Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Ablación dirigida con láser en el embrión de Saccharina latissima

Published: March 11, 2022 doi: 10.3791/63518

Summary

La destrucción de células específicas en el embrión es una herramienta poderosa para estudiar las interacciones celulares involucradas en el destino celular. El presente protocolo describe técnicas para la ablación con láser de células diana en el embrión temprano del alga marrón Saccharina latissima.

Abstract

En Saccharina latissima, el embrión se desarrolla como una lámina celular monocapa llamada lámina o cuchilla. Cada célula embrionaria es fácil de observar, fácilmente distinguible de sus vecinas, y puede ser dirigida individualmente. Durante décadas, la ablación con láser se ha utilizado para estudiar el desarrollo embrionario. Aquí, se desarrolló un protocolo para la ablación con láser específica de la célula para embriones tempranos del alga marrón S. latissima. El trabajo presentado incluye: (1) la preparación de embriones de Saccharina , con una descripción de los parámetros críticos, incluidas las condiciones de cultivo, (2) los ajustes de ablación con láser y (3) el monitoreo del crecimiento posterior del embrión irradiado mediante microscopía de lapso de tiempo. Además, se proporcionan detalles sobre las condiciones óptimas para transportar los embriones desde la plataforma de imágenes hasta el laboratorio, lo que puede afectar profundamente el desarrollo embrionario posterior. Las algas pertenecientes al orden Laminariales muestran patrones de embriogénesis similares a Saccharina; por lo tanto, este protocolo puede transferirse fácilmente a otras especies en este taxón.

Introduction

La ablación con láser se ha utilizado durante décadas para estudiar el desarrollo embrionario. La irradiación de células embrionarias con un rayo láser permite monitorear el potencial regenerativo y la modificación del linaje celular durante la embriogénesis e investigar el impacto de la ablación dirigida en la división celular y el destino celular. Los organismos modelo utilizados en los métodos de ablación con láser son típicamente animales, como insectos 1,2, nematodos 3,4, vertebrados 5,6 y ocasionalmente plantas 7,8. Además, se utilizó un enfoque de microablación láser en el alga marrón Fucus en 1994 y 1998 para demostrar el papel de la pared celular en la fotopolarización del embrión temprano 9,10.

Las algas pardas pertenecen al grupo Stramenopiles, divergieron en la raíz del árbol eucariota hace 1.600 millones de años. Como resultado, son filogenéticamente independientes de otros organismos multicelulares, como animales y plantas11. Saccharina latissima pertenece al orden Laminariales, más comúnmente conocido como algas marinas, y se encuentran entre los organismos más grandes de la tierra, alcanzando tamaños de más de 30 m. Saccharina sp. es un gran alga marina utilizada para muchas aplicaciones como alimentos y piensos, y sus polisacáridos se extraen para su uso en las industrias agrícola, farmacológica y cosmética en todo el mundo12, 13. Su cultivo, principalmente en Asia y más recientemente en Europa, requiere la preparación de embriones en criaderos antes de liberar juveniles en mar abierto. Como todas las algas marinas, tiene un ciclo de vida bifásico compuesto por una fase gametofítica microscópica, durante la cual un gametofito haploide crece y produce gametos para la fertilización, y una fase esporófita macroscópica diploide, donde se desarrolla una gran cuchilla plana desde su sujeción unida al fondo marino o las rocas. El esporófito libera esporas haploides en la madurez, completando así el ciclo de vida 14,15,16.

S. latissima presenta algunos rasgos morfológicos interesantes17. Su embrión se desarrolla como una lámina plana monocapa 15,18,19 antes de adquirir una estructura multicapa coincidiendo con la aparición de diferentes tipos de tejidos. Además, Laminariales es uno de los únicos taxones de algas pardas cuyos embriones permanecen adheridos a su tejido gametofítico materno (Desmarestiales y Sporochnales también lo hacen15). Esta característica ofrece la oportunidad de estudiar el papel del tejido materno en este proceso de desarrollo y comparar los mecanismos de control materno en algas marrones con los de animales y plantas.

