Summary

Isolering av grupp 2 medfödda lymfoida celler från musens nässlemhinna för att detektera uttrycket av CD226

Published: May 10, 2022
doi:

Summary

Grupp 2 medfödda lymfoida celler (ILC2), inblandade i typ 2-inflammation, deltar huvudsakligen som svar på helminthinfektion, allergiska sjukdomar, metabolisk homeostas och vävnadsreparation. I denna studie demonstreras en procedur för att isolera ILC2s från murin nässlemhinna och detektera uttrycket av CD226.

Abstract

Med riklig forskning om grupp 2 medfödda lymfoida celler (ILC2s) publicerade genom åren är ILC2s allmänt kända för att vara inblandade i reglering av olika patologiska processer, inklusive anti-helminth immunitet, vävnadsreparation, termogenes och autoimmuna sjukdomar som astma och allergisk rinit (AR). ILC2s permanent bor i perifera vävnader såsom hud, tarm, lungor och näshålan; Det finns dock begränsad information om deras exakta funktioner i nasal slemhinneimmunitet. CD226 är en aktiverande costimulatorisk molekyl, huvudsakligen uttryckt på naturliga mördarceller (NK), T-celler och inflammatoriska monocyter. Huruvida ILC2s uttrycker CD226 eller spelar en roll i patogenesen av ILC2s-relaterade sjukdomar är dock fortfarande okänt. Här etablerade vi en metod för att isolera och identifiera ILC2 från nässlemhinnan och detekterade CD226-uttryck på ILC2s erhållna från friska och AR-möss. Här beskriver vi detta protokoll för isolering och identifiering av ILC2s från nässlemhinnan hos möss, vilket kommer att bidra till att utforska den inre patologiska mekanismen för immunologiska störningar vid nasala slemhinnesjukdomar.

Introduction

Grupp 2 medfödda lymfoida celler (ILC2s) upptäcktes först i bukhålans vävnader hos möss och visades därefter vara närvarande i blodet och andra perifera vävnader såsom lungor, hud och näshålan 1,2,3. Som vävnadsresidenta celler upprätthålls och prolifereras ILC2 huvudsakligen lokalt och fungerar som de första vakterna som svarar på exogena skadliga stimuli genom att producera många typ 2-cytokiner och inducera typ 2-immunitet 4,5,6. ILC2 kan också utöva sina effekter genom handel mot de infekterade vävnaderna 7,8.

I likhet med T-hjälpar 2 (Th2) -celler säkerställer de komplicerade regleringsnätverken av ILC2 deras betydande engagemang i utvecklingen av olika typ 2-inflammatoriska sjukdomar, inklusive luftvägsallergiska sjukdomar 8,9. Vid astma kan epitelcellshärledda alarminer aktivera ILC2s, vilket ytterligare främjar lunginflammation genom utsöndring av interleukin (IL)-4, IL-5 och IL-1310. Kliniska studier har också visat att ILC2-nivåerna var signifikant förhöjda i sputum och blod hos patienter med svår astma, vilket tyder på ett samband mellan ILC2 och astmans svårighetsgrad och deras funktion som prediktor för astmaprogression11.

Allergisk rinit (AR) är en vanlig kronisk inflammatorisk sjukdom som drabbar miljontals människor årligen, och effektiva behandlingar för denna sjukdom är begränsade12,13. ILC2 spelar avgörande roller i patofysiologin vid AR, oavsett om det är i sensibiliseringsfasen eller symtomgenerering och inflammationsfas14. Hos patienter med AR har nivåerna av ILC2 i perifert blod rapporterats vara förhöjda både lokalt och systemiskt15. Vissa effekter och de underliggande mekanismerna för ILC2s på patofysiologin och progressionen av AR kräver dock fortfarande ytterligare utforskning.

