Summary
배아에서 특정 세포의 파괴는 세포 운명과 관련된 세포 상호 작용을 연구하기위한 강력한 도구입니다. 본 프로토콜은 갈색 알가 사카리나 라티시마의 초기 배아에서 표적화된 세포의 레이저 절제술을 위한 기술을 기술한다.
Abstract
Saccharina latissima에서 배아는 lamina 또는 블레이드라고 불리는 단층 세포 시트로 발전합니다. 각 배아 세포는 관찰하기 쉽고, 이웃과 쉽게 구별 할 수 있으며, 개별적으로 타겟팅 될 수 있습니다. 수십 년 동안 레이저 절제는 배아 발달을 연구하는 데 사용되어 왔습니다. 여기서, 갈색 알가 S. 라티시마의 초기 배아를 위해 세포 특이적 레이저 절제를위한 프로토콜이 개발되었다. 제시된 연구에는 (1) 배양 조건을 포함한 중요한 매개 변수에 대한 설명과 함께 사카리나 배아의 준비, (2) 레이저 절제 설정, (3) 타임랩스 현미경을 사용하여 조사 된 배아의 후속 성장 모니터링이 포함됩니다. 또한, 이미징 플랫폼에서 실험실로 배아를 다시 운반하기위한 최적의 조건에 대한 세부 사항이 제공되며, 이는 후속 배아 발달에 중대한 영향을 줄 수 있습니다. Laminariales 순서에 속하는 조류는 Saccharina와 유사한 배아 발생 패턴을 표시하며; Algae belonging to the order Laminariales display embryogenesis pattern similar to Saccharina; 따라서 이 프로토콜은 이 분류에서 다른 종으로 쉽게 옮겨질 수 있다.
Introduction
레이저 절제는 배아 발달을 연구하기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔습니다. 레이저 빔으로 배아 세포를 조사하면 배아 발생 동안 세포 계보의 재생 잠재력 및 변형을 모니터링하고 세포 분열 및 세포 운명에 대한 표적 절제의 영향을 조사 할 수 있습니다. 레이저 절제 방법에 사용되는 모델 유기체는 전형적으로 동물, 예컨대 곤충 1,2, 선충류 3,4, 척추동물 5,6, 및 때때로 식물 7,8이다. 또한, 레이저 미세 절제 접근법이 초기 배아 9,10의 광분극에서 세포벽의 역할을 입증하기 위해 1994 년과1998 년에 갈색 알가 푸쿠스에 사용되었다.
갈색 조류는 1.6 억 년 전에 진핵 나무의 뿌리에서 갈라진 Stramenopiles 그룹에 속합니다. 결과적으로, 이들은 동물 및 식물(11)과 같은 다른 다세포 유기체와 계통유전학적으로 독립적이다. Saccharina latissima는 다시마로 더 일반적으로 알려진 Laminariales 순서에 속하며 지구상에서 가장 큰 유기체 중 하나이며 30m 이상의 크기에 도달합니다. Saccharina sp.는 식품 및 사료와 같은 많은 응용 분야에 사용되는 대형 해초이며 다당류는 전 세계 농업, 약리학 및 화장품 산업에 사용하기 위해 추출됩니다12, 13. 주로 아시아에서, 그리고 최근에는 유럽에서 재배를하기 위해서는 바다에서 청소년을 방출하기 전에 부화장에서 배아를 준비해야합니다. 모든 켈프와 마찬가지로, 그것은 반수체 gametophyte가 성장하고 수정을위한 게이머를 생산하는 현미경 게임 토피틱 단계로 구성된 이단계 생활주기와 큰 평면 블레이드가 해저 또는 암석에 부착 된 홀드 패스트에서 발달하는 이배체 거시적 인 산포 성 단계. 스포로피테는 성숙 시에 반수체 포자를 방출하여 수명주기14,15,16을 완료한다.
S. latissima는 몇 가지 흥미로운 형태학적 특징을 제시한다17. 그것의 배아는 다른 조직 유형의 출현과 일치하는 다층 구조를 획득하기 전에 단층 평면 시트15,18,19로 발전합니다. 또한, Laminariales는 배아가 모성 게임 피텍 조직에 붙어있는 갈색 조류의 유일한 택시 중 하나입니다 (Desmarestiales와 Sporochnales도15 세입니다). 이 기능은이 발달 과정에서 모성 조직의 역할을 연구하고 갈조류의 모성 조절 메커니즘을 동식물의 모성 조절 메커니즘과 비교할 수있는 기회를 제공합니다.