Este artículo presenta el primer protocolo completo para la ablación con láser en un embrión temprano de algas marinas. Este protocolo que involucra la técnica UV ns-pulsada da como resultado la destrucción específica de células embrionarias individuales para estudiar sus respectivos roles durante la embriogénesis. El procedimiento ofrece un enfoque confiable para investigar las interacciones celulares y el destino celular durante la embriogénesis en Laminariales.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Producción de Saccharina latissima gametophytes

  1. Recolectar esporófitos maduros de S. latissima de la naturaleza como se describió anteriormente20,21. Asegúrese de que los esporófitos seleccionados estén desprovistos de epífitas (pequeños organismos visibles en la superficie de la cuchilla) o parásitos internos (que se encuentran en las áreas blanqueadas o manchas en la cuchilla).
  2. Con un bisturí, corte la parte más oscura en el centro de la cuchilla (tejido fértil productor de esporas22) en 1-5 piezas cuadradas (1 cm²), evitando cualquier mancha blanqueada, si está presente.
  3. Retire las epífitas restantes limpiando suavemente los trozos cortados con la parte posterior de un bisturí y un poco de papel absorbente.
  4. Coloque las piezas limpias en un plato de vidrio lleno de agua de mar natural estéril (ver Tabla de materiales) durante 45 minutos para liberar esporas después del informe publicado previamente22.
  5. Retire las piezas de la cuchilla y filtre el agua de mar a través de un colador de células de 40 μm para eliminar los desechos u organismos no deseados.
  6. Diluir las esporas en el filtrado a una concentración de 20-40 esporas/ml en placas de Petri de plástico22.
  7. Coloque la solución de esporas en un gabinete de cultivo (ver Tabla de Materiales) configurado con las condiciones óptimas de cultivo (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, fotoperíodo 16:8 L:D).
  8. Permita que las esporas germinen y se conviertan en gametofitos.
    NOTA: La germinación de las esporas es visible después de 2 días en el gabinete, y la primera división celular de las células gametofíticas generalmente ocurre dentro de las siguientes 48 h.
  9. Reemplace el medio de crecimiento después de 5 días con agua de mar natural microfiltrada enriquecida con una solución de Provasoli 0.5x (NSW1/2) (ver Tabla de Materiales).
    NOTA: Para evitar repetir estos pasos, se pueden seleccionar gametofitos masculinos y femeninos específicos y propagarlos vegetativamente durante varios meses. Los gametófitos permanecen vegetativos cuando se cultivan bajo luz roja (4 μE.m-2.s-1 con una longitud de onda de al menos 580 nm)23 en las mismas condiciones de cultivo descritas anteriormente (paso 1.7).

2. Fragmentación e inducción de la oogénesis

  1. Cosecha gametofitos con un raspador celular.
  2. Usando un pequeño mortero de plástico, triture los gametofitos recolectados en un tubo de 1.5 ml en piezas de 4-5 celdas.
  3. Llene el tubo con 1 ml NSW1/2 (paso 1.9).
  4. Añadir 2,5 μL de la solución de gametofito triturada en 3 ml de agua de mar natural enriquecida con 1 solución de Provasoli (NSW) y colocarlos en una placa de Petri.
    NOTA: Se recomienda una placa de Petri con fondo de vidrio de 25 mm para facilitar su manejo.
  5. Coloque los platos preparados en un gabinete de cultivo e induzca la gametogénesis a 13 °C bajo luz blanca con una intensidad de 24 μE.m-2.s-1 (luz tenue, fotoperiodo 16:8 L:D).
    NOTA: La primera gametangia (oogonia femenina y arquegonia masculina) se puede observar después de 5 días. El macho está hiper-ramificado con células pequeñas, y la hembra está compuesta por células más grandes formando filamentos largos15,22. Los primeros huevos se observan ~ 10 días después, y la primera división de cigotos generalmente ocurre dentro de los siguientes 2 días.
  6. Seis días después de observar los primeros huevos, transfiera los platos a condiciones de luz blanca más brillantes: 50 μE.m-2.s-1, fotoperíodo 16: 8 L: D, todavía a 13 ° C.

