Summary
يصف البروتوكول مفاعلا حيويا ممكنا للتصوير يسمح بالإزالة الانتقائية للظهارة الداخلية من القصبة الهوائية للفئران والتوزيع المتجانس للخلايا الخارجية على سطح التجويف ، يليه زراعة طويلة الأجل في المختبر لبناء أنسجة الخلية.
Abstract
يمكن أن تؤدي الإصابة المتكررة لأنسجة مجرى الهواء إلى إضعاف وظائف الرئة والتسبب في أمراض الرئة المزمنة، مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن. يوفر التقدم في الطب التجديدي وتقنيات المفاعلات الحيوية فرصا لإنتاج أنسجة وظيفية مزروعة في المختبر وهياكل الأعضاء التي يمكن استخدامها لفحص الأدوية ونمذجة الأمراض وهندسة استبدال الأنسجة. هنا ، يتم وصف مفاعل حيوي مصغر مقترن بطريقة تصوير تسمح في الموقع بتصور التجويف الداخلي للقصبة الهوائية للفئران المسحوبة أثناء التلاعب بالأنسجة في المختبر والزراعة. باستخدام هذا المفاعل الحيوي ، يوضح البروتوكول الإزالة الانتقائية الموجهة بالتصوير للمكونات الخلوية الداخلية مع الحفاظ على الميزات الكيميائية الحيوية الجوهرية والبنية الفائقة لمصفوفة أنسجة مجرى الهواء. علاوة على ذلك ، يتم عرض التسليم والتوزيع الموحد والاستزراع المطول اللاحق للخلايا الخارجية على تجويف مجرى الهواء الخالي من الخلايا مع المراقبة البصرية في الموقع . وتسلط النتائج الضوء على أنه يمكن استخدام المفاعل الحيوي الموجه بالتصوير لتسهيل توليد أنسجة مجرى الهواء الوظيفية في المختبر .
Introduction
يصطف السطح المضيء للجهاز التنفسي بطبقة من الظهارة تتكون أساسا من الخلايا الجذعية متعددة الأهداب والنادي والكأس والخلايا الجذعية القاعدية 1,2. تعمل الطبقة الظهارية كآلية دفاعية أولية للرئة ، حيث تعمل كحاجز فيزيائي حيوي يحمي أنسجة مجرى الهواء الأساسي من مسببات الأمراض المستنشقة أو الجسيمات أو الغازات الكيميائية. يحمي أنسجة مجرى الهواء عبر آليات متعددة ، بما في ذلك تكوين تقاطع ضيق بين الخلايا ، وإزالة الغشاء المخاطي الهدبي ، وإفراز مضادات الميكروبات ومضادات الأكسدة 3,4. ترتبط ظهارة مجرى الهواء المعيبة بأمراض الجهاز التنفسي المدمرة، مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)5، وخلل الحركة الهدبية الأولية (PCD)6، والتليف الكيسي (CF)7.
يمثل التقدم في تكنولوجيا الرئة على الرقاقة (LOC) فرصة لدراسة تطور الرئة البشرية ، ونمذجة أمراض الرئة المختلفة ، وتطوير مواد علاجية جديدة في بيئات مختبرية منظمة بإحكام. على سبيل المثال ، يمكن استزراع ظهارة مجرى الهواء والبطانة على الجانبين المتقابلين من غشاء رقيق مسامي لتقليد الغاز الذي يتبادل أنسجة الرئة ، مما يسمح بنمذجة الأمراض المخلصة واختبار الأدوية8. وبالمثل ، تم إنشاء نماذج الأمراض في المختبر لنمذجة أمراض مجرى الهواء في المختبر ، مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن9 والتليف الكيسي10. ومع ذلك ، فإن التحدي الرئيسي لأجهزة LOC هو تلخيص البنية المعقدة ثلاثية الأبعاد (3D) لأنسجة الرئة وتفاعلات مصفوفة الأنسجة الخلوية الديناميكية في المختبر11.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير منهجيات هندسة الأنسجة المبتكرة التي تسمح بالتلاعب بأنسجة الرئة خارج الجسم الحي 12. باستخدام هذه المنهجيات ، يمكن تحضير طعوم الأنسجة الخالية أو الغريبة عن طريق إزالة الخلايا الداخلية من أنسجة الرئة عن طريق العلاجات الكيميائية والفيزيائية والميكانيكية13. بالإضافة إلى ذلك ، توفر مصفوفة الأنسجة الأصلية خارج الخلية المحفوظة (ECM) في سقالات الرئة المنزوعة الخلايا الإشارات الهيكلية والكيميائية الحيوية والميكانيكية الحيوية للخلايا المزروعة لربط وتكاثر وتمييز14,15.
هنا ، يتم الإبلاغ عن نظام مفاعل حيوي موجه بالتصوير تم إنشاؤه من خلال الجمع بين تقنيات LOC وهندسة الأنسجة للسماح في المختبر بمعالجة الأنسجة وزراعة أنسجة القصبة الهوائية للفئران المزروعة. باستخدام هذا المفاعل الحيوي لأنسجة مجرى الهواء ، يوضح البروتوكول الإزالة الانتقائية للخلايا الظهارية الداخلية دون تعطيل المكونات الخلوية والكيميائية الحيوية تحت الظهارية الأساسية لأنسجة مجرى الهواء. نعرض بعد ذلك التوزيع المتجانس والترسب الفوري للخلايا الخارجية المبذرة حديثا ، مثل الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) ، على تجويف مجرى الهواء العارية عن طريق غرس محلول الكولاجين I المحمل بالخلية I قبل الهلام. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام جهاز التصوير الضوئي الدقيق المدمج في المفاعل الحيوي ، يتم أيضا تصور تجويف القصبة الهوائية أثناء إزالة الظهارة وتوصيل الخلايا الذاتية. علاوة على ذلك ، تبين أنه يمكن زراعة القصبة الهوائية والخلايا المزروعة حديثا في المفاعل الحيوي دون موت ملحوظ للخلايا وتدهور الأنسجة لمدة 4 أيام. نحن نتصور أن منصة المفاعل الحيوي التي تدعم التصوير ، وتقنية إزالة الظهارة القائمة على الأغشية الرقيقة ، وطريقة توصيل الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة يمكن أن تكون مفيدة لتوليد أنسجة مجرى الهواء لنمذجة الأمراض في المختبر وفحص الأدوية.