이 기사는 초기 다시마 배아에서 레이저 절제를위한 최초의 완전한 프로토콜을 제시합니다. UV ns-펄스 기술을 포함하는 이 프로토콜은 배아 발생 동안 각각의 역할을 연구하기 위해 개별 배아 세포의 특이적 파괴를 초래한다. 이 절차는 Laminariales에서 배아 발생 중 세포 상호 작용과 세포 운명을 조사하기위한 신뢰할 수있는 접근법을 제공합니다.
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Protocol
1. 사카리나 라티시마 게임토피테스의 생산
- 앞서 기술한 바와 같이 야생으로부터 S. latissima의 성숙한 포자피테를 수집한다20,21. 선택된 sporophytes에 epiphytes (블레이드 표면에 보이는 작은 유기체) 또는 내부 기생충 (블레이드의 표백 된 부위 또는 반점에서 발견됨)이 없는지 확인하십시오.
- 메스를 사용하여 블레이드 중앙의 가장 어두운 부분 (비옥 한 포자 생성 조직22)을 1-5 정사각형 조각 (1cm²)으로 자르고 표백 된 반점이있는 경우 피하십시오.
- 메스 뒷면과 일부 흡수성 종이로 절단 된 조각을 부드럽게 청소하여 남아있는 epiphytes를 제거하십시오.
- 청소된 조각을 멸균된 천연 바닷물로 채워진 유리 접시에 45분 동안 넣어 이전에 발표된 보고서22에 따라 포자를 방출한다.
- 블레이드 조각을 제거하고 40 μm 세포 스트레이너를 통해 바닷물을 여과하여 파편이나 원치 않는 유기체를 제거합니다.
- 여과액의 포자를 플라스틱 페트리 접시 22에 20-40 포자 / mL 농도로 희석하십시오.
- 포자 용액을 최적의 배양 조건(13°C, 24 μE.m-2.s-1, 광주기 16:8 L:D)으로 구성된 배양 캐비닛(자료표 참조)에 놓는다.
- 포자가 발아하여 게임 토피트로 발전하도록하십시오.
참고 : 포자 발아는 캐비닛에서 2 일 후에 볼 수 있으며 게임 토피 세포의 첫 번째 세포 분열은 일반적으로 다음 48 시간 이내에 발생합니다. - 5일 후 성장 배지를 0.5x Provasoli 용액(NSW1/2)으로 농축된 미세 여과된 천연 해수로 교체 한다(표 참조).
참고 : 이러한 단계를 반복하지 않기 위해 특정 남성과 여성 gametophytes를 선택하고 몇 달 동안 식물적으로 전파 할 수 있습니다. 게임토피테스는 전술한 동일한 배양 조건에서 적색광(4 μE.m-2.s-1 이상의 파장을 갖는 580 nm)23 하에서 성장할 때 식물성으로 남아있다(단계 1.7).
2. 난생의 단편화 및 유도
- 세포 스크레이퍼로 gametophytes를 수확하십시오.
- 작은 플라스틱 유모차를 사용하여 수집 된 gametophytes를 1.5 mL 튜브에서 4-5 셀 조각으로 분쇄하십시오.
- 튜브를 1mL NSW1/2로 채웁니다(단계 1.9).
- 분쇄된 게임토피테 용액 2.5μL를 1x 프로바솔리 용액(NSW)이 풍부한 천연 바닷물 3mL에 넣고 페트리 접시에 넣습니다.
참고: 취급이 용이하도록 25mm의 유리 바닥 페트리 접시를 사용하는 것이 좋습니다. - 준비된 접시를 배양 캐비닛에 놓고 24 μE.m-2.s-1 (희미한 빛, 광주기 16:8 L:D)의 강도를 갖는 백색광 하에서 13°C에서 게임토제네시스를 유도한다.
