Summary

Schichtmikrodissektion von Trikuspidalklappenblättern zur biaxialen mechanischen Charakterisierung und mikrostrukturellen Quantifizierung

Published: February 10, 2022
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt die biaxiale mechanische Charakterisierung, die polarisierte Lokalfrequenzbereichs-Imaging-basierte Kollagenquantifizierung und die Mikrodissektion von Trikuspidalklappenblättern. Die bereitgestellte Methode erläutert, wie die Prospektschichten zum ganzheitlichen Verhalten der Broschüre beitragen.

Abstract

Die Trikuspidalklappe (TV) reguliert den unidirektionalen Fluss von sauerstofffreiem Blut vom rechten Vorhof zum rechten Ventrikel. Der Fernseher besteht aus drei Flugblättern mit jeweils einzigartigem mechanischem Verhalten. Diese Variationen zwischen den drei TV-Flugblättern können besser verstanden werden, indem ihre vier anatomischen Schichten untersucht werden, nämlich die Atrialis (Atrialis (A), Spongiosa (S), Fibrosa (F) und Ventricularis (V). Während diese Schichten in allen drei TV-Flugblättern vorhanden sind, gibt es Unterschiede in ihren Dicken und mikrostrukturellen Bestandteilen, die ihr jeweiliges mechanisches Verhalten weiter beeinflussen.

Dieses Protokoll umfasst vier Schritte zur Erläuterung der schichtspezifischen Unterschiede: (i) Charakterisierung des mechanischen und kollagenfaserarchitektonischen Verhaltens des intakten TV-Merkblatts, (ii) Trennung der zusammengesetzten Schichten (A / S und F / V) des TV-Broschüres, (iii) Durchführung der gleichen Charakterisierungen für die zusammengesetzten Schichten und (iv) Durchführung von Post-hoc-Schichten histologische Beurteilung. Dieses experimentelle Framework ermöglicht auf einzigartige Weise den direkten Vergleich des intakten TV-Gewebes mit jeder seiner zusammengesetzten Schichten. Dadurch können mit diesem Protokoll detaillierte Informationen über die Mikrostruktur und biomechanische Funktion der TV-Prospekte gesammelt werden. Solche Informationen können möglicherweise verwendet werden, um TV-Computermodelle zu entwickeln, die Leitlinien für die klinische Behandlung von TV-Erkrankungen liefern sollen.

Introduction

Der Fernseher befindet sich zwischen dem rechten Vorhof und dem rechten Ventrikel des Herzens. Während des gesamten Herzzyklus reguliert der Fernseher den unidirektionalen Blutfluss durch zyklisches Öffnen und Schließen des TV Anterior Leaflet (TVAL), des TV posterior Leaflet (TVPL) und des TV septal leaflet (TVSL). Diese Blättchen sind komplex und haben vier verschiedene anatomische Schichten – die Atrialis (A), die Spongiosa (S), die Fibrosa (F) und die Ventricularis (V) – mit einzigartigen mikrostrukturellen Bestandteilen. Die Elastinfasern in der Atrialis und im Ventrikelbereich tragen dazu bei, das Gewebe nach mechanischer Belastung wieder in seine unverformte Geometrie zu versetzen1. Im Gegensatz dazu enthält die Fibrose ein dichtes Netzwerk von wellenförmigen Kollagenfasern, die zur Tragfähigkeit der Blättchenbeitragen 2. Die Spongiosa, die hauptsächlich aus Glykosaminoglykanen besteht, wurde hypothetisch angenommen, dass sie während der Herzklappenfunktion3 das Scheren zwischen den Blattschichten ermöglicht. Während alle drei Blatttypen die gleichen anatomischen Schichten haben, gibt es Variationen in den Dicken der Schichten und den Verhältnissen der Bestandteile, die Auswirkungen auf das spezifische mechanische Verhalten von Flugblättern haben.