3. Adquisición de imágenes para la selección de embriones para la ablación y seguimiento del crecimiento posterior

  1. Tome una imagen de toda la placa de Petri para (re)localizar los embriones seleccionados durante la etapa de ablación (sin necesidad de devolver la placa al microscopio ocular) y monitorear el desarrollo posterior de los embriones seleccionados.
    NOTA: Utilice un microscopio confocal de barrido láser invertido (consulte la Tabla de materiales) para obtener imágenes (Figura 1), y la ablación con láser se describe en el paso 5.
  2. Coloque la placa de Petri en el escenario y orientarla con una marca visual (por ejemplo, dibuje una línea con un marcador permanente).
  3. Utilice el objetivo 10x/0.45 para centrarse en un embrión. Registre la posición de los cuatro puntos cardinales de la placa de Petri.
  4. Inicie el análisis de mosaicos. Adquirir imágenes transmitidas/fluorescentes de toda la placa de Petri a baja resolución: 256 x 256 píxeles, un tiempo de permanencia de píxeles de 1,54 μs con escaneo bidireccional y un zoom digital de 0,6x utilizando un láser de 561 nm con una transmisión del 1,2%.
    NOTA: El tiempo de escaneo para una placa de Petri completa de 2,5 cm es de ~ 6 min para 225 baldosas (Figura 2). Aquí, el láser de 561 nm se utilizó para la transmisión y las imágenes de fluorescencia. La señal de fluorescencia se recogió entre 580-720 nm en los fotomultiplicadores confocales (PMT) y la luz transmitida se recogió en el PMT transmitido. El láser de 561 nm también puede monitorear la clorofila en este paso, pero es innecesario porque solo ayuda a distinguir el ruido de la señal y los organismos correctamente.
  5. Guarde la imagen de escaneo de mosaico y manténgala abierta en la ventana del software de adquisición de imágenes (consulte la Tabla de materiales).
  6. Cambia el objetivo, no retires la placa de Petri.
    NOTA: El objetivo de agua 40x/1.2 se movió al costado del escenario para que el medio de inmersión (agua) pudiera agregarse al objetivo sin mover la placa de Petri de su posición inicial.
  7. Navegue a través de la imagen de escaneo de mosaico previamente adquirida para seleccionar el embrión apropiado. Una vez que se ha identificado un embrión en esta imagen, mueva la etapa a la posición exacta del embrión y adquiera imágenes transmitidas / fluorescentes de ese embrión a alta resolución.
    NOTA: Configuración de alta resolución: 512 x 512 píxeles, 0,130 μm/píxel, tiempo de permanencia de píxeles de 0,208 μs con escaneo monodireccional y zoom digital 2x utilizando un láser de 561 nm con una transmisión del 0,9%.
  8. Anote la imagen de escaneo de mosaico para cada embrión candidato para la ablación con láser (Figura 2B) y proceda a la etapa de ablación con láser.

4. Calibración láser

  1. Calibre el láser y sincronice el software de adquisición de imágenes con el software de controlador láser en el "modo Click & Fire" y un láser pulsado de 355 nm.
    NOTA: Este paso es crucial para garantizar una sincronización perfecta entre la posición del cursor del ratón en el software del controlador láser (consulte la Tabla de materiales) con la posición en la imagen en vivo del software de adquisición.
  2. Abra el paquete de software laser-driver y haga clic en Live en el paquete de software de adquisición de imágenes.
  3. Sincronice ambos paquetes de software haciendo clic en Iniciar adquisición en el paquete de software de controlador láser. La imagen en vivo ahora también se graba en el software del controlador láser UV.
  4. Defina un área de interés (AOI) haciendo clic en el botón Elegir AOI y haciendo clic en los bordes de la imagen (derecha, izquierda, superior e inferior) en el paquete de software del controlador láser UV.
    NOTA: Después de este paso de calibración, la configuración para el tamaño de píxel, el formato de imagen y el zoom en el paquete de software de adquisición debe permanecer constante.
  5. Seleccione un área vacía en el plato y baje el nivel del escenario a 20 μm por debajo del plano focal de la muestra para enfocar el fondo de vidrio.
  6. Configure el láser de ablación y las trayectorias del láser de imágenes haciendo clic en Iniciar calibración y elija Calibración manual.
  7. Seleccione una potencia láser lo suficientemente alta como para ver un punto negro en el centro de la imagen en vivo correspondiente al orificio en la cubierta de vidrio (todos los obturadores deben estar abiertos).
  8. Haga clic en este punto negro central con el cursor del mouse y haga clic en 18 puntos adicionales propuestos por el software para completar el procedimiento de alineación.
  9. Compruebe la calibración en el "Modo Click & Fire" en el mismo coverlip.
    NOTA: La calibración láser depende de los parámetros de imagen. Una vez que el láser haya sido calibrado, asegúrese de que los parámetros de imagen (es decir, 512 x 512 píxeles, 0,130 μm / píxel, 0,208 μs de tiempo de permanencia de píxeles con escaneo monodireccional y zoom digital 2x) no hayan cambiado.