CD226 – ett transmembranglykoprotein som fungerar som en costimulatorisk molekyl – uttrycks främst på naturliga mördarceller (NK), T-celler och andra inflammatoriska monocyter16,17. Samspelet mellan CD226 och dess ligander (CD155 och/eller CD112) eller konkurrent (TIGIT) gör det möjligt att delta i de biologiska funktionerna hos olika immunceller18. Bindningen av liganderna på antigenpresenterande celler till CD226 på cytotoxiska lymfocyter (CTL) främjar aktiveringen av båda cellerna samtidigt, medan aktiveringen av CTL kan undertryckas ytterligare av TIGIT (T-cellsimmunreceptor med Ig- och ITIM-domäner), konkurrenten till CD22619,20. En human ex vivo-studie visade att CD226 och CD155 på T-celler reglerar balansen mellan Th1/Th17 och Th2 genom differentiell modulering av Th-delmängder21. CD226 kan också förmedla trombocytadhesion och NK-tumördödande aktivitet22,23. Under tiden är CD226 väl studerad i patogenesen av olika infektionssjukdomar, autoimmuna sjukdomar och tumörer 18,24,25. För närvarande har CD226 blivit en ny ljuspunkt för immunterapi. Studier har visat att extracellulära vesiklar kan vända CD226-uttryck på NK-celler för att återställa deras cytotoxiska aktivitet och ingripa i utvecklingen av lungcancer26. En nyligen genomförd studie har avslöjat ett underkluster av fetalt tarmgrupp 3 ILC som kännetecknas av högt CD226-uttryck genom encells-RNA-sekvensering27, vilket indikerade att CD226 kan utöva roller i den medfödda lymfoida cellmedierade immuniteten.

Vår kunskap om ILC2s vid luftvägsinflammation bygger främst på studier på astma; Men lite är känt om deras funktioner i nasal slemhinneimmunitet. Således upprättades ett protokoll för att isolera och identifiera ILC2s från nässlemhinnan. Studien fokuserar på uttrycket av CD226 på ILC2s i näsvävnader och dess variation mellan friska och AR-möss. Detta kan ge nya insikter i de underliggande mekanismerna för ILC2-medierad reglering i den lokala immuniteten och tjäna som grund för att utveckla nya metoder för AR-behandling.

Protocol

Alla försök utfördes i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur. Alla förfaranden och protokoll godkändes av den vetenskapliga forskningsetikkommittén vid det fjärde militära medicinska universitetet (nr 20211008). 1. Murin AR-modelletablering Hus manliga och kvinnliga vildtyp (WT) C57BL / 6 möss i åldern 8-12 veckor under specifika patogenfria förhållanden och ger standard laboratoriechow och vatten. Emulgera 50 μg…

Representative Results

En OVA-inducerad murin modell utvecklades för att utforska ILC2s roll i AR. Konstruktionen av AR-murin modell baserades på tidigare studier med små modifieringar 28,29,30,31. En 10 minuters video fångades för att mäta frekvensen av nysningar och nässkrapning efter den sista nasala utmaningen. Allergiska symtom hos de OVA-inducerade AR-mössen presenterades i figur 1<…

Discussion

ILC2 är nära förknippade med typ 2-inflammation och inflammatoriska störningar, vilket framgår av ett ökande antal studier. Både musmodeller och mänsklig observation bidrar till en bättre förståelse av dess funktion i de övre luftvägarna. Inom astmapatofysiologin aktiveras ILC2 genom tymisk stromal lymfopoietin, IL-25 och IL-33, som mestadels produceras av epitelceller. Sedan speglar Th2-celler, ILC2s producerar IL-4, IL-5 och IL-13 för att förvärra typ 2-inflammation32. Dessutom p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

RZ stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 81871258) och medel från Fourth Military Medical University (No.2020rcfczr). Y.Z. stöddes av Shaanxis naturvetenskapliga grundforskningsprogram (nr 2021JM-081).

Materials

Aluminum hydroxide Meilun biological Technology 21645-51-2
CD11b eBioscience 11-0112-82 Used in antibody coctail
CD11c BioLegend 117306 Used in antibody coctail
CD16/32 BioLegend 101302 Clone: 93; Dilution 1:100
CD226 BioLegend 128812 Used in antibody coctail
CD3e BioLegend 100306 Used in antibody coctail
CD45 BioLegend 103128 Used in antibody coctail
CD45R eBioscience 11-0452-82 Used in antibody coctail
CD90.2 BD Pharmingen 553014 Used in antibody coctail
Collagenase IV DIYIBio DY40128
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950 absolute counting beads
Dnase Equation 1 Beyotime D7076
Fetal Bovine Serum gibco 10270-106
Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) eBioscience 65-0867-14 FVD
HBSS, calcium, magnesium Servicebio G4204-500
KLRG1 eBioscience 17-5893-81 Used in antibody coctail
NaN3 SIGMA S2002
NovoExpress software AgilentTechnologies Version 1.5.0 flow cytometry (FCM) analysis software
OVA SIGMA 9006-59-1
PBS, 1x Servicebio G4202-500
PBS, 10x Servicebio G4207-500
Percoll Yeasen 40501ES60 density gradient media
RPMI 1640 culture media Corning 10-040-CVRV
Spectral cell analyzer SONY SA3800