يتضمن المفاعل الحيوي غرفة مستطيلة متصلة بمضخة حقنة قابلة للبرمجة ومضخة تروية وجهاز تهوية لزراعة القصبة الهوائية للفئران المعزولة. يتميز المفاعل الحيوي بمداخل ومنافذ متصلة بالقصبة الهوائية أو غرفة زراعة الأنسجة لتزويد الكواشف بشكل منفصل (مثل وسائط الاستزراع) بالمساحات الداخلية والخارجية للقصبة الهوائية (الشكل 1). يمكن استخدام نظام تصوير مصمم خصيصا لتصور الجزء الداخلي من القصبة الهوائية للفئران المستزرعة في المختبر على المستوى الخلوي (الشكل 2). تتم إزالة الظهارة الداخلية للقصبة الهوائية عن طريق تقطير محلول إزالة الخلايا القائم على المنظفات يليه غسل مجرى الهواء بمساعدة الاهتزاز (الشكل 3). يستخدم محلول الهيدروجيل ، مثل الكولاجين من النوع الأول ، كوسيلة توصيل لبذر الخلايا الخارجية بشكل موحد وفوري عبر تجويف القصبة الهوائية العارية (الشكل 4). يتم توفير جميع المواد المستخدمة لبناء المفاعل الحيوي وإجراء التجارب في جدول المواد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على بروتوكول الأنسجة الحيوانية أدناه من قبل المبادئ التوجيهية واللوائح الخاصة برعاية الحيوان ولوائح لجنة معهد رعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في معهد ستيفنز للتكنولوجيا ، وهو يتوافق مع المبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) لاستخدام التجارب.
1. تصميم وبناء مفاعل القصبة الهوائية الفئران الموجهة بالتصوير
- تصميم وتصنيع المفاعل الحيوي للقصبة الهوائية للفئران
- إنشاء نموذج تصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) لغرفة المفاعل الحيوي مع التصميم ذي الصلة ، مثل المداخل والمنافذ وغرفة زراعة الأنسجة ، باستخدام برنامج مولد CAD. في هذه الدراسة، استخدم الهندسة والأبعاد الواردة في الشكل 1A-C. يمكن العثور على البرنامج التعليمي لبرنامج مولد CAD في16,17.
- قم بتصدير نموذج CAD الذي تم إنشاؤه إلى برنامج تحكم في التحكم العددي (CNC) بالكمبيوتر وقطع البلاستيك متعدد التترافلورو إيثيلين (PTFE) باستخدام آلة CNC لإنشاء غرفة المفاعل الحيوي. يمكن العثور على البرنامج التعليمي لبرنامج وحدة التحكم CNC في18.
ملاحظة: بالإضافة إلى PTFE ، يمكن استخدام مواد بلاستيكية أخرى ، مثل البولي إيثيلين عالي الوزن الجزيئي (UHMWPE) والبولي إيثرميد لتصنيع غرفة الثقافة. - تعقيم جميع مكونات المفاعل الحيوي، مثل محولات Luer والبراغي، لتجنب تلوث الأنسجة والخلايا المزروعة في الجهاز. تجميع جميع مكونات المفاعل الحيوي في غرفة زراعة الأنسجة الرئيسية في بيئة نظيفة (الشكل 1 أ).
- بناء جهاز تصوير قائم على عدسة مؤشر التدرج (GRIN)
- لإنشاء جهاز التصوير في الموقع، أدخل عدسة أنبوبية في أنبوب عدسة قابل للتكديس وقم بتأمينه باستخدام حلقة استبقاء. قم بتركيب مجموعة أنبوب العدسة على كاميرا CMOS علمية عبر محول C-mount.
- استخدم برامج، مثل Micro-Manager، لتشغيل الكاميرا والحصول على الصور ومقاطع الفيديو. قم بتصويب جسم يقع على مسافة طويلة (على سبيل المثال ، 10 أمتار من الكاميرا) واضبط المسافة بين عدسة الأنبوب ومستشعر التصوير الخاص بالكاميرا حتى يتم تشكيل صورة مركزة للجسم على شاشة الكمبيوتر بواسطة برنامج التصوير المستخدم.
- قم بتركيب عدسة مرشح على مرآة ثنائية اللون فائقة الدقة ذات حواف مزدوجة وليزر على الجهاز باستخدام مكونات نظام القفص البصري ، بما في ذلك قضيب التجميع ولوحة القفص الملولبة ومكعب القفص.
- قم بتوصيل العدسة الموضوعية (20x) بالجهاز. قم بتركيب عدسة GRIN (قطرها = 500 ميكرومتر) في الطرف البعيد من أنبوب العدسة عبر مترجم XY. اضبط المسافة بين عدسة GRIN والعدسة الموضوعية لتشكيل صور مجهرية مركزة (الشكل 2A و B).
2. عزل القصبة الهوائية الفئران
- قم بتعقيم المنطقة الجراحية وتعقيم الأدوات الجراحية باستخدام الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الجراحة.
- ضع فأرا في غرفة الحث وقم بتوصيل 2.5٪ من الأيزوفلوران لمدة 15 دقيقة باستخدام مبخر صغير لتخدير الحيوان. تقييم عمق التخدير عن طريق منعكس دواسة. للقيام بذلك ، قرصة إصبع القدم بحزم وتأكيد أن الحيوان لا يستجيب لقرصة إصبع القدم.
- بعد التخدير، قم بإزالة الأيزوفلوران من الغرفة وإعطاء 1 مل من 1000 وحدة / مل من الهيبارين من خلال الوريد الذيل الجانبي لمنع تخثر الدم في الأوعية الدموية الرئوية.
- للقتل الرحيم للحيوان ، تعريض الحيوان ل 5 ٪ isoflurane لمدة 15-20 دقيقة إضافية. قم بإزالة الحيوان من غرفة الحث وضعه على اللوحة الجراحية في وضع ضعيف وجها لوجه.
- إصلاح الفئران على اللوحة الجراحية عن طريق شل حركة الساقين والذيل باستخدام شريط لاصق. بعد ذلك ، قم بتعقيم مناطق عنق الفئران وصدرها باستخدام 70٪ من كحول الأيزوبروبيل (IPA). افتح تجويف البطن عن طريق إجراء شق 3-4 سم باستخدام مقص في الجلد.
ملاحظة: احرص على عدم قطع الجلد بعمق عن طريق توجيه أطراف المقص لأعلى. - عبور الوريد الأجوف السفلي (IVC) باستخدام المقص وتأكيد القتل الرحيم عن طريق الإخراج.
- قم بإجراء بضع القصبة الهوائية عن طريق إجراء شق باستخدام مقص في خط الوسط من الرقبة وكشف القصبة الهوائية. قم بإجراء بضع الصدر في خط الوسط عن طريق إجراء شق في جدار الصدر والقطع بين الأضلاع للوصول إلى نهاية القصبة الهوائية المتصلة بالرئة. بعد ذلك ، استخدم العضلة ذات الرأسين والمقص لقطع طرفي القصبة الهوائية وعزل القصبة الهوائية.
- بعد العزل ، اشطف القصبة الهوائية باستخدام 20 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS). نقل القصبة الهوائية إلى المفاعل الحيوي باستخدام العضلة ذات الرأسين المعقمة. قم بتثبيت طرفي القصبة الهوائية على موصل Luer باستخدام خيط خياطة 4-0.