참고 : 첫 번째 gametangia (여성 oogonia 및 남성 archegonia)는 5 일 후에 관찰 될 수 있습니다. 수컷은 작은 세포로 과분형이며, 암컷은 긴 필라멘트15,22를 형성하는 더 큰 세포로 구성됩니다. 첫 번째 알은 ~ 10 일 후에 관찰되며, zygotes의 첫 번째 분열은 보통 다음 2 일 이내에 발생합니다. - 첫 번째 달걀을 관찰 한 지 6 일 후, 접시를 더 밝은 백색광 조건으로 옮깁니다 : 50 μE.m-2.s-1, 광주기 16 : 8 L : D, 여전히 13 °C에서.
3. 절제를위한 배아 선택 및 후속 성장 모니터링을위한 이미지 수집
- 전체 페트리 접시를 이미지화하여 절제 단계 동안 선택된 배아를 (재)위치시키고(접시를 안구 현미경으로 되돌릴 필요가 없음) 선택된 배아의 후속 발달을 모니터링한다.
참고: 이미징을 위해 거꾸로 된 레이저 스캐닝 공초점 현미경( 재료 표 참조)을 사용하고(그림 1), 레이저 절제술은 5단계에서 설명합니다. - 페트리 접시를 무대에 놓고 시각적 인 표시로 방향을 잡으십시오 (예 : 영구 마커가있는 선을 그립니다).
- 배아에 초점을 맞추기 위해 10x/0.45 목표를 사용하십시오. 페트리 접시의 네 가지 기본 포인트의 위치를 기록하십시오.
- 타일 스캔을 시작합니다. 256 x 256 픽셀, 양방향 스캐닝을 통한 1.54 μs의 픽셀 체류 시간, 1.2% 전송에서 561nm 레이저를 사용하여 0.6x의 디지털 줌 등 전체 페트리 접시의 전송/형광 이미지를 저해상도로 획득할 수 있습니다.
참고: 전체 2.5cm 페트리 접시의 스캔 시간은 225타일의 경우 최대 6분입니다(그림 2). 여기서, 561 nm 레이저를 투과 및 형광 이미징에 사용하였다. 형광 신호는 공초점 광배수 (PMT)에서 580-720 nm 사이에서 수집되었고 투과 된 빛은 투과 된 PMT에서 수집되었습니다. 561nm 레이저는이 단계에서 엽록소를 모니터링 할 수도 있지만 신호 잡음과 유기체를 올바르게 구별하는 데 도움이되기 때문에 불필요합니다. - 타일 스캔 이미지를 저장하고 이미지 수집 소프트웨어( 자료 표 참조) 창에서 열어 둡니다.
- 목표를 변경하고, 페트리 접시를 제거하지 마십시오.
참고: 40x/1.2 물 목표는 스테이지 측면으로 이동되어 페트리 접시를 초기 위치에서 움직이지 않고도 침지 매체(물)를 목표에 추가할 수 있었습니다. - 이전에 획득한 타일 스캔 이미지를 탐색하여 적절한 배아를 선택합니다. 이 이미지에서 배아가 확인되면 단계를 배아의 정확한 위치로 이동하고 해당 배아의 전송 / 형광 이미지를 고해상도로 획득하십시오.
참고: 고해상도 설정: 512 x 512 픽셀, 0.130 μm/픽셀, 단방향 스캐닝을 통한 0.208 μs 픽셀 체류 시간 및 0.9% 전송에서 561nm 레이저를 사용하는 2x 디지털 줌. - 레이저 절제를 위해 각 배아 후보에 대한 타일 스캔 이미지에 주석을 달고(도 2B) 레이저 절제 단계를 진행한다.
4. 레이저 교정
- 레이저를 교정하고 이미지 수집 소프트웨어를 "Click & Fire 모드"의 레이저 드라이버 소프트웨어 및 펄스 355nm 레이저와 동기화합니다.
참고: 이 단계는 레이저 드라이버 소프트웨어에서 마우스 커서의 위치( 자료 표 참조)와 획득 소프트웨어의 라이브 이미지 위치 간의 완벽한 동기화를 보장하는 데 매우 중요합니다. - 레이저 드라이버 소프트웨어 패키지를 열고 이미지 수집 소프트웨어 패키지에서 라이브 를 클릭하십시오.
- 레이저 드라이버 소프트웨어 패키지에서 획득 시작 을 클릭하여 두 소프트웨어 패키지를 동기화합니다. 라이브 이미지는 이제 UV 레이저 드라이버 소프트웨어에도 기록됩니다.