5. Ablación con láser

  1. Selecciona un embrión de interés. Inicie una grabación de lapso de tiempo en el software de adquisición de imágenes.
  2. Adquiera imágenes transmitidas / fluorescencia con un objetivo de 40x / 1.2 W a alta resolución (es decir, 512 x 512 píxeles, 0.130 μm / píxel, tiempo de permanencia de píxeles de 1.54 μs con escaneo monodireccional y zoom digital 2x utilizando un láser de 561 nm a 0.9% de transmisión). Adquiera la grabación de lapso de tiempo a la máxima velocidad.
  3. Aleja el área al comienzo de la grabación de lapso de tiempo. Amplíe el AOI.
  4. Utilice la función "Click & Fire" del software de controlador láser para aplicar la irradiación dañina en la célula de interés en el embrión. Utilice los siguientes parámetros: 45% de transmisión láser (correspondiente a un máximo de 40 μW) y duración del tiempo de pulso de 1 ms (paso 4).
    NOTA: Se recomienda la grabación de vídeo durante el disparo láser.
  5. Por debajo de 688 nm, controlar la eyección de cloroplastos autofluorescentes del citoplasma.
  6. Si el contenido de la celda permanece en la celda, use la función "Click & Fire" una vez más para aumentar el tamaño de la brecha en la celda. Repita, manteniendo el número de disparos al mínimo hasta que se haya liberado la mayor parte del contenido de la celda.
  7. Detener el registro de lapso de tiempo después de que el embrión se haya estabilizado (es decir, no se puede detectar ningún movimiento intracelular adicional (~ 1-5 min).
  8. Actualice la anotación en la imagen de escaneo de mosaico, si es necesario.

6. Monitorización del crecimiento de embriones irradiados

NOTA: El monitoreo se lleva a cabo durante varios días.

  1. Determine la tasa de supervivencia monitoreando el número de embriones que se desarrollan después de la ablación con láser y compárelos con los que mueren.
    NOTA: Algunos embriones mueren inmediatamente después de la ablación por varias razones. Una tasa de mortalidad alta y rápida suele ser un signo de parámetros láser inapropiados o una exposición más alta / más prolongada al estrés durante el experimento o el transporte posterior.
  2. Determine el retraso en el crecimiento midiendo la longitud de los embriones inyectados con láser todos los días y comparándola con embriones intactos.
    NOTA: La tasa de crecimiento de los organismos disparados con láser es generalmente más lenta que la de los organismos no tratados. Sin embargo, algunos ajustes láser (inapropiados) pueden inhibir el crecimiento durante más de una semana, y el crecimiento se reanuda después de eso.
  3. Averigüe el daño adyacente monitoreando la reacción de las células adyacentes a las células ablacionadas. En algunos casos, la despresurización posterior a la explosión puede hacer que las células vecinas estallen.
  4. Compruebe si hay contaminaciones de microbios. Monitorear el crecimiento de microalgas y bacterias en el medio. Si hay un nivel inusual de microbios presentes en el plato, deséchelo y repita el protocolo del paso 2 o el paso 3.
    NOTA: Después de la ablación con láser, los embriones dañados de S. latissima ya están muy estresados, y el estrés externo adicional puede causar un aumento de la mortalidad. Los brotes bacterianos o virales son posibles porque los embriones tratados no pueden crecer en condiciones axénicas.
  5. Verifique el desarrollo global de los organismos disparados estudiando el fenotipo y entendiendo el papel en el desarrollo de la región objetivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Se cultivaron gametofitos de S. latissima , y se indujo la gametogénesis para producir cigotos y embriones. Doce días después de la inducción de la gametogénesis, los embriones se sometieron a ablación con láser. Aquí, el experimento tuvo como objetivo evaluar el papel de células específicas en el desarrollo general de embriones de S. latissima . La célula más apical, la célula más basal y las células medianas fueron atacadas. Después del escaneo de baldosas, toda la placa de Petri (Figura 2A), un embrión de interés, se identificó como un candidato adecuado para el disparo con láser (Figura 2B). Se eligió, se dirigió y disparó una célula específica de este embrión con un rayo láser UV pulsado con un máximo de 40 μW de potencia láser (correspondiente al 45% de la potencia máxima para el equipo utilizado aquí) durante 1 ms (Película 1). La célula liberó su contenido (cloroplastos y citoplasma). Curiosamente, las células adyacentes respondieron al estallido de la célula irradiada expandiéndose hacia el espacio intercelular. La posición de los embriones irradiados se registró para su posterior seguimiento durante 10 días (Figura 3). La mayoría de los embriones irradiados continuaron desarrollándose, pero mostraron alteración del crecimiento (forma embrionaria). Es necesario realizar un análisis detallado de los cambios morfológicos antes de que se pueda atribuir una función específica a cada célula irradiada en el control del mecanismo general de desarrollo.