- قم بتوصيل 5 مل من وسط الاستزراع إلى غرفة المفاعل الحيوي باستخدام مضخة المحاقن القابلة للبرمجة من خلال الأنابيب المتصلة بغرفة المفاعل الحيوي بمعدل تدفق قدره 5 مل / دقيقة.
ملاحظة: يتكون وسط الاستزراع من وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) ، و FGF-basic البشري المؤتلف (0.1 نانوغرام / مل) ، ومصل البقر الجنيني (FBS ، 10٪) ، والمضادات الحيوية المضادة للفطريات (1٪). - أغلق غطاء المفاعل الحيوي بإحكام باستخدام غطاء ومسامير بلاستيكية أكريليك. أغلق وصلات أنابيب غرفة المفاعل الحيوي مع سدادات Luer للذكور / الإناث لمنع تدفق وسط الاستزراع في الأنابيب.
3. إزالة الظهارة القصبية الهوائية الموجهة بالتصوير
- لتصور تجويف القصبة الهوائية إما في المجال الساطع أو الفلورسنت ، ضع المفاعل الحيوي على مرحلة التصوير (الشكل 3A).
- تحضير محلول كاربوكسي فلوريسين سكسينيميديل استر (CFSE) (التركيز: 100 ميكرومتر) في مجموعة وضع العلامات على خلايا CFSE عن طريق تخفيف محلول CFSE مع 1x PBS.
ملاحظة: تركيز محلول CFSE الأصلي هو 10 mM (في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)). - غرس 500 ميكرولتر من محلول CFSE من خلال القصبة الهوائية عبر مضخة المحقنة من خلال الأنابيب المتصلة بقنية القصبة الهوائية بمعدل تدفق 5 مل / دقيقة. أوقف المضخة عندما يملأ محلول CFSE القصبة الهوائية. انتظر لمدة 10 دقائق ، ثم اغسل تجويف القصبة الهوائية عن طريق ضخ 10 مل من 1x PBS باستخدام مضخة المحقنة لإزالة كاشف CFSE المتبقي غير المدمج.
- أدخل نهاية التصوير البعيدة لعدسة GRIN في القصبة الهوائية عبر موصل Luer المتصل بأحد طرفي القصبة الهوائية. بعد ذلك، حرك عدسة GRIN برفق داخل القصبة الهوائية حتى يتم تركيز سطح القصبة الهوائية والتقط الصور ومقاطع الفيديو في مجال ساطع أو تألق عند تكبير 20x.
- لالتقاط صور ذات مجال ساطع في برنامج Micro-Manager ، اتبع الخطوات أدناه.
- أدخل الضوء الأبيض من خلال مكعب القفص لإلقاء الضوء على تجويف القصبة الهوائية. انقر على أيقونة Live لإظهار السطح المضيء للقصبة الهوائية في الوقت الفعلي. استخدم إعداد التصوير > التعرض (مللي ثانية) لتغيير وقت التعرض إلى القيمة المطلوبة. في هذه الدراسة ، كان وقت التعرض المستخدم في حدود 10 مللي ثانية و 50 مللي ثانية.
- لضبط تباين الصور وسطوعها، استخدم نافذة الرسم البياني وقياس الكثافة لنقل الأسهم بالأبيض والأسود عند نقطة نهاية شاشة الرسم البياني التفاعلي. بدلا من ذلك ، استخدم خيار Auto Stretch الذي يسمح للبرنامج بضبط السطوع والتباين تلقائيا إلى المستويات المثلى.
- انقر على أيقونة Snap لتجميد الصورة. ثم استخدم إعداد > تصدير الصور كنازح لحفظ الصور بالتنسيق المطلوب. بدلا من ذلك، استخدم الإعداد > ImageJ لتصدير الصورة مباشرة إلى برنامج ImageJ وحفظها.
- للحصول على الصور ومقاطع الفيديو في وضع الفلورسنت، قم بإضاءة تجويف القصبة الهوائية باستخدام ضوء ليزر خاص ب CFSE (CFSE: الطول الموجي للإثارة: 488 نانومتر، الطول الموجي للانبعاثات: 515 نانومتر) من خلال مكعب القفص. اتبع الخطوات 3.5.2-3.5.3 للحصول على الصور. بعد التقاط الصور ومقاطع الفيديو ، قم بإزالة عدسة GRIN بلطف من القصبة الهوائية.
- قم بإجراء إزالة الظهارة كما هو موضح أدناه.
- تحضير 2٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) محلول إزالة الخلايا في الماء المقطر (DI). غرس 50 ميكرولتر من SDS من خلال القصبة الهوائية بمعدل تدفق 6.3 مل / دقيقة ، باستخدام مضخة حقنة من خلال قنية القصبة الهوائية لتوليد طبقة رقيقة من محلول المنظفات على تجويف القصبة الهوائية.
- أغلق وصلات أنابيب المفاعل الحيوي باستخدام سدادات Luer للذكور / الإناث وانقل المفاعل الحيوي إلى حاضنة. اسمح ل SDS بالسكن داخل القصبة الهوائية لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. غرس 50 ميكرولتر أخرى من محلول SDS من خلال القصبة الهوائية واحتضانها لمدة 10 دقائق.
- قم بإزالة الظهارة المحللة و SDS عن طريق ري تجويف القصبة الهوائية ب 500 ميكرولتر من 1x PBS عبر مضخة حقنة بمعدل تدفق 10 مل / دقيقة لمدة 3x. ضع المفاعل الحيوي على شاكر واهتز ميكانيكيا المفاعل الحيوي عند تردد 20 هرتز وسعة إزاحة تبلغ حوالي 0.3 مم لتعزيز انفصال الخلايا الظهارية المعالجة ب SDS جسديا عن تجويف القصبة الهوائية.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم بناء الخلاط خصيصا عن طريق تجميع مكبر صوت مضخم صوت ، ومضخم صوت لوحة مضخم الصوت ، ومقياس تسارع. تم إنشاء شكل موجي جيبي بواسطة جهاز كمبيوتر وتم إدخاله في الاهتزاز عبر مكبر الصوت ، في حين تم رصد استجابة الاهتزاز عبر مقياس التسارع (الشكل 3B). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الهزازات التقليدية ، مثل الهزازات الكهرومغناطيسية والقصور الذاتي ، لتعزيز انفصال الخلايا. للقيام بذلك ، اضبط تردد وتسارع الاهتزاز على 20 هرتز و 0.5 جم ، على التوالي (أي ما يعادل سعة الإزاحة 0.3 مم). - غرس 500 ميكرولتر من 1x PBS مرتين من خلال تجويف القصبة الهوائية لإزالة SDS المتبقية وحطام الخلايا أثناء اهتزاز القصبة الهوائية ميكانيكيا. بعد إجراء إزالة الظهارة ، قم بتقييم إزالة الطبقة الظهارية عن طريق قياس شدة CFSE باستخدام جهاز تصوير عدسة GRIN كما في الخطوة 3.6 (الشكل 3C).