- AOI 선택 버튼을 클릭하고 UV 레이저 드라이버 소프트웨어 패키지에서 이미지의 가장자리(오른쪽, 왼쪽, 위쪽 및 아래쪽)를 클릭하여 관심 영역( AOI )을 정의합니다.
참고: 이 보정 단계 후에는 획득 소프트웨어 패키지의 픽셀 크기, 이미지 형식 및 확대/축소에 대한 설정이 일정하게 유지되어야 합니다. - 접시에서 빈 영역을 선택하고 스테이지 레벨을 샘플 초점면 아래 20μm로 낮추어 유리 바닥에 초점을 맞춥니다.
- 교정 시작 을 클릭하여 절제 레이저 및 이미징 레이저 궤적을 설정하고 수동 교정을 선택합니다.
- 유리 커버슬립의 구멍에 해당하는 라이브 이미지 중앙에 검은 점이 보이도록 충분히 높은 레이저 파워를 선택합니다(모든 셔터는 열려 있어야 함).
- 마우스 커서로이 중앙 검은 점을 클릭하고 소프트웨어에서 제안한 18 개의 추가 점을 클릭하여 정렬 절차를 완료하십시오.
- 동일한 커버슬립의 "Click & Fire 모드"에서 보정을 확인하십시오.
참고: 레이저 보정은 이미징 파라미터에 따라 다릅니다. 레이저가 보정되면 이미징 파라미터(예: 단방향 스캐닝 및 2x 디지털 줌을 사용한 512 x 512픽셀, 0.130μm/픽셀, 0.208μs 픽셀 체류 시간)가 변경되지 않았는지 확인하십시오.
5. 레이저 절제
- 관심있는 배아를 선택하십시오. 이미지 수집 소프트웨어에서 타임랩스 녹화를 시작합니다.
- 고해상도에서 40x/1.2W 대물렌즈로 전송/형광 이미지를 획득합니다(즉, 512 x 512 픽셀, 0.130 μm/픽셀, 단방향 스캐닝을 통한 1.54μs 픽셀 체류 시간 및 0.9% 전송에서 561nm 레이저를 사용한 2x 디지털 줌). 최대 속도로 타임랩스 레코딩을 획득합니다.
- 타임랩스 녹화가 시작될 때 영역을 축소합니다. AOI를 확대합니다.
- 레이저 드라이버 소프트웨어의 "Click & Fire" 기능을 사용하여 배아에 관심 있는 세포에 손상 조사를 적용합니다. 45% 레이저 투과율(최대 40μW에 해당) 및 1ms 펄스 시간 지속 시간(단계 4)과 같은 파라미터를 사용합니다.
참고: 레이저 촬영 중 비디오 녹화를 권장합니다. - 688 nm 하에서, 세포질로부터 자가형광 엽록체의 배출을 모니터링한다.
- 셀 내용이 셀에 남아 있으면 "Click & Fire" 기능을 다시 한 번 사용하여 셀의 위반 크기를 늘리십시오. 대부분의 셀 내용이 해제될 때까지 샷 수를 최소한으로 유지하면서 반복하십시오.
- 배아가 안정화된 후에 타임랩스 기록을 중단한다(즉, 더 이상의 세포내 이동은 검출될 수 없다(∼1-5분).
- 필요한 경우 타일 스캔 이미지의 주석을 업데이트합니다.
6. 조사된 배아의 성장 모니터링
참고: 모니터링은 며칠 동안 수행됩니다.
- 레이저 절제 후 발생하는 배아의 수를 모니터링하여 생존율을 결정하고 죽는 배아와 비교하십시오.
참고 : 일부 배아는 여러 가지 이유로 절제 직후에 사망합니다. 높고 빠른 사망률은 일반적으로 부적절한 레이저 매개 변수 또는 실험 또는 후속 운송 중 스트레스에 더 높거나 더 오래 노출된다는 신호입니다. - 매일 레이저 샷 배아의 길이를 측정하고 손상되지 않은 배아와 비교하여 성장 지연을 결정하십시오.