References

  1. Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
  2. Price, A. E., et al. Systemically dispersed innate IL-13-expressing cells in type 2 immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11489-11494 (2010).
  3. Ebihara, T., et al. Trained innate lymphoid cells in allergic diseases. Allergology International. 70 (2), 174-180 (2021).
  4. Gasteiger, G., Fan, X., Dikiy, S., Lee, S. Y., Rudensky, A. Y. Tissue residency of innate lymphoid cells in lymphoid and nonlymphoid organs. Science. 350 (6263), 981-985 (2015).
  5. Moro, K., et al. Interferon and IL-27 antagonize the function of group 2 innate lymphoid cells and type 2 innate immune responses. Nature Immunology. 17 (1), 76-86 (2016).
  6. Helou, D. G., et al. LAIR-1 acts as an immune checkpoint on activated ILC2s and regulates the induction of airway hyperreactivity. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 149 (1), 223-236 (2022).
  7. Karta, M. R., et al. beta2 integrins rather than beta1 integrins mediate Alternaria-induced group 2 innate lymphoid cell trafficking to the lung. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 329-338 (2018).
  8. Helou, D. G., et al. PD-1 pathway regulates ILC2 metabolism and PD-1 agonist treatment ameliorates airway hyperreactivity. Nature Communications. 11 (1), 3998 (2020).
  9. Kabata, H., Moro, K., Koyasu, S. The group 2 innate lymphoid cell (ILC2) regulatory network and its underlying mechanisms. Immunological Reviews. 286 (1), 37-52 (2018).
  10. Zheng, H., et al. The role of Type 2 innate lymphoid cells in allergic diseases. Frontiers in Immunology. 12, 586078 (2021).
  11. Maggi, L., et al. The dual function of ILC2: From host protection to pathogenic players in type 2 asthma. Molecular Aspects of Medicine. 80, 100981 (2021).
  12. Meltzer, E. O., et al. Burden of allergic rhinitis: results from the Pediatric Allergies in America survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 124, 43-70 (2009).
  13. Wheatley, L. M., Togias, A. Clinical practice. Allergic rhinitis. The New England Journal of Medicine. 372 (5), 456-463 (2015).
  14. Bousquet, J., et al. Allergic rhinitis. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 95 (2020).
  15. Kato, A. Group 2 innate lymphoid cells in airway diseases. Chest. 156 (1), 141-149 (2019).
  16. Nakamura-Shinya, Y., et al. DNAM-1 promotes inflammation-driven tumor development via enhancing IFN-gamma production. International Immunology. 34 (3), 149-157 (2022).
  17. Braun, M., et al. CD155 on Tumor cells drives resistance to immunotherapy by inducing the degradation of the activating receptor CD226 in CD8(+) T cells. Immunity. 53 (4), 805-823 (2020).
  18. Huang, Z., Qi, G., Miller, J. S., Zheng, S. G. CD226: An emerging role in immunologic diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 564 (2020).
  19. Gilfillan, S., et al. DNAM-1 promotes activation of cytotoxic lymphocytes by nonprofessional antigen-presenting cells and tumors. Journal of Experimental Medicine. 205 (13), 2965-2973 (2008).
  20. Zhang, D., et al. TIGIT-Fc alleviates acute graft-versus-host disease by suppressing CTL activation via promoting the generation of immunoregulatory dendritic cells. Biochimica et Biophysica Acta: Molecular Basis of Disease. 1864, 3085-3098 (2018).
  21. Lozano, E., Joller, N., Cao, Y., Kuchroo, V. K., Hafler, D. A. The CD226/CD155 interaction regulates the proinflammatory (Th1/Th17)/anti-inflammatory (Th2) balance in humans. Journal of Immunology. 191 (7), 3673-3680 (2013).
  22. Kojima, H., et al. CD226 mediates platelet and megakaryocytic cell adhesion to vascular endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (38), 36748-36753 (2003).
  23. Martinet, L., Smyth, M. J. Balancing natural killer cell activation through paired receptors. Nature Reviews. Immunology. 15 (4), 243-254 (2015).
  24. Yeo, J., Ko, M., Lee, D. H., Park, Y., Jin, H. S. TIGIT/CD226 axis regulates anti-tumor immunity. Pharmaceuticals. 14 (3), 200 (2021).
  25. Nakano, M., et al. Association of elevated serum soluble CD226 levels with the disease activity and flares of systemic lupus erythematosus. Scientific Reports. 11 (1), 16162 (2021).
  26. Chang, W. A., et al. miR-150-5p-containing extracellular vesicles are a new immunoregulator that favor the progression of lung cancer in hypoxic microenvironments by altering the phenotype of NK cells. Cancers. 13 (24), 6552 (2021).
  27. Stehle, C., et al. T-bet and RORalpha control lymph node formation by regulating embryonic innate lymphoid cell differentiation. Nature Immunology. 22 (10), 1231-1244 (2021).