4. إعداد أنسجة القصبة الهوائية لمزيد من التحليلات
- لتأكيد إزالة الظهارة ، قم بإجراء المزيد من تحليلات الأنسجة ، مثل تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) ، والتريكروم ، والخماسي ، والتلطيخ المناعي. للقيام بذلك ، قم بإزالة القصبة الهوائية من المفاعل الحيوي ، وقم بإصلاحها في 30 مل من محلول بارافورمالدهيد المحايد المخزن مؤقتا بنسبة 4٪ في 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- تجفيف وتضمين أنسجة القصبة الهوائية الثابتة باتباع الخطوات أدناه.
- بعد التثبيت ، اغسل أنسجة القصبة الهوائية ب 10 مل من 1x PBS ، وانقل القصبة الهوائية إلى 30 مل من الكحول بنسبة 70٪ ، واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. قطع القصبة الهوائية إلى أقسام أسطوانية صغيرة (~ 5 مم) باستخدام شفرة حادة وأدخل أقسام الأنسجة في أشرطة مدمجة في الأنسجة (الطول × العرض × الارتفاع: 4 سم × 2.5 سم × 0.5 سم). احتفظ بقسمين من القصبة الهوائية في كل كاسيت.
- تجفيف الأقسام في سلسلة من محاليل كحول الأيزوبروبيل (IPA) - 85 ٪ ، 90 ٪ ، 95 ٪ ، 100 ٪ - لمدة 1 ساعة في 30 مل من كل محلول. قم بإزالة الحل السابق قبل إضافة الحل التالي.
- عند الانتهاء ، قم بغمر الكاسيت في 30 مل من عامل التطهير (على سبيل المثال ، الزيلين) لمدة 2 ساعة لإزاحة محلول IPA من أقسام الأنسجة تماما. قم بتنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان مع التهوية المناسبة.
- اغمر الكاسيت في البارافين لمدة 2 ساعة ، ثم قم بتضمينها في البارافين عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد ذلك ، قم بقطع الأنسجة المضمنة في البارافين إلى أقسام رقيقة (5-8 ميكرومتر) باستخدام جهاز microtome ل H & E و trichrome و pentachrome و immunostaining.
- لإعداد الأنسجة لتحليل المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) ، قم بإصلاح القصبة الهوائية في 30 مل من محلول glutaraldehyde 2.5٪ في 1x PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. ثم ، تجفيف أنسجة القصبة الهوائية الثابتة ل SEM باتباع الخطوات أدناه.
- بعد التثبيت ، شطف أنسجة القصبة الهوائية مع 10 مل من 1x PBS. قطع أنسجة القصبة الهوائية طوليا إلى أقسام صغيرة شبه أسطوانة (الطول: ~ 5 مم) باستخدام مقص وأدخل أقسام الأنسجة في الكاسيت.
- تجفيف الأقسام في سلسلة من حلول IPA - 35 ٪ ، 50 ٪ ، 70 ٪ ، 85 ٪ ، 95 ٪ ، و 100 ٪ - لمدة 10 دقائق في 30 مل من كل محلول. قم بإزالة الحل السابق قبل إضافة الحل التالي.
- قم بإجراء طريقة تجفيف قائمة على سداسي ميثيل ديسيلازان (HMDS) عن طريق غمر الأنسجة في المحاليل التالية: 100٪ IPA: HMDS (2: 1 ؛ v / v) لمدة 10 دقائق ، تليها IPA 100٪: HMDS (1: 2 ؛ v / v) لمدة 10 دقائق ، وأخيرا 100٪ HMDS بين عشية وضحاها.
ملاحظة: HMDS سامة. اعمل تحت غطاء الدخان أثناء جميع خطوات التجفيف. - قم بإزالة الأنسجة من محلول HMDS واتركها تجف تحت غطاء الدخان لمدة 1 ساعة. قم بتركيب القسم على كعب دبوس الألومنيوم باستخدام شريط موصل كربوني على الوجهين أو عجينة موصلة فضية لتصوير SEM.
5. التوزيع المتجانس للخلايا الخارجية على تجويف القصبة الهوائية العارية
- قم بإعداد القصبة الهوائية للفئران غير الظهارية باستخدام البروتوكول في الخطوة 3. قم بإذابة الخلايا الجذعية الوسيطة المجمدة (MSCs) لمدة 30 ثانية في حمام مائي 37 درجة مئوية.
ملاحظة: في هذه الدراسة، استخدمنا الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) كخلية نموذجية لإظهار توزيع الخلايا الخارجية على القصبة الهوائية غير الظهارية. من الناحية المثالية ، يمكن استخدام الخلايا الظهارية الأولية في مجرى الهواء أو الخلايا القاعدية أو الخلايا متعددة القدرات البشرية المستحثة (iPSCs) لأغراض تجديد الظهارة. - عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وقم بإعداد محلول خلوي بتركيز 5 × 106 خلايا / مل. قم بتسمية الخلايا بشكل فلوري عن طريق احتضان الخلايا ب 2 مل من محلول CFSE (التركيز: 100 ميكرومتر) في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. شطف الخلايا مع 5 مل من 1x PBS لمدة 3x وإعادة تعليق الخلايا في وسط ثقافة جديدة بتركيز نهائي من 3 × 107 خلايا / مل.
- تحضير محلول ما قبل الهلام الهيدروجيل كوسيلة لتوصيل الخلايا. في هذه الدراسة ، استخدم الكولاجين I كوسيلة توصيل لخلايا MSCs واتبع تعليمات الشركة المصنعة لإعداد ما قبل الهلام. على سبيل المثال ، للحصول على 3.6 ملغ / مل من الكولاجين قبل الهلام ، امزج جزءا واحدا من محلول التحييد المبرد مع تسعة أجزاء من كولاجين ذيل الفئران في أنبوب معقم 1.5 مل. ثم ، قم بسحب الخليط بلطف لأعلى ولأسفل للحصول على خلط كاف.
ملاحظة: يمكن استخدام هيدروجيل آخر متوافق حيويا بدلا من الكولاجين I وفقا للدراسة واحتياجات المستخدم. - بمجرد تحضير محلول الهيدروجيل ، أضف الخلايا بسرعة إلى المحلول بالتركيز المطلوب (على سبيل المثال ، 5 × 106 خلايا / مل). للحصول على خليط موحد من الخلية والهيدروجيل ، امزج الخلايا ومحلول الجل عن طريق السحب بلطف باستخدام ماصة دقيقة.
- قم بتوصيل أحد طرفي القصبة الهوائية داخل المفاعل الحيوي بمضخة حقنة قابلة للبرمجة من خلال موصل Luer. قم بتوصيل 5 مل من وسط الاستزراع الطازج عند 37 درجة مئوية إلى غرفة المفاعل الحيوي لتغطية السطح الخارجي للقصبة الهوائية باستخدام مضخة المحقنة بمعدل تدفق قدره 5 مل / دقيقة.