참고 : 레이저 샷 유기체의 성장 속도는 일반적으로 처리되지 않은 유기체의 성장 속도보다 느립니다. 그러나 일부 (부적절한) 레이저 설정은 일주일 이상 성장을 억제 할 수 있으며 그 후에 성장이 재개됩니다. - 절제된 세포에 인접한 세포의 반응을 모니터링함으로써 인접한 손상을 알아내라. 어떤 경우에는 파열 후 감압으로 인해 이웃 세포가 파열될 수 있습니다.
- 미생물 오염을 확인하십시오. 배지에서 미세조류와 박테리아의 성장을 모니터링합니다. 접시에 비정상적인 수준의 미생물이 있으면 폐기하고 2 단계 또는 3 단계의 프로토콜을 반복하십시오.
참고: 레이저 절제 후, 손상된 S. latissima 배아는 이미 높은 스트레스를 받고 있으며, 추가적인 외부 스트레스로 인해 사망률이 증가할 수 있습니다. 박테리아 또는 바이러스 발생은 치료 된 배아가 축 상태에서 자랄 수 없기 때문에 가능합니다. - 표현형을 연구하고 표적 부위의 발달에 대한 역할을 이해함으로써 샷 유기체의 글로벌 개발을 확인하십시오.
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Representative Results
S. latissima의 Gametophytes가 성장되었고, gametogenesis는 zygotes와 embryos를 생산하도록 유도되었다. 게임 발생의 유도 후 열두 일, 배아는 레이저 절제를 받았다. 여기서, 실험은 S. latissima 배아의 전반적인 발달에서 특정 세포의 역할을 평가하는 것을 목표로했다. 가장 정점 세포, 가장 기저 세포, 및 중앙값 세포를 표적으로 삼았다. 타일 스캐닝 후, 관심있는 배아인 페트리 접시 전체(도 2A)를 레이저 촬영에 적합한 후보로 확인하였다(도 2B). 이 배아의 특정 세포를 선택하고, 표적화하고, 1ms 동안 최대 40μW의 레이저 파워(여기에 사용된 장비의 최대 전력의 45%에 해당)를 갖는 펄스 UV 레이저 빔으로 촬영하였다(무비 1). 세포는 내용물 (엽록체와 세포질)을 방출했습니다. 흥미롭게도, 인접한 세포들은 조사된 세포의 파열에 반응하여 세포간 공간으로 확장되었다. 조사된 배아의 위치는 10일에 걸친 후속 모니터링을 위해 기록되었다(도 3). 조사된 배아의 대부분은 계속 발달했지만 성장 변화(배아 모양)를 보였다. 특정 기능이 전체 발달 메커니즘을 제어하는 데있어 조사 된 각 세포에 기인 할 수 있기 전에 형태 학적 변화에 대한 상세한 분석이 수행되어야합니다.
대조적으로, 배아는 다른 레이저 파라미터로 시험되었다 (예를 들어, 60%-80% 레이저 파워의 사격 지속 시간 동안 33ms; 영화 2)는 세포 표백, 퇴색 또는 모양 변화 (반올림)와 같은 심각한 스트레스의 징후를 신속하게 보여주었습니다. 이런 식으로 촬영한 거의 모든 배아는 실험 후 5일 이내에 사망했다(그림 4).
