1.2 Wの対物レンズで透過/蛍光画像を高解像度(512 x 512ピクセル、0.130 μm/ピクセル、1.54 μsピクセルの滞留時間、単方向スキャン、2倍デジタルズーム、561 nmレーザーを使用した2倍デジタルズーム、0.9%の透過率)で取得します。タイムラプス記録を最高速度で取得します。
- タイムラプス記録の開始時に領域からズームアウトします。AOI を拡大します。
- レーザードライバソフトウェアの「クリック&ファイア」機能を使用して、胚の関心のある細胞に損傷を与える照射を適用します。次のパラメータを使用します:45%レーザー透過率(最大40μWに対応)と1msのパルス時間持続時間(ステップ4)。
メモ:レーザー撮影中のビデオ録画をお勧めします。 - 688nm下で、細胞質からの自己蛍光葉緑体の放出を監視する。
- セルの内容がセルに残っている場合は、「クリック&ファイア」機能をもう一度使用して、セル内の違反のサイズを大きくします。繰り返して、ほとんどのセル内容物が解放されるまでショット数を最小限に抑えます。
- 胚が安定化した後(すなわち、それ以上の細胞内運動が検出されない(〜1〜5分)後にタイムラプス記録を停止する。
- 必要に応じて、タイル スキャン イメージの注釈を更新します。
6. 照射胚の成長のモニタリング
メモ: 監視は数日間にわたって実行されます。
- レーザーアブレーション後に発生する胚の数を監視して生存率を決定し、それらを死んだ胚と比較します。
注:いくつかの胚は、様々な理由でアブレーション直後に死ぬ。高くて急速な死亡率は、通常、不適切なレーザーパラメータまたは実験中またはその後の輸送中のストレスへのより高い/より長い曝露の兆候である。 - レーザーショット胚の長さを毎日測定し、それを無傷の胚と比較することによって、成長遅延を決定する。
注:レーザーショット生物の増殖速度は、一般に、未処理生物の増殖速度よりも遅い。しかし、一部の(不適切な)レーザー設定は、1週間以上成長を阻害し、その後成長が再開することがあります。 - アブレーションされた細胞に隣接する細胞の反応を監視することによって、隣接する損傷を調べる。場合によっては、バースト後の減圧によって、隣接する細胞が破裂することがあります。
- 微生物の汚染を確認します。培地中の微細藻類および細菌の増殖を監視する。異常なレベルの微生物が皿に存在する場合は、それを捨てて、ステップ2またはステップ3のプロトコルを繰り返します。
注:レーザーアブレーション後、損傷した S. latissima 胚はすでに高いストレスを受けており、追加の外部ストレスは死亡率の増加を引き起こす可能性があります。細菌またはウイルスの発生は、処理された胚が軸索条件下で増殖することができないため、可能である。 - 表現型を研究し、標的領域の発達における役割を理解することによって、ショット生物の世界的な発達をチェックする。
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Representative Results
S. latissimaの配偶子植物が増殖し、配偶子形成が誘導されて接合体および胚が産生された。配偶子形成の誘導の12日後、胚はレーザーアブレーションを受けた。ここで、実験は、S. latissima胚の全体的な発達における特定の細胞の役割を評価することを目的とした。最も頂端細胞、最も基底細胞、および中央値細胞を標的とした。タイルスキャン後、対象となる胚であるシャーレ全体(図2A)を、レーザー撮影に適した候補として同定した(図2B)。この胚の特定の細胞を選択し、標的とし、最大40μWのレーザー出力(ここで使用した機器の最大出力の45%に相当)のパルスUVレーザービームで1分間撮影しました(動画1)。細胞はその内容物を放出した(葉緑体および細胞質)。興味深いことに、隣接する細胞は、細胞間空間に拡大することによって、照射された細胞の破裂に応答した。照射された胚の位置を、10日間にわたるその後のモニタリングのために記録した(図3)。照射された胚のほとんどは発達を続けたが、成長変化(胚形状)を示した。全体的な発生メカニズムを制御する際に、照射された各細胞に特定の機能が帰される前に、形態学的変化の詳細な分析を行う必要がある。
対照的に、他のレーザーパラメータ(例えば、60%〜80%レーザーパワーの撮影持続時間について33ms; 動画 2)は、細胞の漂白、退色、形状変化(丸み)などの激しいストレスの兆候をすぐに示しました。このようにして撮影された胚のほとんどすべてが、実験後5日以内に死亡した(図4)。
図 1: レーザーアブレーション顕微鏡のセットアップの写真。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: シャーレ全体の注釈付き タイル スキャン。(A) レーザーアブレーションに使用されるペトリ皿全体のタイル スキャン。透過PMTを用いて、明視野スキャンを得た。目的の胚が見つかったら、ユーザーはタイルスキャンで胚の位置をクリックすると、ソフトウェアはステージを胚の真上に配置します。(B)タイルスキャンに特に注釈を付けて、後続のステップで胚を見つけ、胚を追跡および監視することができる。ここで、画像は、561nmレーザーを使用して容易に位置決めすることができるシャーレの底部に取り付けられた胚を示している。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:照射後に生育する S.ラティッシマ胚の 時系列。 これはムービー 1 に示されています。