- قم بإعطاء بلعة 10 ميكرولتر من خليط الخلية والهيدروجيل في القصبة الهوائية غير الظهارية داخل المفاعل الحيوي باستخدام مضخة المحقنة بمعدل تدفق قدره 5 مل / دقيقة لتوليد طبقة هيدروجيل خلية على تجويف القصبة الهوائية (الشكل 4).
- بعد حقن الخلية ، ضع المفاعل الحيوي في حاضنة زراعة الخلايا المعقمة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 للتبلور. بالنسبة للكولاجين I ، يحدث الهلام في 30 دقيقة.
- لتصور توزيع الخلايا المزروعة ، قم بتعقيم عدسة GRIN عن طريق المسح باستخدام 70٪ IPA أو الإيثانول ووضع المفاعل الحيوي على مرحلة التصوير. التقط الصور ومقاطع الفيديو في كل من وضعي المجال الساطع والفلورسنت حسب الحاجة.
- بعد 30 دقيقة من بذر الخلايا ، قم ببث 1 مل من وسط الزرع في تجويف القصبة الهوائية باستخدام مضخة حقنة بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة.
- استزرع القصبة الهوائية المزروعة بالخلايا داخل المفاعل الحيوي في حاضنة عند 37 درجة مئوية للوقت المطلوب. بالنسبة للثقافة طويلة الأجل ، قم بتحديث وسط الاستزراع في تجويف القصبة الهوائية وغرفة المفاعل الحيوي كل 24 ساعة. أثناء زراعة الخلية، حافظ على الوسائط داخل التجويف ثابتا وقم بتغييرها كل 24 ساعة، في حين أن الوسائط خارج القصبة الهوائية يتم تشغيلها باستمرار عبر تدفق أحادي الاتجاه عند 5 مل / دقيقة.
- بعد زراعة الخلايا لفترة زمنية معينة (على سبيل المثال ، 1 و 4 أيام في هذه الدراسة) ، قم بإزالة القصبة الهوائية من المفاعل الحيوي. استخدم المقص لقطع القصبة الهوائية طوليا إلى قسمين شبه أسطوانيين (أي القسمين العلوي والسفلي) في اليومين 1 و 4 من الثقافة في المختبر لفضح الأسطح الداخلية لمراقبة نمو الخلايا وحساب كثافة الخلايا. استخدم مجهر الفلورسنت التقليدي لتصور الخلايا على الأسطح الداخلية.
- للحصول على الصور باستخدام برنامج Micro-Manager، اتبع الخطوتين 3.5 و3.6. استخدم مرشح إيزوثيوسيانات الفلوريسين (FITC) لتصور الخلايا التي تحمل علامة CFSE في وضع التألق. تحليل الصور التي التقطها المجهر الفلورسنت وحساب كثافة الخلايا في القسمين العلوي والسفلي باستخدام برنامج ImageJ. لحساب عدد الخلايا وكثافة الخلايا، اتبع الخطوات أدناه.
- افتح صورة في برنامج ImageJ وقم بتحويل الصورة إلى صورة ثنائية (16 بت) باستخدام Image > Type > 16 بت. اضبط مقياس الصورة باستخدام شريط المقياس باستخدام تحليل > تعيين المقياس.
- اضبط عتبة الصورة لتمييز هياكل الخلايا المراد عدها. استخدم الصورة > ضبط عتبة >. استخدم تحليل > تحليل الجسيمات لحساب عدد الخلايا. احسب كثافة الخلايا بقسمة عدد الخلايا على مساحة سطح الصورة.
- لتقييم الجدوى بعد بذر الخلايا، استخدم مجموعة أدوات صلاحية الخلية. لهذه الدراسة ، احتضن أنسجة القصبة الهوائية والخلايا الموجودة في المفاعل الحيوي عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات وقم بتلطيخ الخلايا ب 4 mM calcein-AM و 2 mM ethidium homodimer-1 في 1 مل من 1x PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- بعد الشطف باستخدام 1x PBS ، تصور الخلايا باستخدام مجهر الفلورسنت. عد الخلايا الحية والميتة باستخدام الخطوات الموضحة في الخطوة 5.12. احسب صلاحية الخلية كنسبة مئوية من الخلايا الحية (الملطخة بالكالسيين-AM) لكل خلية إجمالية (الخلايا الحية والميتة على حد سواء).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن أن تسمح طريقة التصوير في الموقع القائمة على عدسة GRIN بتصور التجويف الداخلي للقصبة الهوائية في الموقع (الشكل 5A). باستخدام طريقة التصوير هذه ، يمكن الحصول على صور المجال الساطع والفلورسنت للقصبة الهوائية الأصلية وغير الظهارية (الشكل 5B ، C). لم تلاحظ أي إشارة فلورسنت من القصبة الهوائية الأصلية قبل وضع العلامات CFSE (الشكل 5Bii). ومع ذلك ، عندما تم تصنيف ظهارة القصبة الهوائية بصبغة CFSE ، لوحظت إشارة فلورسنت موحدة (خضراء) في جميع أنحاء الظهارة (الشكل 5Ci). بعد إزالة الظهارة عن طريق SDS والري بمساعدة الاهتزاز في مجرى الهواء ، انخفضت شدة إشارة الفلورسنت بشكل كبير (الشكل 5Cii) ، مما يشير إلى استئصال الظهارة.
أظهرت صور H&E للقصبة الهوائية غير الظهارية إزالة الظهارة الطبقية الزائفة من تجويف القصبة الهوائية والحفاظ على الخلايا والبنية المجهرية ECM في طبقات الأنسجة الأساسية (الشكل 6A). علاوة على ذلك ، أكد خماسي اللون (الشكل 6B) وتلطيخ التريكروم (الشكل 6C) الحفاظ على بنية أنسجة القصبة الهوائية ومكونات ECM ، مثل الكولاجين والبروتيوغليكان. علاوة على ذلك ، التألق المناعي للخلايا الظهارية (جزيء التصاق الخلايا الظهارية ، EpCAM; الشكل 6 دال) والكولاجين I (الشكل 6E) كشف عن إزالة كاملة للظهارة والحفاظ على الكولاجين I داخل الأنسجة تحت الظهارية. أظهر تصوير SEM للقصبة الهوائية الأصلية أن السطح المضيء للقصبة الهوائية للفئران الأصلية كان ممتلئا بشكل أساسي بخلايا متعددة الأهداب وخلايا كأسية. من ناحية أخرى ، أظهرت صور SEM لتجويف القصبة الهوائية غير الظهارية أن الغشاء السفلي تعرض كما هو موضح في شبكة شبكية من ألياف ECM وغياب الخلايا الظهارية (الشكل 6F).