그림 1: 레이저 절제 현미경 설정 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 전체 페트리 접시의 주석이 달린 타일 스캔. (A) 레이저 절제에 사용된 페트리 접시 전체의 타일 스캔. 전송 PMT를 사용하여 브라이트필드 스캔을 획득하였다. 관심있는 배아가 발견되면 사용자는 타일 스캔에서 배아의 위치를 클릭하고 소프트웨어는 배아 바로 위에 단계를 배치합니다. (b) 타일 스캔은 후속 단계에서 배아를 위치시키고, 배아를 추적 및 모니터링하기 위해 구체적으로 주석을 달 수 있다. 여기서, 이미지는 561 nm 레이저를 사용하여 쉽게 위치할 수 있는 페트리 접시의 바닥에 부착된 배아를 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 조사 후 성장하는 S. latissima 배아의 시계열. 이것은 영화 1에 표시됩니다. 배아의 가장 정점 세포의 레이저 절제술은 배아의 인접한 세포를 표백하지 않았다. 그들은 계속 성장하고 분열하여 며칠 후에 정상적인 배아를 형성했습니다. 이미지는 절제 후 24 시간마다, 2-9 일마다 촬영되었다. 스케일 바는 50μm이며 모든 사진에 대해 동일합니다. D2-D9는 일-2일-내지 제9일에 대응한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 차선의 파라미터를 이용한 레이저 절제 후 S. latissima 배아 사멸의 시계열. 레이저 조사에 과다 노출되면 표적 배아와 이웃 배아의 사망률이 높아질 수 있습니다. 영화 2에서 촬영 한 배아의 시계열이 표시되며 절제 후 시간이 각 사진 위에 표시되어 있습니다 (절제 후 3-6 일). 스케일 바는 30 μm이며 각 사진에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1 : S. latissima의 8 세포 배아의 가장 정점 세포의 레이저 절제. 초점은 Saccharina sporophytes의 꽃다발 중에서 선택된 배아에 먼저 조정되었습니다 (다른 분야에서, 처음에는 넓고, 좁은). 배아의 가장 정점 세포를 1ms 동안 45% 레이저 파워를 사용하여 촬영하였다. 정점 세포는 빠르게 파열되어 내용물을 방출했습니다. 버스트 셀의 터거에서 해방 된 인접한 셀이 빈 공간을 채웠습니다. 5 분 후, 세포와 그 내용물은 움직임을 멈추고 평형 상태에 도달했습니다. 동영상이 4 번 가속화되었습니다 (632ms 당 1 이미지에서 6fps로). 배아 발달의 후속조치는 도 3에 나타나 있다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
영화 2 : 차선의 레이저 설정으로 인한 버스트 셀에 인접한 세포의 상당한 표백. 1ms에 대해 60%-80%의 레이저 파워를 사용하거나 10ms 동안 45%의 레이저 파워를 사용하여 인접한 셀의 상당한 표백과 훨씬 낮은 생존율을 가져왔다. 레이저에 사용되는 설정은 인접한 세포에 표백 또는 부분 손상을 일으키지 않아야합니다. 최상의 결과는 레이저 펄스의 전력 및/또는 지속 시간을 감소시키고, 인접한 셀로부터 점 퍼펫스트를 표적화함으로써 얻어졌다. 여기에서, S. latissima 의 4 세포 배아의 가장 정점 세포는 샷 (80 % 레이저 파워, 1ms)(측면 / 상단보기)입니다. 하부 및 측면 세포의 과다 표백은 쉽게 관찰 할 수 있습니다. 배아의 후속 발달은 도 4에 도시되어 있다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 전체 프로토콜의 개략적인 순서도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
국소 세포 레이저 절제술은 높은 수준의 정밀도로 시간적, 공간적 절제를 허용합니다. 그러나, 그의 효율은 표적 세포의 접근성 불능에 의해 방해받을 수 있다; 예를 들어, 모든 세포는 입체 배아로 되어 있다. 이 프로토콜은 alga Saccharina latissima의 배아에서 개발되었으며, 모든 세포를 쉽게 구별하고 레이저 빔으로 개별적으로 파괴 할 수있는 단층 라미나를 개발합니다.
레이저 파워와 파장
NIR fs-펄스 레이저는 일반적으로 동물24,25에 대한 발달 연구에 사용됩니다. 그러나 사카리나 (Saccharina)와 같은 갈조류의 경우, 레이저는 전체 배아를 태우지 않고 세포를 파열 할 수 없었습니다. 이 반응은 엽록체 광 수확기의 높은 활성과 관련이있을 수 있습니다.
절제를 위해 ns-pulsed UV 레이저를 사용하여, 두 가지 접근법이 테스트되었다: (1) 단기간에 걸쳐 고출력 펄스를 사용하거나 (2) 더 긴 기간에 걸쳐 더 낮은 레이저 노출을 이용한다. 레이저 파워와 펄스 지속 시간의 조합인 레이저에 의해 전달되는 에너지는 조사된 셀에 전달되는 에너지에 영향을 미칩니다. 전달된 에너지는 또한 반사 및 회절에 의해 주변 세포에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 재현 가능한 결과를 제공하는 두 매개 변수 중 가장 낮은 설정은 원치 않는 부수적 효과를 줄이기 위해 선택되었습니다. 1ms의 펄스를 갖는 25-40 μ W.cm-2 사이의 레이저 전력은 최적인 것으로 나타났다. 이러한 매개 변수를 사용하여 UV 레이저의 효과는 주변 세포에서 눈에 띄는 표백없이 매우 국소 수준으로 포함되었지만 표적 세포가 파열되게하기에 충분히 효율적이었습니다. 이들 파라미터는 배아에 직접적인 치사 효과 없이 반복적으로 적용되었다. 펄스 시간이 길거나 레이저 파워가 높을수록 주변 세포의 표백 또는 배아의 죽음이 발생했지만 낮은 값은 세포벽을 깨뜨리기에는 불충분했습니다.