胚の最も頂端細胞のレーザーアブレーションは、胚の隣接細胞を漂白しなかった。彼らは成長し、分裂し続け、数日後に正常な胚を形成した。画像は、アブレーション後2〜9日、24時間ごとに撮影した。スケールバーは50μmで、すべての写真で同じです。D2-D9 は、2 日目から 9 日目に対応します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:最適でないパラメータを用いたレーザーアブレーション後の S. latissima 胚死の時系列。 レーザー照射への過剰暴露は、標的胚および隣接する胚の死亡率の上昇を容易に引き起こす可能性がある。動画2で撮影した胚の時系列を示し、アブレーション後の時間を各写真の上(アブレーション後3~6日)に示します。スケールバーは30μmで、各写真に適用されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
映画1: S. latissimaの8細胞胚の最も頂端細胞のレーザーアブレーション。 焦点は、まず 、サッカリーナ 胞子植物の花束の中から選択された胚に調整された(異なる分野で、最初に広く、次に狭い)。次いで、胚の最も頂端細胞を、45%のレーザーパワーを用いて1msにわたって撮影した。頂端細胞は急速に破裂し、その内容物を放出した。バーストセルのターゴールから解放された隣接するセルは、空の空間を満たしました。5分後、細胞およびその内容物は動きを停止し、平衡状態に達した。ムービーは 4 回加速されました (632 ミリ秒あたり 1 枚の画像から 6 fps まで)。胚発生の追跡結果を 図3に示す。 この映画をダウンロードするにはここをクリックしてください。
動画2:最適でないレーザー設定によるバースト細胞に隣接する細胞の著しい漂白。 60%〜80%のレーザーパワーを1msまたは45%のレーザーパワーを10ms使用すると、隣接する細胞の著しい漂白と生存率がはるかに低くなりました。レーザーに使用する設定は、隣接する細胞に漂白や部分的な損傷を与えてはなりません。最良の結果は、レーザーパルスのパワーおよび/または持続時間を減少させ、隣接する細胞から最も遠い点を標的とすることによって得られた。ここでは、 S. latissima の4細胞胚の最も頂端細胞が撃たれる(80%レーザー出力、1ms)(横方向/上面図)。下部および側方細胞の過剰漂白は容易に観察可能である。その後の胚の発生を 図4に示す。 この映画をダウンロードするにはここをクリックしてください。
補足図1:プロトコル全体の概略フローチャート。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
局所細胞レーザーアブレーションは、高い精度で時間的および空間的アブレーションを可能にします。しかし、その効率は、標的細胞のアクセス不能によって妨げられる可能性がある。例えば、すべての細胞は三次元胚のものである。このプロトコルは、レーザービームですべての細胞を簡単に区別して個別に破壊することができる単層薄層を発達させる藻 類Saccharina latissimaの胚で開発されました。
レーザー出力と波長
NIR fsパルスレーザーは、動物24,25の発達研究において一般的に使用されている。しかし、サッカリーナのような褐藻の場合、レーザーは胚全体を燃やさずに細胞を破裂させることができませんでした。この反応は、葉緑体光ハーベスタの高い活性に関連し得る。
アブレーションにnsパルスUVレーザーを使用して、(1)短期間で高パワーパルスを使用するか、(2)長期間にわたってより低いレーザー露光を使用するかの2つのアプローチを試験した。レーザーによって送達されるエネルギーは、レーザーパワーとパルス持続時間の組み合わせであり、照射されたセルに送達されるエネルギーに影響を与える。送達されたエネルギーはまた、反射および回折によって周囲の細胞に影響を及ぼす可能性がある。したがって、再現性のある結果を与える2つのパラメータの中で最も低い設定を選択して、望ましくない付随的影響を低減しました。1msのパルスで25-40μ W.cm-2の間のレーザー出力が最適であるように見えた。これらのパラメータを使用して、UVレーザーの効果は、周囲の細胞に目に見える漂白がなく、標的細胞を破裂させるのに十分なほど効率的で、非常に局所的なレベルで封じ込められた。これらのパラメータは、胚に対する直接的な致死的影響なしに繰り返し適用された。より長いパルス時間またはより高いレーザーパワーは、周囲の細胞の漂白または胚の死さえも引き起こしたが、低い値は細胞壁を破壊するには不十分であった。
藻類材料および培養条件
細胞内レベルでの正確な射撃を可能にしますが、この技術では、結果を確実に解釈できるように、実験者は4つの重要な要素に対処する必要があります。これらの点は、レーザーアブレーション実験の前後に考慮する必要があります。