باستخدام القصبات الهوائية للفئران غير الظهارية والخلايا المصنفة بالفلورسنت ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كان دمج هيدروجيل كوسيلة لتوصيل الخلايا يمكن أن يحقق توزيعا متجانسا للخلايا على تجويف القصبة الهوائية غير الظهاري (الشكل 7A ، B). في هذه الدراسة ، تم استخدام الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) كخلايا نموذجية لدراسة توصيل الخلايا وزراعتها. كما هو موضح في البروتوكول (الخطوة 5) ، قمنا بغرس الكولاجين I المحمل ب MSC قبل الهلام في القصبة الهوائية للفئران غير الظهارية وراقبنا توزيع الخلايا على تجويف القصبة الهوائية باستخدام نظام تصوير عدسة GRIN. كتجربة تحكم ، قمنا بتعليق MSCs في وسط الثقافة ، وغرسنا وسط الثقافة المحمل بالخلايا في القصبة الهوائية ، وفحصنا بصريا توزيع الخلايا. أظهرت نتائج التصوير في الموقع أن الخلايا الموسومة بالفلورسنت التي يتم تسليمها عبر الهيدروجيل ظلت ملتصقة بشكل أكثر اتساقا عبر التجويف من تلك التي تم زرعها عبر وسط الاستزراع (الشكل 7B). ثم اختبرنا صلاحية الخلية قبل وبعد تسليم الخلية لتقييم تلف الخلايا المحتمل والموت بسبب إجهاد القص أثناء ضخ الخلايا. أظهرت النتيجة أن صلاحية الخلايا لم تتأثر بشكل كبير بإجراء توصيل الخلايا حيث ظل أكثر من 90٪ من الخلايا قابلة للحياة (الشكل 7C).
علاوة على ذلك ، قمنا بزراعة القصبات الهوائية المزروعة بالخلايا لمدة 4 أيام. تكاثرت الخلايا المزروعة عبر كل من الكولاجين ووسط الثقافة (السيطرة) على سطح تجويف القصبة الهوائية غير الظهاري كما هو موضح في زيادة عدد الخلايا التي تعبر عن CFSE بمرور الوقت في كل من النصف العلوي والسفلي من تجويف القصبة الهوائية (الشكل 7D). والجدير بالذكر أنه في مجموعة توصيل هيدروجيل الكولاجين ، كان الفرق في كثافة الخلايا بين التجويف العلوي والسفلي أصغر من ذلك الموجود في المجموعة الضابطة ، مما يشير إلى أن توصيل الخلايا عبر الهيدروجيل يعزز توزيع الخلايا المتجانس في جميع أنحاء تجويف القصبة الهوائية.
الشكل 1: رسم حاسوبي ثلاثي الأبعاد (3D) للمفاعل الحيوي للقصبة الهوائية . (A) (i) عرض جانبي ، (ii) عرض علوي. (ب) أبعاد غرفة المفاعل الأحيائي. (ج) يتم قطع ورقة بلاستيكية شفافة من الأكريليك وتثبيتها في الجزء العلوي من الغرفة الرئيسية باستخدام مسامير. الوحدة = مم ؛ R = نصف القطر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصوير الألياف الدقيقة المصممة خصيصا للتصور في الموقع للقصبة الهوائية للفئران. (أ) (ط) مخطط لمكونات إعداد التصوير لمسار الضوء. الاختصارات: C = الكاميرا ، TL = عدسة الأنبوب ، F = مرشح ، DM = مرآة ثنائية اللون ، OL = عدسة موضوعية ؛ (ii) يتم إدخال صورة فوتوغرافية لمكونات إعداد التصوير التي تظهر مسبار التصوير (عدسة GRIN) في موصل Luer الخاص بالمفاعل الحيوي. (ب) مخطط يبين أن عدسة GRIN مدمجة مع المفاعل الحيوي. (ج) يتم استخدام صورة فوتوغرافية تظهر مسبار التصوير لتصور القصبة الهوائية داخل المفاعل الحيوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: منصة إزالة الظهارة من القصبة الهوائية للفئران . (أ) صورة فوتوغرافية توضح الإعداد التجريبي لإزالة الظهارة وتصوير الألياف البصرية في الموقع . (ب) رسم بياني يوضح مكون وتجميع الخلاط الكهرومغناطيسي المصمم خصيصا لتيسير إزالة الظهارة. ω: التردد ، أ: السعة (C) تخطيطي يوضح سير عمل إجراء إزالة الظهارة من القصبة الهوائية للفئران. PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: توصيل الخلايا الخارجية إلى القصبة الهوائية للفئران غير الظهارية باستخدام الهيدروجيل. مخطط يوضح محلول الهيدروجيل المستخدم كوسيلة توصيل لإيداع الخلايا موضعيا على التجويف الداخلي للقصبة الهوائية للفئران المنزوعة الظهارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التصوير في الموقع للقصبة الهوائية غير الظهارية. (أ) صورة فوتوغرافية تظهر التصوير الفلورسنت لتجويف القصبة الهوائية بينما تكون الظهارة الموسومة ب CFSE متحمسة باستخدام ليزر أزرق 488 نانومتر من خلال عدسة GRIN. (ب) (ط) صور المجال الساطع و (ب) التألق لتجويف القصبة الهوائية قبل وسم الظهارة. (ج) صور التألق للقصبة الهوائية (i) الأصلية و (ii) غير الظهارية (De-Epi trachea) بينما يتم تصنيف الظهارة بصبغة فلورسنت CFSE. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: علم الأنسجة، والتألق المناعي، وتحليلات SEM للقصبات الهوائية للفئران الأصلية وغير الظهارية. (أ) تلطيخ H & E. (ب) تلطيخ خماسي اللون حيث يكون اللون الأرجواني هو سيتوبلازم الخلية ، والأزرق هو نوى الخلية ، والأخضر هو البروتيوغليكان (على سبيل المثال ، الميوسين) ، والأصفر هو ألياف الكولاجين. (ج) تلطيخ التريكروم حيث اللون الوردي هو سيتوبلازم الخلية ، والأزرق الداكن هو نوى الخلية ، والأزرق هو الكولاجين. صور التألق للقصبات الهوائية الأصلية وغير الظهارية. (D) EpCAM و (E) الكولاجين I. تظهر رؤوس الأسهم سطح تجويف القصبة الهوائية. (و) الرسوم البيانية المجهرية SEM لتجويف القصبة الهوائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: الترسيب الموضعي ل MSCs الخارجية المنشأ في تجويف القصبة الهوائية. (أ) (ط) الحقل الساطع و (ب) الصور الفلورية للقصبة الهوائية غير الظهارية. (ب) الصور الفلورية لتجويف القصبة الهوائية غير الظهاري عندما يتم زرعه ب (i) PBS و (ii) الكولاجين I قبل الهلام. يتم تحقيق التوزيع المتجانس للخلايا على تجويف القصبة الهوائية عندما يتم استخدام الكولاجين قبل الهلام كوسيلة توصيل للخلايا. (ج) (ط) صور