조류 물질 및 배양 조건
세포 하부 수준에서 정확한 촬영을 허용하지만,이 기술은 실험자가 결과에 대한 신뢰할 수있는 해석을 가능하게하기 위해 네 가지 중요한 요소를 해결해야합니다. 이 점들은 레이저 절제 실험 전후에 모두 고려되어야합니다.
해결해야 할 첫 번째 요소는 배아 인구 밀도입니다. 부정적인 혼잡은 S. latissima26의 개발 속도에 영향을 미칩니다. 낮은 밀도는 (1) 레이저 경로에 다른 배아의 존재가 그 힘을 감소시킬 수 있기 때문에 더 나은 펄스 반복성을 제공하고, (2) 레이저에 의해 쏘아 올린 배아의 모니터링이 손상되지 않은 배아보다 약간 느리게 성장한다. 후자는 신속하게 주사 배아를 덮는다. 이 프로토콜의 두 번째 중요한 요소는 실험이 수행되는 온도입니다. 레이저 빔 자체는 샘플을 가열하지만 방의 온도와 현미경의 국소 환경은 샘플이 경험하는 전반적인 온도 조건을 18-22 °C에 가깝게 추가합니다. 여기서 현미경의 방은 냉장 보관되지 않았는데, 이 장비는 주로 주변 온도를 견딜 수 있는 동물 세포에 사용되기 때문이다. 다행스럽게도 사카리나 배아는 최대 4시간 동안 22°C(최적 배양 온도 13°C보다 9°C 높음)의 온도를 견딜 수 있었습니다. 그러나 적절한 환기 또는 냉각 플레이트 홀더와 같은 낮은 주변 온도를 유지하는 데 도움이되는 장치는 조류 배아의 생존 및 발달에 대한 부작용의 위험을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 적색광 하에서 16°C까지 게임토피테스의 느린 사전 순응은 배아가 절제 과정 동안 온도 스파이크를 견디는 데 도움이 될 수 있다. 셋째, 온도의 증가에 더하여, 배아는 실험 기간 동안 적합한 광원을 박탈당한다. 더욱이, 엽록체는 561 nm 레이저에 의해 부분적으로 표백될 수 있다. 561nm 레이저에서 가능한 가장 낮은 전력을 사용하면 이러한 효과를 줄일 수 있습니다. 넷째, 레이저 절제 장비가 모든 실험실에서 이용 가능하지 않기 때문에 운송도 고려해야 할 중요한 요소입니다. 온도 급상승과 외부 움직임 또는 충격은 조류 물질의 이탈, 손실 또는 사망을 방지하기 위해 피해야합니다. 가능할 때마다 운송 박스는 냉장 보관되고 진동에 강하며 (예 : 충격 흡수 폼) 조명이 장착되어야합니다. 이러한 요구 사항을 충족하는 여러 운송 박스를 상업적으로 사용할 수 있습니다.
이러한 모든 요인이 가능한 한 많이 제어되더라도 약하지만 잠재적으로 심각한 환경 스트레스가 여전히 발생할 수 있습니다. 이 가능성은 레이저 절제에 대한 배아 반응을 분석하고 해석 할 때 고려되어야합니다.