Por el contrario, los embriones probados con otros parámetros láser (por ejemplo, 33 ms para la duración del disparo del 60% -80% de potencia láser; Película 2) mostró rápidamente signos de estrés severo, como blanqueamiento celular, desvanecimiento o cambios de forma (redondeo). Casi todos los embriones disparados de esta manera murieron dentro de los cinco días posteriores al experimento (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Fotografía de la configuración del microscopio de ablación láser. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Escaneo de baldosas anotadas de una placa de Petri completa. (A) Escaneo de baldosas de toda la placa de Petri utilizada para la ablación con láser. La transmisión PMT se utilizó para obtener un escaneo de campo brillante. Una vez que se ha localizado un embrión de interés, el usuario hace clic en la posición del embrión en el escaneo de mosaico, y el software coloca la etapa directamente sobre el embrión. (B) La exploración de baldosas se puede anotar específicamente para localizar el embrión en los pasos posteriores, para rastrear y monitorear el embrión. Aquí, la imagen muestra un embrión unido a la parte inferior de la placa de Petri, que se puede localizar fácilmente utilizando el láser de 561 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Serie temporal del embrión de S. latissima en crecimiento después de la irradiación. Esto se muestra en la película 1. La ablación con láser de la célula más apical del embrión no blanqueó las células adyacentes del embrión. Continuaron creciendo y dividiéndose, formando un embrión normal después de unos días. Las imágenes se tomaron cada 24 h, 2-9 días después de la ablación. La barra de escala es de 50 μm y es la misma para todas las fotos. D2-D9 corresponde al día-2 al día-9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Serie temporal de muerte embrionaria por S. latissima después de la ablación con láser utilizando parámetros subóptimos. La sobreexposición a la irradiación láser puede conducir fácilmente a tasas de mortalidad más altas del embrión objetivo y también de los vecinos. Se muestra una serie temporal del embrión capturado en la película 2, con el tiempo después de la ablación indicado encima de cada foto (3-6 días después de la ablación). La barra de escala es de 30 μm y se aplica a cada foto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película 1: Ablación con láser de la célula más apical de un embrión de 8 células de S. latissima. El enfoque se ajustó primero en el embrión seleccionado entre un ramo de esporófitos de Saccharina (en diferentes campos, primero ancho, luego estrecho). La célula más apical del embrión se disparó utilizando una potencia láser del 45% durante 1 ms. La célula apical estalló rápidamente y liberó su contenido. Las celdas adyacentes, liberadas de la turgencia de la celda estallada, llenaron el espacio vacío. Después de 5 minutos, la célula y su contenido han dejado de moverse y han alcanzado un estado de equilibrio. La película se ha acelerado 4 veces (de 1 imagen por 632 ms a 6 fps). El seguimiento del desarrollo embrionario se muestra en la Figura 3. Haga clic aquí para descargar esta película.