الفلورسنت و (ب) تحديد مدى صلاحية الخلايا كميا قبل وبعد 6 ساعات من التسليم بواسطة كولاجين ما قبل الهلام. n: عدد العينات. تم اتباع الخطوتين 5.1 و 5.17 من البروتوكول لتقييم صلاحية الخلايا. (د) كثافة بذر الخلايا تقاس بعد (i) 1 يوم و (ii) 4 أيام بعد بذر الخلايا وزراعتها. تم حساب كثافة الخلايا عن طريق قسمة أرقام الخلايا على مساحة السطح التي تم فحصها. تمثل جميع القيم متوسط الانحراف المعياري ±. تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) لتحديد الفروق ذات الدلالة الإحصائية بين المجموعات، مع اعتبار p < 0.05 ذات دلالة. الاختصارات: CM = وسط الثقافة ، C = الكولاجين. * ص < 0.05. **ص < 0.01. ns: ليست مهمة. لا يوجد فرق كبير (ns) بين الأسطح العلوية والسفلية يعني توزيعا موحدا للخلايا عبر محيط القصبة الهوائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا العمل ، أنشأنا مفاعلا حيويا موجها بالتصوير يمكن أن يسمح (i) بمراقبة تجويف القصبة الهوائية في الموقع بعد إزالة الخلية وتوصيل الخلايا الخارجية و (ii) على المدى الطويل في المختبر لأنسجة القصبة الهوائية المزروعة بالخلايا. باستخدام هذا المفاعل الحيوي المصمم خصيصا ، أظهرنا (i) الإزالة الانتقائية للخلايا الظهارية الداخلية من تجويف القصبة الهوائية باستخدام غسل مجرى الهواء بمساعدة المنظفات والاهتزاز و (ii) التوزيع الموحد للخلايا الخارجية على السطح اللمعاني للقصبة الهوائية العارية باستخدام الكولاجين I المحمل بالخلية قبل الهلام. علاوة على ذلك ، أكدت طريقة التصوير القائمة على عدسة GRIN إزالة الظهارة في الموقع. علاوة على ذلك ، مع مزيد من التحليلات ، بما في ذلك H & E و trichrome و pentachrome و immunofluorescence staining و SEM ، أكدنا إزالة الظهارة والحفاظ على بنية ومكونات طبقات الأنسجة الأساسية. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر التصوير القائم على عدسة GRIN ل MSCs الخارجية المزروعة حديثا التوزيع الموحد للخلايا عندما تم استخدام الكولاجين I قبل الجل كوسيلة للتوصيل. وأخيرا، نجت الخلايا المزروعة وتكاثرت على القصبة الهوائية غير الظهارية، مما يسلط الضوء على فعالية المفاعل الحيوي في الثقافة طويلة الأجل لأنسجة مجرى الهواء المزروعة بالخلايا.
الخطوة الحاسمة في بروتوكول إزالة الظهارة هي إنشاء طبقة محلول منظف رقيقة في تجويف القصبة الهوائية. في بروتوكولات إزالة الخلايا الحالية ، يتم استخدام دورات متعددة من المواد الكيميائية والإنزيمات على مدى فترة طويلة ، مما يقلل من عدد ألياف الكولاجين ، والجليكوزامينوغليكان (GAGs) ، والبروتيوغليكان ، والخلايا الغضروفية ، مما يعرض للخطر الخصائص البيولوجية والميكانيكية الحيوية لسقالة مجرى الهواء19،20،21. من ناحية أخرى ، يوفر ECM إشارات كيميائية حيوية وميكانيكية وبيئات مادية مناسبة للبقاء على قيد الحياة والانتشار والتمايز بين الخلايا الخارجية المزروعة22,23. تستخدم طريقة ترسيب الأغشية الرقيقة الموصوفة في هذه الدراسة كمية صغيرة من المنظفات (أقل من 50 ميكرولتر) لاستئصال الظهارة مع السماح بالحفاظ على طبقة الأنسجة الأساسية والمكونات الخلوية تحت الظهارية. يعد الاهتزاز الميكانيكي للأنسجة المكشوفة للمنظفات الموضحة في هذه الدراسة إجراء مهما لأنه يسمح بانفصال وإزالة الخلايا المحللة. من الصعب غسل حطام الخلايا والخلايا المعطلة جزئيا الناتجة عن تعرض الظهارة للمنظفات فقط عن طريق غمر القصبة الهوائية بمحلول الغسيل. لذلك ، فإن اهتزاز القصبة الهوائية ميكانيكيا أثناء الغسيل يوفر قوى قص كافية لإزالة حطام الخلية من تجويف القصبة الهوائية.
بشكل عام ، يمكن أن يتأثر نهج بذر الخلايا القائم على ما قبل الهلام بسرعة التسليم ، ولزوجة ما قبل الجل (التي ترتبط ارتباطا مباشرا بتركيز ما قبل الهلام) ، والتوتر السطحي ، ووقت الهلام. على وجه الخصوص ، أثناء إعداد ما قبل الجل ، من الضروري الحفاظ على تركيز ما قبل الجل منخفضا بما يكفي لنقل ما قبل الجل المعلق بالخلايا في الأنابيب ومرتفعا بما يكفي للحفاظ على الخلايا على السطح العلوي للقصبة الهوائية. لذلك ، يوصى بشدة بالعثور على التركيز الأمثل لكل ما قبل الجل عن طريق اختبار تركيزات مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، مارس تقنية التسليم مثل سرعة التسليم مع خلايا أقل قيمة لضمان التسليم الناجح للهلام المسبق المحمل بالخلايا. علاوة على ذلك ، في حين استخدمنا MSCs كنموذج خلية لإثبات (i) توزيع الخلايا مع ما قبل الهلام كوسيلة توصيل و (ii) قدرة نظام المفاعل الحيوي على زراعة الخلايا المزروعة حديثا على تجويف القصبة الهوائية العارية ، فإن استخدام الخلايا الجذعية (على سبيل المثال ، الخلايا القاعدية) والخلايا الظهارية الأولية في مجرى الهواء في الدراسات المستقبلية يمكن أن يسمح بدراسة تمايز الخلايا وتجديد الخلايا الظهارية الوظيفية24 ، 25. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تشمل الدراسات المستقبلية إضافة واجهة هوائية سائلة (ALI) إلى النظام الأساسي الحالي لتوليد إجهاد قص يشبه الجسم الحي على الخلايا البذرية لتوليد ظهارة وظيفية. لإضافة ALI إلى الجهاز الحالي ، يمكن توصيل جهاز تهوية حيواني صغير بمدخل القصبة الهوائية لتهوية القصبة الهوائية. علاوة على ذلك ، لتحقيق ALI ، يمكن استخدام طريقة ترسيب الأغشية الرقيقة لغرس قابس سائل متوسط الثقافة في القصبة الهوائية المزروعة بالخلايا. يمكن تعديل سمك الفيلم السائل عن طريق تغيير سرعة قابس السائل26,27. يمكن بدء القابس بعد أن تلتصق الخلايا المزروعة حديثا وتنغمس بقوة على تجويف القصبة الهوائية.