실험 전반에 걸쳐 안정적으로 유지되어야 하는 환경 조건 외에도, 모니터링 단계 전반에 걸쳐 조사된 유기체를 추적하는 것 또한 과제이다. 다른 배아의 성장은 시간이 지남에 따라 원래의 풍경을 바꿉니다. 자동화 된 현미경이 실험 모니터링에 전념 할 수 없다면, 레이저 절제 후 배아를 따르는 것은 쉽게 시간이 많이 걸리고 많은 양의 데이터를 생성 할 수 있습니다. 초기 레이저 절제 펄스 동안의 비디오 녹화는 펄스에 대한 배아의 즉각적인 반응을 추적하는 것이 좋습니다. 펄스 충격의 이러한 신속한 모니터링은 일부 예에서, 펄스가 세포의 중간을 표적으로 할 때, 표적 세포가 빠르게 파열되는 원인이 되고, 세포의 내부와 배지(바닷물) 사이의 삼투압의 차이로 인해 발생할 가능성이 높기 때문에 상당히 중요하다. 누출이 너무 빠르면 이웃 셀도 파열되었습니다. 표적화된 세포의 가장 원위 영역에서의 촬영은 임의의 인접한 세포에 대한 버스트 효과를 완충시키는 효율적인 방법임이 입증되었다. 폭력적인 파열을 피하는 또 다른 효율적인 방법은 수크로오스27로 배지의 삼투압을 증가시키는 것이다. 그러나, 삼투압의 차이는 표적 세포의 내용물을 제거하기 위해 필요하다. 따라서, 충분한 삼투압 전위를 유지하는 것이 요구된다. 몇몇 경우에, 엽록체와 다른 화합물은 레이저 절제에 의해 만들어진 개구부를 막았고, 그 결과 세포는 레이저 샷에서 회복되고 며칠 후에 성장이 재개되었습니다. 개구부의 막힘을 풀기 위한 추가적인 펄스는 장애물을 방지하기에 충분한 것으로 판명되었다.
제한
세포가 내용물을 비울 수있을만큼 충분히 높아야하는 레이저 파워와 조류 배아에서 열 스트레스와 광표백에 특히 민감한 이웃 세포의 생존 사이에 절충안이 이루어져야합니다. 따라서 레이저 촬영 후 세포를 면밀히 모니터링하는 것이 이 단계를 제어하고 표적 세포가 죽었는지 확인하는 열쇠입니다. 그렇지 않으면, 이웃 세포의 운명에 대한 표적 세포의 해석, 따라서 배아의 후속 발달은 오해의 소지가 있습니다.
바늘로 세포를 뚫는 것은 조류 세포가 열이나 가벼운 스트레스를 경험하지 않는 대안으로 보일 수 있습니다. 그러나이 접근법은 갈색 조류 배아 세포가 바닷물에 잠기고 고체 표면과 접촉하지 않기 때문에 어려울 것입니다. 두껍고 탄력있는 세포벽은 표준 미세 주입 시스템에서 미세 조작기를 사용하여 고체, 유리 표면과 접촉하여 배아를 유지하는 경우에도 바늘 침투에 저항합니다.
요약하면,이 프로토콜은 갈색 조류 배아의 레이저 절제 및 모니터링을위한 완전한 실험 절차 및 설정과 성공적인 실험을위한 중요한 단계를 설명합니다 (보충 그림 1). 이 독특한 접근법은 갈조류의 초기 배아에서 세포 상호 작용과 세포 운명을 연구하는 유망한 방법입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
S.B.의 박사 학위 교부금은 지역 브레타뉴 (ARED 보조금 번호 COH20020)와 소르본 대학 (Sorbonne Université)이 지원합니다. I.T.is PhD 보조금은 지역 브레타뉴 (ARED 보조금 번호 COH18020)와 Norvegian NMBU University가 자금을 지원합니다. 이 프로젝트는 MITI 학제 간 프로그램을 통해 CNRS로부터 재정 지원을 받았습니다. MRic은 프랑스 국립 연구소 (ANR-10-INBS-04)가 지원하는 국가 인프라 France-BioImaging 회원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm glass bottom petri dish | NEST | 801001 | |
| Autoclaved sea water | - | Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m. | |
| Cell scraper | MED 2 | 83.3951 | |
| Cell strainer 40 µm | Corning / Falcon | 352340 | |
| Culture cabinets | Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 | Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled. | |
| LSM 880 Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective | |
| Pellet pestles | Sigma Aldrich | Z359947 | Blue polypropylene (autoclavable) |
| Provasoli supplement | - | Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf | |
| Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | ||
| Scalpel | Paramount | PDSS 11 | |
| SysCon software | Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany | Laser-driver software | |
| ZEN software | Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany | Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version |
References
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