対処すべき最初の要因は、胚集団密度である。負の混雑は 、S. latissima26の開発率に影響を与えます。低密度は、(1)レーザー経路内に他の胚が存在するとそのパワーを低下させる可能性があるため、パルス再現性が向上し、(2)レーザーによって撃たれた胚の監視が容易になり、無傷の胚よりもわずかに成長が遅くなります。後者はすぐにショット胚を覆う。このプロトコルの2番目の重要な要素は、実験が行われる温度です。レーザービーム自体はサンプルを加熱しますが、部屋の温度と顕微鏡の局所環境は、サンプルが経験する全体的な温度条件に加わり、18-22°C近くになります。 ここでは、この装置は主に周囲温度に耐える動物細胞に使用されるため、顕微鏡の部屋は冷蔵されませんでした。幸いなことに、 サッカリナ 胚は22°C(最適培養温度13°Cより9°C高い)の温度に最大4時間耐えることができました。しかし、適切な換気や冷却プレートホルダーなど、周囲温度を低く維持するのに役立つデバイスは、藻類胚の生存および発生に対する悪影響のリスクを軽減するのに役立ちます。さらに、赤色光下での配偶子植物の16°Cへのゆっくりとした事前馴化は、アブレーションプロセス中の温度スパイクに胚が耐えるのを助けることができる。第三に、温度の上昇に加えて、胚は実験の期間中、適切な光源を奪われる。また、葉緑体は、561nmレーザーにより部分的に漂白されていてもよい。561nmレーザーで可能な限り低い電力を使用すると、この影響を軽減できます。第四に、レーザーアブレーション装置はすべての研究室で利用できるわけではないため、輸送も考慮すべき重要な要素です。温度スパイクや外部の動きや衝撃は、藻類材料の脱落、損失、または死を防ぐために避けるべきです。可能な限り、輸送箱は冷蔵され、耐振動性(衝撃吸収フォームなど)、およびライトが装備されている必要があります。これらの要件を満たすいくつかの輸送ボックスは、商業的に入手可能です。
これらの要因をすべて可能な限り制御したとしても、弱いが潜在的に重大な環境ストレスは依然として発生する可能性がある。この可能性は、レーザーアブレーションに対する胚応答を分析および解釈する際に考慮されなければならない。
実験全体を通して安定に保たれなければならない環境条件に加えて、モニタリングステップを通して照射された生物を追跡することも課題である。異なる胚の成長は、時間の経過とともに元の風景を変えます。自動顕微鏡を実験のモニタリングに充てることができない限り、レーザーアブレーション後の胚の追跡は時間がかかりやすく、大量のデータを生成する可能性があります。最初のレーザーアブレーションパルス中のビデオ録画は、パルスに対する胚の即時反応を追跡するために強く推奨される。パルス衝撃のこの迅速なモニタリングは、場合によっては、パルスが細胞の中央に標的とされると、細胞の内部と培地(海水)との間の浸透圧濃度の違いのために、標的細胞を急速に破裂させるため、非常に重要です。漏れが速すぎると、隣接するセルも破裂します。標的細胞の最も遠位領域を撮影することは、隣接する細胞に対するバースト効果を緩衝する効率的な方法であることが証明された。激しいバーストを回避する別の効率的な方法は、スクロース27を用いて培地の浸透圧を増加させることである。しかし、浸透圧の違いは、標的細胞の内容物を排除するために必要である。従って、十分な浸透圧電位を維持することが要求される。いくつかのケースでは、葉緑体および他の化合物がレーザーアブレーションによって作られた開口部を妨害し、その結果、細胞はレーザーショットから回復し、数日後に増殖が再開した。開口部の目詰まりを解消するための追加のパルスは、閉塞を防ぐのに十分であることが証明されました。
制限
細胞の内容物を空にするのに十分な高さであるはずのレーザーパワーと、藻類胚において熱ストレスおよび光退色に特に敏感な隣接する細胞の生存との間にトレードオフを打たなければならない。したがって、レーザーショット後の細胞を綿密に監視することは、このステップを制御し、標的細胞が死んでいることを確認するための鍵です。さもなければ、隣接する細胞の運命、したがって胚のその後の発生に関する標的細胞の解釈は誤解を招く可能性がある。
針で細胞を穿刺することは、藻類細胞が熱や光のストレスを受けない代替手段であるように見えるかもしれません。しかし、褐色藻類胚細胞は海水に浸して成長し、固体表面と接触しないため、このアプローチは困難です。厚くて弾力性のある細胞壁は、標準的なマイクロインジェクションシステムのマイクロマニピュレータを使用して、胚を固体のガラス表面と接触させたままにしても、針の貫通に抵抗します。
要約すると、このプロトコルは、褐色藻体のレーザーアブレーションおよびモニタリングのための完全な実験手順および設定、ならびに実験を成功させるための重要なステップを記述する(補足図 1)。このユニークなアプローチは、褐藻の初期胚における細胞相互作用および細胞運命を研究するための有望な方法である。
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Disclosures
著者らには開示するものは何もありません。
Acknowledgments
S.B.の博士号助成金は、ブルターニュ地方(ARED助成金番号COH20020)とソルボンヌ大学から資金提供を受けています。博士課程 I.T.is 助成金は、ブルターニュ地域(ARED助成金番号COH18020)とノルヴェジアンNMBU大学によって資金提供されています。このプロジェクトは、通商産業省の学際的プログラムを通じてCNRSから財政的支援を受けています。MRicは、フランス国立研究庁(ANR-10-INBS-04)が支援する国家インフラフランスバイオイメージングのメンバーです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | - | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | - | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
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