بالإضافة إلى ذلك ، يعد نهج التصوير القائم على عدسة GRIN في الموقع المستخدم في هذا البروتوكول أمرا بالغ الأهمية لتأكيد فعالية إزالة الظهارة وتقييم جودة توزيع الخلايا المزروعة حديثا. على عكس طرق تحليل الأنسجة التقليدية ، مثل علم الأنسجة والتألق المناعي ، والتي تتطلب تشريح العينات من أنسجة القصبة الهوائية لتحليلها ، فإن منصة التصوير التي تم تطويرها في دراستنا تسمح بالمراقبة السريعة وغير المدمرة لتجويف مجرى الهواء أثناء إزالة الظهارة وتوصيل الخلايا. للحفاظ على تعقيم القصبة الهوائية أثناء التصوير في الموقع ، تأكد من تعقيم عدسة GRIN عن طريق مسحها بنسبة 70٪ IPA أو الإيثانول قبل إدخالها في تجويف القصبة الهوائية. علاوة على ذلك ، لتصوير الخلايا باستخدام عدسة GRIN ، يمكن تصنيف الخلايا (إما الخلايا الظهارية القصبية الذاتية المنشأ أو الخلايا المزروعة حديثا) بأصباغ فلورسنت مختلفة ذات أطوال موجية مختلفة للإثارة / الانبعاثات. للقيام بذلك ، تأكد من استخدام مولد ضوء الليزر المناسب لإثارة الخلايا ذات العلامات الفلورية ودمج عدسات المرشح المناسبة في المرآة ثنائية اللون فائقة الدقة ذات الحافتين.
على الرغم من حداثة وابتكار إزالة الظهارة ، وتوصيل الخلايا ، وطرق التصوير في الموقع ، فإن هذه الدراسة لها العديد من القيود. تنطبق طرق إزالة الظهارة وتوصيل الخلايا الموصوفة في هذه الدراسة على الشعب الهوائية الصغيرة (قطرها: أقل من 3-4 مم) حيث يكون التوتر السطحي هو المهيمن. يمكن أن يكون تشكيل قابس سائل وإنشاء طبقة رقيقة من محلول إزالة الظهارة أو تعليق ما قبل الهلام المحمل بالخلايا في الشعب الهوائية الأكبر ، مثل الخنازير والقصبة الهوائية البشرية ، أو الشعب الهوائية ، أمرا صعبا حيث يصبح التوتر السطحي ضئيلا مقارنة بالقوى الأخرى ، والجاذبية على وجه الخصوص. علاوة على ذلك ، باستخدام نهج ترسيب الأغشية الرقيقة وتعديل الوقت والتركيز ، تمكنا من استئصال الظهارة باستخدام منظف قوي (SDS) والحفاظ على طبقة الأنسجة الأساسية. ومع ذلك، في الدراسات المستقبلية، يمكن اختبار منظفات إزالة الخلايا الأكثر اعتدالا، مثل 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS)28، أو محلول غير منظف، مثل هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)29، للحفاظ على مكونات ECM ودعم الخلايا المزروعة حديثا. علاوة على ذلك ، تقل شدة التألق للخلايا التي تحمل علامة CFSE بمرور الوقت بسبب انقسام الخلايا. في دراستنا ، أظهرت الصور الفلورية ل MSCs المستزرعة على القصبات الهوائية غير الظهارية لمدة 4 أيام انخفاضا كبيرا في كثافة التألق. من أجل المراقبة والتتبع المطولين للخلايا الخارجية المبذرة على سقالات الأنسجة ، سيكون من الضروري اتباع طرق مختلفة لوضع العلامات على الخلايا يمكن أن تسمح بوضع علامات الفلورسنت طويلة الأجل أو الدائمة على الخلايا.
نحن نتصور أن منصة المفاعل الحيوي الموجهة بالتصوير وبروتوكولات إزالة الخلايا وتوصيلها الموصوفة في هذا التقرير يمكن أن تسمح بإنشاء سقالات أنسجة مجرى الهواء غير الظهارية التي يمكن استخدامها لتوليد أنسجة مجرى الهواء المهندسة بيولوجيا. مثل هذه الممرات الهوائية في المختبر يمكن أن توفر نمذجة عالية الدقة في المختبر لأمراض مجرى الهواء البشري وفحص الأدوية. على سبيل المثال ، لإنشاء ظهارة مجرى الهواء الوظيفية ، يمكن أولا زرع الخلايا الجذعية القاعدية في مجرى الهواء على أنسجة مجرى الهواء غير الظهارية30. بعد ذلك ، يمكن إنشاء واجهة الهواء السائل (ALI) ، والتي تعتبر حاسمة لتمايز الخلايا الجذعية القاعدية إلى خلايا ظهارية مختلفة ، داخل القصبة الهوائية. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل نظام التصوير في الموقع واستخدامه لتصور الجهاز التنفسي للمرضى الذين يعانون من اضطرابات مجرى الهواء الرئوي بشكل فلوري. لاستخدامها سريريا لتقييم أنسجة مجرى الهواء في الموقع ، يمكن استبدال عدسة GRIN الصلبة بمجسات تصوير الألياف البصرية المرنة للتنقل في الشعب الهوائية. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على توزيع الخلايا بشكل متجانس داخل الجهاز التنفسي باستخدام بذر الخلايا القائم على الهيدروجيل يمكن أن توفر فرصة غير مسبوقة لاستبدال الظهارة التالفة أو المصابة في المرضى. على وجه الخصوص ، يمكن لنهج استبدال الخلايا الذي تم تطويره واستخدامه في هذه الدراسة تسريع العلاج القائم على الخلايا لعلاج اضطرابات الجهاز التنفسي ، مثل التليف الكيسي وخلل الحركة الهدبي الأولي ، وإصلاح رئتي المتبرع التي تم رفض زرعها بسبب أنسجة مجرى الهواء المصابة بجروح خطيرة31،32،33،34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل برنامج أبحاث مؤسسة جمعية الصدر الأمريكية ، ومؤسسة نيو جيرسي الصحية ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (جائزة CAREER 2143620) إلى J.K. ؛ والمعاهد الوطنية للصحة (P41 EB027062) إلى G.V.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 - D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
References
- Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
- Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).
- Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
- Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).
- De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).
- Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
- Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
- Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
- Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
- Planchard, D. Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , SDC Publications. (2022).
- Coward, C. A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , No Starch Press. (2019).
- Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
- Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
- Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).
- O'Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
- Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
- Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).
- O'Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).
- Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).
- Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
- Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).