Forscher haben die Eigenschaften der TV-Flugblätter mit planaren mechanischen Charakterisierungen, histomorphologischen Bewertungen und optischen Charakterisierungen der Kollagenfaserarchitektur untersucht. Zum Beispiel versuchen planare biaxiale mechanische Charakterisierungen, die physiologische Belastung nachzuahmen, indem sie senkrechte Verschiebungen auf das Gewebe anwenden und die damit verbundenen Kräfte aufzeichnen. Die daraus resultierenden Kraftverschiebungs- (oder Spannungsdehnungs-) Beobachtungen haben gezeigt, dass alle drei TV-Flugblätter nichtlineares, richtungsspezifisches mechanisches Verhalten mit offensichtlicheren blattspezifischen Reaktionen in der radialen Geweberichtung 4,5,6 aufweisen. Es wird angenommen, dass diese blattspezifischen Verhaltensweisen auf Unterschiede in den mikrostrukturellen Eigenschaften zurückzuführen sind, die mit histologischen Standardtechniken beobachtet wurden 6,7. Darüber hinaus zielen die Bildgebung der zweiten harmonischen Generation 6, die Kleinwinkellichtstreuung8 und die polarisierte räumliche Frequenzbereichsabbildung 7 (pSFDI) darauf ab, diese mikrostrukturellen Eigenschaften zu verstehen und haben blattspezifische Unterschiede in der Kollagenfaserorientierung undder Fasercrimp gezeigt, die Auswirkungen auf das beobachtete mechanische Verhalten auf Gewebeebene haben. Diese Studien haben unser Verständnis der Gewebemikrostruktur und ihrer Rolle im Verhalten auf Gewebeebene erheblich verbessert. Bei der experimentellen Verbindung der Gewebemechanik und der zugrunde liegenden Mikrostruktur bleibt jedoch noch viel zu tun.

Vor kurzem führte dieses Labor mechanische Charakterisierungen der TV-Flugblattschichten durch, die in zwei Verbundschichten (A / S und F / V) unter Verwendung einer Mikrodissektionstechnikgetrennt waren 9. Diese früheren Arbeiten hoben Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften der Schichten hervor und halfen, einen Einblick zu geben, wie die geschichtete Mikrostruktur zum mechanischen Verhalten des Gewebes beiträgt. Obwohl diese Untersuchung unser Verständnis der Mikrostruktur des TV-Flugblatts verbesserte, hatte die Technik mehrere Einschränkungen. Erstens wurden die Eigenschaften der Kompositschichten nicht direkt mit dem intakten Gewebe verglichen, was zu einem Mangel an vollständigem Verständnis der Mechanik-Mikrostruktur-Beziehung führte. Zweitens wurde die Kollagenfaserarchitektur der Verbundschichten nicht untersucht. Drittens wurden nur die Schichten des TVAL untersucht, da Schwierigkeiten beim Sammeln der zusammengesetzten Schichten aus den beiden anderen TV-Flugblättern bestanden. Die hierin beschriebene Methode bietet einen ganzheitlichen Charakterisierungsrahmen, der diese Einschränkungen überwindet und vollständige Charakterisierungen der TV-Broschüren und ihrer zusammengesetzten Schichten liefert.

Dieses Papier beschreibt die Mikrodissektionstechnik, die die drei TV-Flugblätter in ihre zusammengesetzten Schichten (A / S und F / V) für biaxiale mechanische und mikrostrukturelle Charakterisierungen 10,11,12 trennt. Dieses iterative Protokoll umfasst (i) biaxiale mechanische Tests und pSFDI-Charakterisierung der intakten Broschüre, (ii) eine neuartige und reproduzierbare Mikrodissektionstechnik zur zuverlässigen Gewinnung der zusammengesetzten TV-Schichten und (iii) biaxiale mechanische Tests und pSFDI-Charakterisierung der zusammengesetzten TV-Schichten. Das Gewebe wurde einer biaxialen Zugbelastung mit verschiedenen Kraftverhältnissen für mechanische Tests ausgesetzt. Dann wurde pSFDI verwendet, um die Kollagenfaserorientierung und -ausrichtung bei verschiedenen belasteten Konfigurationen zu bestimmen. pSFDI bewahrt die native Kollagenfaserarchitektur, ermöglicht eine lastabhängige Analyse und umgeht die typische Notwendigkeit, Gewebe für die Kollagenfaserarchitekturanalyse zu fixieren oder zu löschen, z. B. bei der Bildgebung der zweiten harmonischen Generation oder der Kleinwinkel-Lichtstreuung. Schließlich wurden die Gewebe mit Hilfe von Standard-Histologie-Techniken vorbereitet, um die Gewebemikrostruktur zu visualisieren. Dieser iterative und ganzheitliche Rahmen ermöglicht den direkten Vergleich der mechanischen und mikrostrukturellen Eigenschaften der TV-Broschüre mit ihren zusammengesetzten Schichten.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Oklahoma genehmigt. Tierisches Gewebe wurde von einem USDA-zugelassenen Schlachthof erworben. 1. Biaxiale mechanische Charakterisierung Gewebepräparation Holen Sie sich eine TV-Broschüre aus dem Gefrierschrank, Rasierklingen, einen chirurgischen Stift, eine Pinzette, eine Pipette mit deionisiertem (DI) Wasser und eine Schneidematte. Tauen Sie die TV-…