Película 2: Blanqueamiento significativo de las células adyacentes a una célula estallada causada por ajustes láser subóptimos. El uso de una potencia láser del 60% -80% durante 1 ms o una potencia láser del 45% durante 10 ms dio como resultado un blanqueamiento significativo de las células adyacentes y una tasa de supervivencia mucho menor. Los ajustes utilizados para el láser no deben causar blanqueamiento o daño parcial a las células adyacentes. Los mejores resultados se obtuvieron reduciendo la potencia y / o la duración del pulso del láser, y apuntando al punto más alejado de las células adyacentes. Aquí, se dispara la célula más apical de un embrión de 4 células de S. latissima (80% de potencia láser, 1 ms) (vista lateral / superior). El sangrado excesivo de las células inferiores y laterales es fácilmente observable. El desarrollo posterior del embrión se muestra en la Figura 4. Haga clic aquí para descargar esta película.

Figura complementaria 1: Diagrama de flujo esquemático de todo el protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La ablación celular local con láser permite la ablación temporal y espacial con un alto nivel de precisión. Sin embargo, su eficiencia puede verse obstaculizada por la falta de accesibilidad de las células objetivo; por ejemplo, todas las células son de un embrión tridimensional. Este protocolo se desarrolló en el embrión del alga Saccharina latissima, que desarrolla una lámina monocapa en la que todas las células se pueden distinguir y destruir fácilmente individualmente con un rayo láser.

Potencia y longitud de onda del láser
El láser pulsado NIR fs se usa comúnmente en estudios de desarrollo en animales24,25. Sin embargo, en el caso de las algas marrones como Saccharina, el láser no podía reventar la célula sin quemar todo el embrión. Esta reacción puede estar relacionada con la alta actividad de las cosechadoras ligeras de cloroplasto.

Usando el láser UV pulsado ns para la ablación, se probaron dos enfoques: (1) usar un pulso de alta potencia durante un corto período de tiempo o (2) usar una menor exposición al láser durante un período de tiempo más largo. La energía entregada por el láser, una combinación de potencia láser y duración del pulso, impacta la energía entregada a la célula irradiada. La energía suministrada también puede afectar a las células circundantes por reflexión y difracción. Por lo tanto, se seleccionaron los ajustes más bajos de los dos parámetros que dieron resultados reproducibles para reducir cualquier efecto colateral no deseado. La potencia del láser entre 25-40 μ W.cm-2 con un pulso de 1 ms parecía ser óptima. Usando estos parámetros, el efecto del láser UV se contuvo a un nivel muy local sin blanqueamiento visible en las células circundantes, pero lo suficientemente eficiente como para hacer estallar la célula objetivo. Estos parámetros se aplicaron repetidamente sin ningún efecto letal directo sobre los embriones. Los tiempos de pulso más largos o la mayor potencia del láser causaron el blanqueamiento de las células circundantes o incluso la muerte del embrión, mientras que los valores más bajos fueron insuficientes para romper la pared celular.

Material de algas y condiciones de cultivo
Aunque permite un disparo preciso a nivel subcelular, esta técnica requiere que el experimentador aborde cuatro factores críticos para permitir una interpretación confiable de los resultados. Estos puntos deben considerarse tanto antes como después del experimento de ablación con láser.

El primer factor a abordar es la densidad de población embrionaria. El hacinamiento negativo afecta la tasa de desarrollo de S. latissima26. Las bajas densidades proporcionan (1) una mejor repetibilidad del pulso porque la presencia de otros embriones en la ruta del láser puede disminuir su potencia, y (2) un monitoreo más fácil de los embriones disparados por el láser, que crecen ligeramente más lento que los embriones intactos; este último cubre rápidamente los embriones inyectados. El segundo factor crítico de este protocolo es la temperatura a la que se lleva a cabo el experimento. El rayo láser en sí calienta la muestra, pero la temperatura de la habitación y el entorno local del microscopio se suman a las condiciones generales de temperatura experimentadas por la muestra, cerca de 18-22 ° C. Aquí, la sala del microscopio no estaba refrigerada porque este equipo se utiliza principalmente para células animales que toleran la temperatura ambiente. Afortunadamente, los embriones de Saccharina fueron capaces de soportar temperaturas de 22 °C (9 °C más altas que la temperatura óptima de cultivo de 13 °C) durante hasta 4 h. Sin embargo, los dispositivos para ayudar a mantener una temperatura ambiente baja, como una ventilación adecuada o un soporte de placa de enfriamiento, pueden ayudar a mitigar el riesgo de efectos adversos en la supervivencia y el desarrollo de los embriones de algas. Además, la preaclimación lenta de gametofitos a 16 ° C bajo luz roja puede ayudar a los embriones a soportar picos de temperatura durante el proceso de ablación. En tercer lugar, además del aumento de la temperatura, los embriones se ven privados de una fuente de luz adecuada durante la duración del experimento. Además, los cloroplastos pueden ser parcialmente blanqueados por el láser de 561 nm. El uso de la potencia más baja posible en el láser de 561 nm ayuda a reducir este efecto. Cuarto, el transporte también es un factor crítico a tener en cuenta porque los equipos de ablación láser no están disponibles en todos los laboratorios. Se deben evitar los picos de temperatura y los movimientos o choques externos para evitar el desprendimiento, la pérdida o la muerte del material de algas. Siempre que sea posible, las cajas de transporte deben estar refrigeradas, resistentes a las vibraciones (por ejemplo, espuma amortiguadora) y equipadas con luces. Varias cajas de transporte que cumplen con estos requisitos están disponibles comercialmente.