  28. Piao, C. H., Fan, Y. J., Nguyen, T. V., Song, C. H., Chai, O. H. Mangiferin alleviates ovalbumin-induced allergic rhinitis via Nrf2/HO-1/NF-kappaB signaling pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3415 (2020).
  29. Zhao, Y., Tao, Q., Wu, J., Liu, H. DMBT1 has a protective effect on allergic rhinitis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 121, 109675 (2020).
  30. Piao, C. H., et al. Ethanol extract of Dryopteris crassirhizoma alleviates allergic inflammation via inhibition of Th2 response and mast cell activation in a murine model of allergic rhinitis. Journal of Ethnopharmacology. 232, 21-29 (2019).
  31. Liang, M. J., et al. Immune responses to different patterns of exposure to ovalbumin in a mouse model of allergic rhinitis. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 273 (11), 3783-3788 (2016).
  32. Ebbo, M., Crinier, A., Vely, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews. Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
  33. Seehus, C. R., et al. Alternative activation generates IL-10 producing type 2 innate lymphoid cells. Nature Communications. 8 (1), 1900 (2017).
  34. Cai, T., et al. IL-17-producing ST2(+) group 2 innate lymphoid cells play a pathogenic role in lung inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (1), 229-244 (2019).
  35. Golebski, K., et al. IL-1beta, IL-23, and TGF-beta drive plasticity of human ILC2s towards IL-17-producing ILCs in nasal inflammation. Nature Communications. 10 (1), 2162 (2019).
  36. Lei, A., Zhou, J. Cell-surface molecule-mediated cell-cell interactions in the regulation of ILC2-driven allergic inflammation. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (22), 4503-4510 (2019).
  37. Maazi, H., et al. ICOS:ICOS-ligand interaction is required for type 2 innate lymphoid cell function, homeostasis, and induction of airway hyperreactivity. Immunity. 42 (3), 538-551 (2015).
  38. Lei, A. H., et al. ICAM-1 controls development and function of ILC2. The Journal of Experimental Medicine. 215 (8), 2157-2174 (2018).
  39. Drake, L. Y., Iijima, K., Kita, H. Group 2 innate lymphoid cells and CD4+ T cells cooperate to mediate type 2 immune response in mice. Allergy. 69 (10), 1300-1307 (2014).
  40. Wang, Y., et al. The comparation of intraperitoneal injection and nasal-only delivery allergic rhinitis model challenged with different allergen concentration. American Journal of Rhinology & Allergy. 33 (2), 145-152 (2019).
  41. Niu, Y., et al. HIF1alpha deficiency in dendritic cells attenuates symptoms and inflammatory indicators of allergic rhinitis in a SIRT1-dependent manner. International Archives of Allergy and Immunology. 181 (8), 585-593 (2020).
  42. Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of alpha-lipoic acid via balancing Th17/Treg expression and enhancing Nrf2/HO-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
  43. Pyun, B. J., et al. Gardenia jasminoides attenuates allergic rhinitis-induced inflammation by inhibiting periostin production. Pharmaceuticals (Basel). 14 (10), 986 (2021).
  44. Liu, Z., et al. Analysis of expression of ILC2 cells in nasal mucosa based on animal model of allergic bacterial infection rhinitis. Journal of Infection and Public Health. 14 (1), 77-83 (2021).
  45. Hu, B., Wang, Y., Zheng, G., Zhang, H., Ni, L. Effect of parasympathetic inhibition on expression of ILC2 cells in a mouse model of allergic rhinitis. The World Allergy Organization journal. 14 (9), 100582 (2021).
  46. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  47. Krisna, S. S., et al. Optimized protocol for immunophenotyping of melanoma and tumor-bearing skin from mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100627 (2021).
  48. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  49. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
  50. Loering, S., et al. Differences in pulmonary group 2 innate lymphoid cells are dependent on mouse age, sex and strain. Immunology and Cell Biology. 99 (5), 542-551 (2021).
  51. Lin, L., et al. Allergic inflammation is exacerbated by allergen-induced type 2 innate lymphoid cells in a murine model of allergic rhinitis. Rhinology Journal. 55 (4), 339-347 (2017).

Play Video

Cite This Article
Xie, Y., Zhang, Y., Liu, Y., Wang, Y., Cheng, K., Zhuang, R., Bian, K. Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226. J. Vis. Exp. (183), e63525, doi:10.3791/63525 (2022).

View Video