Representative Results

Die Mikrodissektion ergibt A/S- und F/V-Proben mit relativ gleichmäßigen Dicken, die an einem (kommerziellen) biaxialen Prüfgerät montiert werden können. Eine histologische Analyse des intakten Blättchens und der beiden sezierten Schichten wird überprüfen, ob das Gewebe entlang der Grenze zwischen Sppongiosa und Fibrosa korrekt getrennt wurde (Abbildung 7). Zusätzlich können die histologischen Mikroaufnahmen verwendet werden, um die Dicken der Gewebeschichten und die Massenanteile …

Discussion

Zu den kritischen Schritten für das Protokoll gehören: (i) die Schichtmikrodissektion, (ii) die Gewebemontage, (iii) die treuhänderische Markerplatzierung und (iv) der pSFDI-Aufbau. Eine geeignete Schichtmikrodissektion ist der wichtigste und schwierigste Aspekt des hierin beschriebenen Verfahrens. Bevor eine Untersuchung mit dieser Technik eingeleitet wird, sollten die Dissektoren langfristige Praxis mit der Mikrodissektionstechnik und allen drei TV-Broschüren haben. Der Dissektor sollte sicherstellen, dass die Verb…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch den American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG27760143) und die Presbyterian Health Foundation unterstützt. KMC wurde zum Teil vom Undergraduate Research Opportunity Program der University of Oklahoma (OU) und dem Honors Research Apprenticeship Program unterstützt. DWL wurde zum Teil durch das National Science Foundation Graduate Research Fellowship (GRF 2019254233) und das American Heart Association/Children’s Heart Foundation Predoctoral Fellowship (Award #821298) unterstützt. All diese Unterstützung wird dankbar anerkannt.

Materials

10% Formalin Solution, Neutral Buffered Sigma-Aldrich HT501128-4L
Alconox Detergent Alconox cleaning compound
BioTester – Biaxial Tester CellScale Biomaterials Testing 1.5 N Load Cell Capacity
Cutting Mat Dahle B0027RS8DU
Deionized Water N/A
Fine-Tipped Tool HTI INSTRUMENTS NSPLS-12
Forceps – Curved Scientific Labwares 16122
Forceps – Thick Scientific Labwares 161001078
Forceps – Thin Scientific Labwares 16127
LabJoy CellScale Biomaterials Testing Version 10.66
Laser Displacement Sensor Keyence IL-030
Liquid Cyanoacrylate Glue Loctite 2436365
MATLAB MathWorks Version 2020a
Micro Scissors HTI Instruments CAS55C
Pipette Belmaks 360758081051Y4
Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device N/A Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera.
See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details.
Scalpel THINKPRICE TP-SCALPEL-3010
Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) VWR International H3515541105024
Surgical Pen LabAider LAB-Skin-6
T-Pins Business Source BSN32351
Wax Board N/A Made in-house using modeling wax and baking tray
Weigh Boat Pure Ponta mdo-azoc-1030

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Cite This Article
Casey, K. M., Laurence, D. W., Tang, M., Lee, C. Layer Microdissection of Tricuspid Valve Leaflets for Biaxial Mechanical Characterization and Microstructural Quantification. J. Vis. Exp. (180), e63522, doi:10.3791/63522 (2022).

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