Incluso si todos estos factores se controlan tanto como sea posible, aún puede ocurrir un estrés ambiental débil pero potencialmente significativo. Esta posibilidad debe considerarse al analizar e interpretar la respuesta embrionaria a la ablación con láser.

Además de las condiciones ambientales que deben mantenerse estables durante todo el experimento, realizar un seguimiento de los organismos irradiados durante todo el paso de monitoreo también es un desafío. El crecimiento de los diferentes embriones cambia el paisaje original con el tiempo. A menos que se pueda dedicar un microscopio automatizado a monitorear el experimento, seguir al embrión después de la ablación con láser puede llevar mucho tiempo y generar grandes cantidades de datos. Las grabaciones de video durante el pulso inicial de ablación con láser son muy recomendables para rastrear la reacción inmediata del embrión al pulso. Este rápido monitoreo del impacto del pulso es de gran importancia porque en algunos casos, el pulso, cuando se dirige a la mitad de la célula, causó que la célula objetivo estallara rápidamente, muy probablemente debido a la diferencia de osmolaridad entre el interior de la célula y el medio (agua de mar). Cuando la fuga fue demasiado rápida, las células vecinas también estallaron. Disparar a la región más distal de la célula objetivo demostró ser una forma eficiente de amortiguar el efecto de estallido en cualquier célula adyacente. Otra forma eficiente de evitar ráfagas violentas es aumentar la osmolaridad del medio con sacarosa27. Sin embargo, la diferencia en la osmolaridad es necesaria para eliminar el contenido de la célula objetivo. Por lo tanto, se requiere mantener un potencial de osmolaridad suficiente. En algunos casos, los cloroplastos y otros compuestos obstruyeron la abertura hecha por la ablación con láser, lo que resultó en que las células se recuperaran de la inyección con láser, y el crecimiento se reanudó después de unos días. Los pulsos adicionales dirigidos a desatascar la abertura demostraron ser suficientes para evitar la obstrucción.

Limitaciones
Se debe lograr una compensación entre la potencia del láser, que debe ser lo suficientemente alta como para hacer que las células vacíen su contenido, y la supervivencia de las células vecinas, que en los embriones de algas son particularmente sensibles al estrés por calor y al fotoblanqueo. Por lo tanto, el monitoreo cercano de las células después de la inyección láser es la clave para controlar este paso y garantizar que las células objetivo estén muertas. De lo contrario, la interpretación de las células objetivo sobre el destino de las células vecinas y, por lo tanto, el desarrollo posterior del embrión, puede ser engañosa.

La punción de células con una aguja puede parecer una alternativa en la que las células de algas no experimentarían ningún calor o estrés lumínico. Sin embargo, este enfoque sería un desafío porque las células embrionarias de algas marrones crecen sumergidas en agua de mar y no tienen contacto con ninguna superficie sólida. La pared celular gruesa y elástica resiste la penetración de la aguja incluso cuando se mantiene el embrión en contacto con una superficie sólida de vidrio utilizando un micromanipulador en un sistema de microinyección estándar.

En resumen, este protocolo describe el procedimiento experimental completo y la configuración para la ablación con láser y el monitoreo de embriones de algas marrones y los pasos críticos para un experimento exitoso (Figura suplementaria 1). Este enfoque único es un método prometedor para estudiar las interacciones celulares y el destino celular en los embriones tempranos de algas pardas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

La beca de doctorado de S.B. está financiada por la Región de Bretaña (número de subvención ARED COH20020) y la Universidad de la Sorbona. I.T.is beca de doctorado está financiada por la Región de Bretaña (número de subvención ARED COH18020) y la Universidad Norvegian NMBU. Este proyecto ha recibido apoyo financiero del CNRS a través de los programas interdisciplinarios del MITI. MRic es miembro de la infraestructura nacional France-BioImaging apoyada por la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR-10-INBS-04).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 mm glass bottom petri dish NEST 801001
Autoclaved sea water - Collected offshore near the Astan buoy (48°44.934 N 003°57.702 W) close to Roscoff, France, at a depth of 20 m.
Cell scraper MED 2 83.3951
Cell strainer 40 µm Corning / Falcon 352340
Culture cabinets Snijders Scientific Plant Growth Cabinet ECD01 Any other brand is suitable provided that the light intensity, the photoperiod and the temperature can be controlled.
LSM 880 Zeiss confocal microscope Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany Ablation and imaging were performed using a 40x/1.2 water objective
Pellet pestles Sigma Aldrich Z359947 Blue polypropylene (autoclavable)
Provasoli supplement - Recipe is available here: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf
Pulsed 355 laser (UGA-42 Caliburn 355/25) Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany
Scalpel Paramount PDSS 11
SysCon software Rapp OptoElectronic, Wedel, Germany Laser-driver software
ZEN software Carl Zeiss microscopy, Jena, Germany Imaging software, used together with the SysCon software; Black 2.3 version

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation. Science. 254 (5029), New York, N.Y. 290-293 (1991).
  2. Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila. Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).
  3. Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).
  4. Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 11 (1), 5084 (2021).
  5. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. Journal of Visualized Experiments. (54), e2845 (2011).
  6. Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes. Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).
  7. Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato. Development. 132 (1), 15-26 (2005).
  8. Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development. Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , https://eurekamag.com/research/003/488/003488317.php 237-250 (1998).
  9. Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. Cell fate determination by the cell wall in early fucus development. Science. 263 (5152), New York, N.Y. 1421-1423 (1994).
  10. Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication. Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).
  11. Bringloe, T., et al. Phylogeny and evolution of the brown algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).
  12. Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review. Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).
  13. Zhang, X., Thomsen, M. Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima. Algal Research. 60, 102499 (2021).
  14. Kanda, T. On the gametophytes of some japanese species of laminariales. Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), Hokkaido Imperial University. 221-260 (1936).
  15. Fritsch, F. E. The structure and reproduction of the algae. Volume 2. , Cambridge University Press. Cambridge. (1945).
  16. Bartsch, I., et al. The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments. European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).
  17. Theodorou, I., Charrier, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology - Established and Emerging. Boutet, A., Schierwater, B. , Francis & Taylor Group, CRC Press. ISBN 9780367444471 485 (2021).
  18. Drew, G. H. The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina. Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).
  19. Yendo, K. The development of costaria, undaria, and laminaria. Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).
  20. Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J. Cultivation protocol for Saccharina latissima. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 14986427. ISBN-13: 978-1498796422 37-59 (2018).
  21. Bartsch, I. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. Protocols for Macroalgae Research. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 149879627. ISBN-13: 978-1498796422 61-78 (2018).
  22. Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -G., Charrier, B. Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches. Bio-protocol. 101, 4132 (2021).
  23. Lüning, K., Dring, M. J. Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina. Planta. 104 (3), 252-256 (1972).
  24. de Medeiros, G., et al. Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1942 (2020).
  25. Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation. Bio-protocol. 6 (24), 2068 (2016).
  26. Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae). Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).
  27. Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, É, Charrier, B. The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control. PLoS Biology. 17 (1), 2005258 (2019).

Tags

Biología del desarrollo Número 181 Sacarina ablación con láser destino celular microscopía confocal algas marrones algas marinas embriones
Ablación dirigida con láser en el embrión de <em>Saccharina latissima</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boscq, S., Dutertre, S., Theodorou,More

Boscq, S., Dutertre, S., Theodorou, I., Charrier, B. Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima. J. Vis. Exp. (181), e63518, doi:10.3791/63518 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter