Summary
该协议描述了一种支持成像的生物反应器，该反应器允许从大鼠气管中选择性地去除内源性上皮，并在管腔表面均匀分布外源细胞，然后对细胞组织构建体进行长期 体外 培养。
Abstract
气道组织反复损伤可损害肺功能并引起慢性肺病，如慢性阻塞性肺病。再生医学和生物反应器技术的进步为生产实验室培养的功能性组织和器官结构体提供了机会，这些结构和结构体可用于筛选药物，模拟疾病和工程组织替代物。在这里，描述了一种小型化生物反应器与成像方式相结合，该成像方式允许在体外组织操作和培养期间原位可视化外植大鼠气管的内腔。使用这种生物反应器，该方案展示了成像引导的内源性细胞成分的选择性去除，同时保留了气道组织基质的内在生化特征和超微结构。此外，还显示了外源性细胞在去细胞化气道腔上的递送，均匀分布和随后的延长培养，并进行光学原位监测。结果强调，成像引导的生物反应器可能用于促进功能性体外气道组织的产生。
Introduction
呼吸道的腔内表面衬有一层上皮，主要由多纤毛，球杆，高脚杯和基底干细胞1，2组成。上皮层是肺的主要防御机制，充当生物物理屏障，保护下面的气道组织免受吸入病原体，颗粒物或化学气体的侵害。它 通过 多种机制保护气道组织，包括细胞间紧密连接形成，粘膜纤毛清除以及抗菌和抗氧化剂分泌3，4。气道上皮缺陷与破坏性呼吸系统疾病相关，例如慢性阻塞性肺疾病 （COPD）5、原发性睫状肌运动障碍 （PCD）6 和囊性纤维化 （CF）7。
肺芯片（LOC）技术的进步代表了研究人类肺部发育，模拟各种肺部疾病以及在严格监管 的体外 环境中开发新治疗材料的机会。例如，气道上皮和内皮可以在薄的多孔膜的相对侧培养，以模拟交换肺组织的气体，从而允许忠实的疾病建模和药物测试8。同样，已经创建了 体外 疾病模型来模拟 体外气道疾病，例如COPD9 和囊性纤维化10。然而，LOC装置的一个主要挑战是重述肺组织的复杂三维（3D）结构和动态细胞 - 组织基质 相互作用在体外11。
最近，已经开发了创新的组织工程方法，允许操作 离体 肺组织12。使用这些方法， 可以通过化学， 物理和机械处理从肺组织中去除内源性细胞来制备脱落的同种异体或异种组织移植物13。此外，去细胞化肺支架中保存的天然组织细胞外基质（ECM）为植入细胞附着，增殖和分化提供了物理模拟结构，生化和生物力学线索14，15。
在这里，报道了通过结合LOC和组织工程技术创建的成像引导的生物反应器系统，以允许 体外 组织操作和外植大鼠气管组织的培养。使用这种气道组织生物反应器，该方案证明选择性地去除内源性上皮细胞，而不会破坏气道组织的潜在上皮下细胞和生化成分。接下来，我们通过滴注细胞加载的胶原I预凝胶溶液，展示新接种的外源细胞（如间充质干细胞（MSCs））在剥脱的气道腔上的均匀分布和瞬时沉积。此外，通过使用集成到生物反应器中的微光学成像装置，还可以在上皮去除和内源性细胞递送过程中实现气管腔的可视化。此外，还表明气管和新植入的细胞可以在生物反应器中培养4天而不会出现明显的细胞死亡和组织降解。我们设想，本研究中使用的成像生物反应器平台，基于薄膜的去上皮化技术以及细胞递送方法可用于生成用于 体外 疾病建模和药物筛选的气道组织。
生物反应器包括一个矩形腔室，连接到可编程注射泵，灌注泵和呼吸机，用于培养分离的大鼠气管。生物反应器具有连接到气管或组织培养室的入口和出口，以分别向气管的内部和外部空间供应试剂（例如培养基）（图1）。定制的成像系统可用于在细胞水平上可视化 体外培养的大鼠气管内部（图2）。 通过 滴注基于洗涤剂的去细胞化溶液，然后进行振动辅助气道清洗，去除气管的内源性上皮（图3）。水凝胶溶液，如I型胶原蛋白，被用作在剥脱的气管腔内均匀和瞬时接种外源细胞的递送载体（图4）。用于构建生物反应器和进行实验的所有材料均在 材料表中提供。
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Protocol
下面的动物组织方案已获得史蒂文斯理工学院动物护理和使用委员会研究所（IACUC）的动物福利指南和法规的批准，并且符合美国国立卫生研究院（NIH）关于使用实验动物的指南。
1. 影像引导大鼠气管生物反应器的设计与搭建
- 大鼠气管生物反应器的设计与制造
- 使用 CAD 生成器软件创建具有相关设计（如入口、出口和组织培养室）的生物反应器腔室的计算机辅助设计 （CAD） 模型。对于本研究，请使用图1A-C中所示的几何形状和尺寸。CAD生成器软件的教程可以在16，17中找到。
- 将生成的CAD模型导出到计算机数控（CNC）控制器软件，并使用CNC机器切割聚四氟乙烯（PTFE）塑料以创建生物反应器室。CNC控制器软件的教程可以在18中找到。
注：除聚四氟乙烯外，其他塑料材料，如超高分子量聚乙烯（UHMWPE）和聚醚酰亚胺也可用于制造培养室。 - 对所有生物反应器组件（如鲁尔适配器和螺钉）进行灭菌，以避免污染设备中培养的组织和细胞。在清洁的环境中将所有生物反应器组件组装到主组织培养室中（图1A）。
- 基于梯度指数（GRIN）透镜的成像装置的构造
- 要创建 原位 成像设备，请将镜筒透镜插入可堆叠透镜管中，并使用挡圈将其固定。 通过 C接口适配器将镜头管组件安装到科学CMOS相机上。
- 使用微管理器等软件操作相机并获取照片和视频。对准位于很远距离（例如，距相机10米）的物体并调整管透镜和相机成像传感器之间的距离，直到所使用的成像软件在计算机屏幕上形成物体的聚焦图像。
- 使用光学笼系统组件（包括组装棒、螺纹笼板和笼状立方体）将滤光透镜安装在双刃超分辨率二向色镜上，并将激光器安装到设备上。
- 将物镜（20x）连接到设备。 通过 XY转换器将GRIN透镜（直径= 500μm）安装在镜管的远端。调整GRIN透镜和物镜之间的距离以形成聚焦的微观图像（图2A，B）。
2.大鼠气管的分离
- 在手术前，消毒手术区域并使用高压灭菌器在121°C下对手术器械进行灭菌30分钟。
- 将大鼠置于诱导室中，并使用小型汽化器麻醉动物，并输送2.5%异氟醚15分钟。通过踏板反射评估麻醉深度。为此，请用力捏住脚趾，并确认动物对脚趾捏合没有反应。
- 麻醉后，从腔室中取出异氟醚，并通过侧尾静脉施用1 mL 1，000单位/mL肝素，以防止肺血管系统中的血液凝固。
- 要对动物实施安乐死，将动物暴露于5%异氟醚中15-20分钟。将动物从诱导室中取出，并将其以面朝上仰卧位放在手术板上。
- 使用胶带固定腿部和尾巴，将大鼠固定在手术板上。接下来，使用70%异丙醇（IPA）对大鼠的颈部和胸部区域进行灭菌。通过在皮肤上用剪刀做一个3-4厘米的切口来打开腹腔。
注意：注意不要将剪刀的尖端朝上，从而将皮肤深深地切开。 - 使用剪刀切除下腔静脉（IVC），并通过放血确认安乐死。
- 通过在颈部中线使用剪刀切开切口并暴露气管来进行气管切开术。通过在胸壁上切开一个切口并在肋骨之间切开，以到达连接到肺部的气管末端，进行中线开胸术。接下来，使用二头肌和剪刀切开气管的两端并隔离气管。
- 分离后，使用20mL 1x磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）冲洗气管。使用灭菌的二头肌将气管转移到生物反应器。使用4-0缝合线将气管的两端固定在鲁尔连接器上。
- 使用可编程注射泵通过连接到生物反应器室的管道，以5 mL /min的流速将5 mL培养基输送到生物反应器室。
注意：培养基由Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM），重组人FGF碱性（0.1ng / mL），胎牛血清（FBS，10%）和抗生素抗真菌药（1%）组成。 - 用丙烯酸塑料盖和螺钉紧紧关闭生物反应器盖。用公头/母鲁尔塞关闭生物反应器腔室管道连接，以防止培养基在管道中流动。
3. 影像学引导下切除气管上皮
- 为了在明场或荧光中可视化气管腔，将生物反应器放在成像台上（图3A）。
- 通过用1x PBS稀释CFSE溶液，在CFSE细胞标记试剂盒中制备羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）溶液（浓度：100μM）。
注：原始CFSE溶液的浓度为10 mM（以二甲基亚砜（DMSO）为单位）。 - 通过注射泵通过 连接到气管 套管的管道以5 mL / min的流速注入500μL CFSE溶液。当 CFSE 溶液充满气管时，停止泵。等待10分钟，然后使用注射泵输注10mL 1x PBS以除去残留的未掺入的CFSE试剂，以洗涤气管腔。
- 通过连接到气管一端的鲁尔连接器将GRIN镜片的远端成像端插入气管。然后，轻轻地将GRIN镜片移动到气管内，直到气管表面聚焦，并以20倍放大倍率以明场或荧光拍摄照片和视频。
- 要在微管理器软件中捕获明场图像，请按照以下步骤操作。
- 通过笼状立方体引入白光以照亮气管腔。单击 “实时” 图标以实时显示气管的腔表面。使用 “成像设置”>曝光（毫秒） 将曝光时间更改为所需值。在这项研究中，使用的暴露时间在10 ms和50 ms的范围内。
- 要调整图像的对比度和亮度，请使用 直方图和强度缩放 窗口在交互式直方图显示的端点处移动黑白箭头。或者，使用 “自动拉伸 ”选项，该选项允许软件自动将亮度和对比度调整到最佳水平。
- 单击 “捕捉” 图标以冻结图像。然后，使用 “设置>将图像导出为”置换“ 以所需的格式保存图像。或者，使用 设置> ImageJ 将图像直接导出到 ImageJ 软件并保存。
- 要获得荧光模式下的照片和视频，请用CFSE专用激光（CFSE：激发波长：488nm，发射波长：515nm）通过笼状立方体照亮气管腔。按照步骤 3.5.2-3.5.3 获取映像。拍摄照片和视频后，轻轻地从气管中取出GRIN镜头。
- 如下所述进行去上皮化。
- 在蒸馏（DI）水中制备2%十二烷基硫酸钠（SDS）脱细胞溶液。通过使用注射泵通过气管套管，以6.3 mL / min的流速通过气管滴注50μLS，以在气管腔上产生洗涤剂溶液的薄膜。
- 使用公/母鲁尔插头关闭生物反应器的管道连接，并将生物反应器转移到培养箱。让SDS在37°C下在气管内停留10分钟。 通过气管滴注另一个50μLSS溶液并孵育10分钟。
- 通过注射泵用500μL 1x PBS以10mL / min的流速冲洗气管腔3x，去除裂解的上皮和SDS。将生物反应器放在摇床上，并以20 Hz频率和约0.3mm的位移幅度机械振动生物反应器，以物理方式促进SDS处理的上皮细胞从气管腔中分离。
注意：在这项研究中，振动台是通过组装低音炮扬声器，低音炮板放大器和加速度计定制的。计算机生成正弦波形， 并通过 放大器馈入振荡器，同时 通过 加速度计监测振荡器的响应（图3B）。此外，传统的振动器，如电磁和惯性振动器，可用于促进细胞的分离。为此，请将振动台的频率和加速度分别设置为20 Hz和0.5 g（相当于0.3 mm位移幅度）。 - 通过气管腔滴注500μL1x PBS两次，以除去残留的SDS和细胞碎片，同时气管进行机械振动。在上皮去除程序之后，通过使用GRIN透镜成像装置测量CFSE的强度来评估上皮层的清除率，如步骤3.6所示（图3C）。
4. 用于进一步分析的气管组织制备
- 为了确认上皮去除，进行进一步的组织分析，例如苏木精和曙红（H&E）染色，三色，五色素和免疫染色。为此，从生物反应器中取出气管，并将其固定在30mL的4%中性缓冲多聚甲醛溶液中，在4°C下在1x PBS（pH = 7.4）中过夜。
- 按照以下步骤脱水并嵌入固定气管组织。
- 固定后，用10mL 1x PBS洗涤气管组织，将气管转移到30mL 70%酒精中，并将其保持在4°C过夜。使用锋利的刀片将气管切成小圆柱形切片（~5 mm），并将组织切片插入组织包埋盒中（长x宽x高：4 cm x 2.5 cm x 0.5 cm）。在每个暗盒中保留两个气管部分。
- 在一系列异丙醇（IPA）溶液中使切片脱水 - 85%，90%，95%，100% - 在每个溶液的30mL中脱水1小时。在添加下一个解决方案之前，请先删除上一个解决方案。
- 完成后，将盒式瓶浸没在30mL清除剂（例如二甲苯）中2小时，以完全取代组织切片中的IPA溶液。在通风良好的通风橱中执行此步骤。
- 将盒式纤维浸入石蜡中2小时，然后将其在4°C下嵌入石蜡中过夜。接下来，使用用于H&E，三色，五色素和免疫染色的切片机装置将石蜡包埋的组织切成薄片（5-8μm）。
- 为了制备用于扫描电子显微镜（SEM）分析的组织，将气管固定在30mL的2.5%戊二醛溶液中，在4°C下在1x PBS（pH = 7.4）中过夜。然后，按照以下步骤使固定气管组织脱水以进行SEM。
- 固定后，用10毫升1x PBS冲洗气管组织。使用剪刀将气管组织纵向切割成小的半圆柱形切片（长度：~5 mm），并将组织切片插入盒中。
- 在一系列IPA溶液中使切片脱水 - 35%，50%，70%，85%，95%和100% - 在每个溶液的30mL中脱水10分钟。在添加下一个解决方案之前，请先删除上一个解决方案。
- 通过将组织浸没在以下溶液中来执行基于六甲基二硅氮烷（HMDS）的干燥方法：100%IPA：HMDS（2：1;v / v）10分钟，然后100%IPA：HMDS（1：2;v / v）10分钟，最后100%HMDS过夜。
注意：HMDS是有毒的。在所有干燥步骤中，在通风橱下工作。 - 从HMDS溶液中取出组织，并使其在通风橱下干燥1小时。使用碳双面导电胶带或银导电浆料将部分安装在铝针桩上，以进行SEM成像。
5. 外源性细胞均匀分布到剥脱的气管腔
- 使用步骤3中的方案制备去上皮化大鼠气管。在37°C水浴中解冻冷冻间充质干细胞（MSCs）30秒。
注意：在这项研究中，我们使用间充质干细胞（MSCs）作为模型细胞，以显示外源性细胞在去上皮化气管上的分布。理想情况下，原代气道上皮细胞、基底细胞或诱导人多能细胞 （iPSC） 可用于上皮再生目的。 - 用血细胞计数器计数细胞并制备浓度为5 x 106 个细胞/ mL的细胞溶液。通过在室温下用2mL CFSE溶液（浓度：100μM）孵育细胞15分钟，荧光地标记细胞。用5mL 1x PBS冲洗细胞3x，并将细胞重悬于新鲜培养基中，最终浓度为3 x 107 个细胞/ mL。
- 制备水凝胶预凝胶溶液作为细胞递送载体。对于这项研究，使用胶原蛋白I作为MSCs细胞的递送载体，并按照制造商的说明准备预凝胶。例如，要获得3.6mg / mL胶原蛋白预凝胶，在1.5 mL无菌管中将一份冷藏的中和溶液与九份大鼠尾巴胶原蛋白混合。然后，轻轻地上下移液混合物以获得足够的混合。
注意：根据研究和用户需求，可以使用其他生物相容性水凝胶代替胶原蛋白I。 - 制备水凝胶溶液后，将细胞快速加入具有所需浓度（例如，5 x 106 细胞/ mL）的溶液中。为了获得均匀的细胞 - 水凝胶混合物，通过用微量移液管轻轻移液来混合细胞和凝胶溶液。
- 通过鲁尔连接器将生物反应器内气管的一端连接到可编程注射泵上。使用注射泵以5 mL / min的流速将5 mL新鲜培养基在37°C下输送到生物反应器室中以覆盖气管的外表面。
- 使用注射泵以5 mL / min的流速将10μL细胞 - 水凝胶混合物推注到生物反应器内的去上皮化气管中，以在气管腔上产生细胞水凝胶层（图4）。
- 细胞注射后，将生物反应器置于37°C和5%CO2 的无菌细胞培养箱中进行凝胶化。对于胶原蛋白I，凝胶化发生在30分钟内。
- 为了可视化植入细胞的分布，通过用70%IPA或乙醇擦拭GRIN晶状体对GRIN镜片进行灭菌，并将生物反应器放在成像台上。根据需要以明场和荧光模式拍摄照片和视频。
- 细胞接种30分钟后，使用注射泵以1mL / min的流速将1mL培养基注入气管腔中。
- 在37°C的培养箱中在生物反应器内培养细胞接种的气管，持续所需的时间。对于长期培养，每24小时刷新气管腔和生物反应器室中的培养基。在细胞培养过程中，保持管腔内的培养基不变并每24小时更换一次，同时气管外的培养基 通过 5 mL / min的单向流动连续灌注。
- 在培养细胞一段时间后（例如，在本研究中为1天和4天），从生物反应器中取出气管。在 体外 培养的第1天和第4天，使用剪刀将气管纵向切割成两个半圆柱形切片（即上部和下部），以暴露内表面以监测细胞生长和计算细胞密度。使用传统的荧光显微镜来观察内表面上的细胞。
- 要使用 Micro-Manager 软件获取映像，请执行步骤 3.5 和 3.6。使用荧光素异硫氰酸酯（FITC）过滤器在荧光模式下可视化CFSE标记的细胞。使用ImageJ软件分析荧光显微镜拍摄的图像并计算上部和下部的细胞密度。要计算细胞数量和细胞密度，请按照以下步骤操作。
- 在 ImageJ 软件中打开图像，并使用图像 >类型 > 16 位）将图像转换为二进制图像（16 位）。使用比例尺使用 “分析”>“设置比例”设置图像比例。
- 调整图像的阈值以突出显示要计数的单元格的结构。使用 图像>调整>阈值。使用 “分析>分析粒子 ”来计算细胞的数量。通过将细胞数除以图像的表面积来计算细胞的密度。
- 为了评估细胞接种后的活力，使用细胞活力试剂盒。对于本研究，将气管组织和细胞在37°C的生物反应器中孵育6小时，并在室温下用4mM钙黄绿素-AM和2mM乙锭同型二聚体-1在1mL 1x PBS中染色细胞15分钟。
- 用1x PBS冲洗后，使用荧光显微镜观察细胞。使用步骤5.12中描述的步骤计算活细胞和死细胞。计算细胞活力为每总细胞（活细胞和死细胞）的活细胞（用钙黄绿素-AM染色）的百分比。
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Representative Results
基于GRIN晶状体 的原位 成像方式可以原 位 显示气管内腔（图5A）。使用这种成像方法，可以获得天然和去上皮化气管的明场和荧光图像（图5B，C）。在CFSE标记之前，没有从天然气管中观察到荧光信号（图5Bii）。然而，当用CFSE染料标记气管上皮时，在整个上皮中观察到均匀的荧光信号（绿色）（图5Ci）。 通过 SDS和振动辅助气道冲洗进行去上皮化后，荧光信号的强度显着降低（图5Cii），表明上皮消融。
去上皮化气管的H&E图像显示从气管腔中去除假分层上皮，并保留下层组织层中的细胞和ECM微观结构（图6A）。此外，五色（图6B）和三色染色（图6C）证实了气管组织结构和ECM组分（如胶原蛋白和蛋白聚糖）的维持。此外，上皮细胞的免疫荧光（上皮细胞粘附分子，EpCAM; 图 6D）和胶原I（图6E）显示上皮完全去除并保留上皮下组织内的胶原I。天然气管的SEM成像表明，天然大鼠气管的腔表面主要填充多纤毛细胞和高脚杯细胞。另一方面，去上皮化气管腔的SEM图像显示基底膜暴露，如ECM纤维的网状网络和上皮细胞的缺失所示（图6F）。
使用去上皮化的大鼠气管和荧光标记的细胞，我们研究了将水凝胶作为细胞递送载体是否可以实现到去上皮化气管腔上的均匀细胞分布（图7A，B）。在这项研究中，间充质干细胞（MSCs）被用作细胞递送和培养研究的模型细胞。如方案（步骤5）所述，我们将MSC加载的胶原I预凝胶滴入去上皮化的大鼠气管中，并使用GRIN晶状体成像系统监测气管腔上细胞的分布。作为对照实验，我们将MSCs悬浮在培养基中，将载有细胞的培养基注入气管中，并目视检查细胞的分布。 原位 成像结果表明， 通过 水凝胶递送的荧光标记细胞比通过 培养基 接种的细胞更均匀地粘附在管腔中（图7B）。然后，我们测试了细胞递送前后的细胞活力，以评估由于细胞输注过程中的剪切应力而导致的潜在细胞损伤和死亡。结果表明，细胞活力不受细胞递送程序的显着影响，因为超过90%的细胞保持活力（图7C）。
此外，我们将细胞接种的气管培养4天。 通过 胶原和培养基（对照）接种的细胞在去上皮化的气管腔表面增殖，如气管腔上半部分和下半部分表达CFSE的细胞数量随时间增加所示（图7D）。值得注意的是，在胶原水凝胶递送组中，上下腔之间细胞密度的差异小于对照组，表明 通过 水凝胶的细胞递送促进了整个气管腔内均匀的细胞分布。
图 1：气管生物反应器的三维 （3D） 计算机绘图。 （A） （i） 侧视图，（ii） 顶视图。（B）生物反应器腔室的尺寸。（C）用螺钉切割透明丙烯酸塑料板并附着在主室的顶部。单位 = 毫米;R = 半径。 请点击此处查看此图的大图。
图2：用于大鼠气管 原位 可视化的定制微纤维成像。 （A） （i）光路的成像设置分量示意图。缩写：C =相机，TL =管透镜，F=滤光片，DM=二向色镜，OL=物镜;（ii）成像设置组件的照片，显示成像探头（GRIN镜头）插入生物反应器的鲁尔连接器中。（B）示意图显示GRIN透镜与生物反应器集成。（C）显示成像探针的照片用于可视化生物反应器内的气管。 请点击此处查看此图的大图。
图3：用于大鼠气管去上皮化的平台（A）照片显示了用于去上皮化和原位光纤成像的实验装置。（B）图表显示了用于促进上皮去除的定制电磁振动器的组件和组件。ω：频率，a：振幅（C）示意图，示意图，显示大鼠气管去上皮化程序的工作流程。PBS = 磷酸盐缓冲盐水。请点击此处查看此图的大图。
图4：使用水凝胶将外源性细胞递送到去上皮化的大鼠气管中。 示意图显示用作输送载体的水凝胶溶液，以局部将细胞沉积到去上皮化大鼠气管的内腔上。 请点击此处查看此图的大图。
图5：去上皮化气管 的原位 成像。 （A）照片显示气管腔的荧光成像，而CFSE标记的上皮通过GRIN透镜用488nm蓝色激光激发。（B）（i）上皮标记前气管腔的明场和（ii）荧光图像。（C）（i）天然和（ii）去上皮化气管（De-Epi气管）的荧光图像，而上皮用CFSE荧光染料标记。 请点击此处查看此图的大图。
图6：天然和去上皮化大鼠气管的组织学，免疫荧光和SEM分析。 （A） H&E染色。（B）五色染色，其中紫色是细胞质，蓝色是细胞核，绿色是蛋白聚糖（例如粘蛋白），黄色是胶原纤维。（C）三色染色，其中粉红色是细胞质，深蓝色是细胞核，蓝色是胶原蛋白。天然和去上皮化气管的荧光图像。（D）EpCAM和（E）胶原I.箭头显示气管腔的表面。（F）气管腔的SEM显微照片。 请点击此处查看此图的大图。
图7：气管腔中外源性MSCs的局部沉积。 （A）（i）明场和（ii）去上皮化气管的荧光图像。（B）去上皮化气管腔的荧光图像，当它被接种有（i）PBS和（ii）胶原I预凝胶时。当预凝胶胶原用作细胞的递送载体时，细胞均匀分布到气管腔上。（C）（i）荧光图像和（ii）通过凝胶前胶原蛋白递送6小时之前和之后定量细胞的活力。n：样本数。遵循方案的步骤5.1和5.17来评估细胞的活力。（D）在细胞接种和培养后（i）1天和（ii）4天后测量细胞接种密度。通过将细胞数量除以检查的表面积来计算细胞密度。所有值均表示均值±标准差。采用单因素方差分析（方差分析）确定组间统计学上显著差异， p <0.05均为显著。缩写：CM =培养基，C =胶原蛋白。*p < 0.05。**p < 0.01。ns：不显著。上下表面之间没有显着差异（ns）意味着整个气管周长的细胞分布均匀。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在这项工作中，我们创建了一种成像引导的生物反应器，可以允许（i）在细胞去除和外源性细胞递送后 原位 监测气管腔，以及（ii）细胞接种气管组织的长期 体外 培养。使用这种定制的生物反应器，我们证明了（i）使用洗涤剂和振动辅助气道洗涤从气管腔中选择性地去除内源性上皮细胞，以及（ii）使用细胞负载的胶原I预凝胶将外源性细胞均匀分布到脱毛气管腔表面上。此外，基于GRIN晶状体的成像方式证实了 原位去除上皮。此外，通过进一步的分析，包括H&E，三色，五色，免疫荧光染色和SEM，我们确认了上皮的去除以及下层组织层结构和组分的维持。此外，基于GRIN晶状体的新型外源性MSCs成像显示，当胶原I预凝胶用作递送载体时，细胞分布均匀。最后，植入的细胞存活并在去上皮化的气管上增殖，突出了生物反应器在细胞接种气道组织长期培养中的功效。
去上皮化方案的关键步骤是在气管腔中创建薄的洗涤剂溶液层。在目前的脱细胞化方案中，化学品和酶的多个循环在很长一段时间内被使用，减少了胶原纤维，糖胺聚糖（GAGs），蛋白聚糖和软骨细胞的数量，损害了气道支架的生物和生物力学特性19，20，21。另一方面，ECM为植入外源细胞22，23的存活，增殖和分化提供了生化和机械线索以及合适的物理环境。本研究中描述的薄膜沉积方法使用少量洗涤剂（小于50μL）进行上皮消融，同时允许保留下层组织层和上皮下细胞组分。本研究中证明的洗涤剂暴露组织的机械振动是一个重要的过程，因为它允许裂解细胞的分离和清除。由于上皮暴露于洗涤剂而导致的细胞碎片和部分破坏的细胞具有挑战性，只能通过用洗涤液淹没气管来洗涤。因此，在洗涤过程中机械振动气管可提供足够的剪切力以清除气管腔中的细胞碎片。
通常，基于预凝胶的细胞接种方法可能受到递送速度，预凝胶粘度（与预凝胶浓度直接相关），表面张力和凝胶化时间的影响。特别是，在预凝胶制备期间，必须将预凝胶浓度保持在足够低的水平以在管中运输细胞悬浮的预凝胶，并且保持足够高以维持气管上表面的细胞。因此，强烈建议通过测试各种浓度来找到每种预凝胶的最佳浓度。此外，使用不太珍贵的细胞练习递送技术，例如递送速度，以确保细胞上样预凝胶的成功递送。此外，虽然我们使用MSCs作为细胞模型来证明（i）以预凝胶作为递送载体的细胞的分布，以及（ii）生物反应器系统在脱皮的气管腔上培养新接种细胞的能力，但在未来的研究中使用干细胞（例如基底细胞）和原代气道上皮细胞可以研究细胞分化和功能性上皮细胞再生24，25.此外，未来的研究可以包括在当前平台上添加气液界面（ALI）， 以在接种细胞上产生体内样剪切应力，以产生功能性上皮。为了将ALI添加到当前设备中，可以将小动物呼吸机连接到气管入口以通气气。而且，为了实现ALI，可以利用薄膜沉积方法将培养基液体塞子滴入细胞接种的气管中。液膜的厚度可以通过改变液塞速度26，27来调节。在新接种的细胞粘附并牢固地移植到气管腔上后，可以启动塞子。
此外，该方案中使用的基于GRIN晶状体的原位 成像方法对于确认去上皮化的功效和评估新接种细胞的分布质量至关重要。与传统的组织分析方法（如组织学和免疫荧光）不同，这些方法需要从气管组织中解剖样品进行分析，而我们研究中开发的成像平台允许在去上皮化和细胞递送过程中快速无损地监测气道腔。为了 在原位 成像期间保持气管灭菌，请确保在将GRIN晶状体引入气管腔之前用70%的IPA或乙醇擦拭来消毒GRIN晶状体。此外，为了使用GRIN晶状体对细胞进行成像，可以用具有不同激发/发射波长的各种荧光染料标记细胞（内源性气管上皮细胞或新植入的细胞）。为此，请确保使用适当的激光发生器来激发荧光标记的细胞，并将正确的滤光透镜集成到双刃超分辨率二向色镜中。
尽管去上皮化，细胞递送和 原位 成像方法具有新颖性和创新性，但该研究有几个局限性。本研究中描述的去上皮化和细胞递送方法适用于表面张力占主导地位的小气道（直径：小于3-4mm）。在较大的气道（例如猪和人气管或支气管）中形成液体塞并形成去上皮化溶液或细胞加载的预凝胶悬浮液的薄膜可能具有挑战性，因为与其他力（特别是重力）相比，表面张力变得微不足道。此外，通过使用薄膜沉积方法并调节时间和浓度，我们能够用强洗涤剂（SDS）消融上皮并保留下层组织层。然而，在未来的研究中，可以测试更温和的去细胞化洗涤剂，例如3-[（3-胆酰胺丙基）-二甲基氨硫基]-1-丙烷磺酸酯（CHAPS）28或非洗涤剂溶液，例如氢氧化钠（NaOH）29，用于保存ECM成分和支持新植入的细胞。此外，由于细胞的分裂，CFSE标记细胞的荧光强度随着时间的推移而降低。在我们的研究中，在去上皮化气管上培养4天的MSCs的荧光图像显示其荧光强度显着降低。为了长期监测和跟踪接种在组织支架上的外源性细胞，需要不同的细胞标记方法，可以允许细胞的长期或永久荧光标记。
我们设想，本报告中描述的成像引导的生物反应器平台和细胞去除和递送方案可以允许创建去上皮化的气道组织支架，可用于生成生物工程气道组织。这种 体外 气道可以提供人类气道疾病的高保真 体外 建模和药物筛选。例如，为了建立功能性的气道上皮，气道基底干细胞可以首先植入去上皮化的气道组织30上。然后，气管内可以产生气液界面（ALI），这对于基底干细胞分化成各种上皮细胞至关重要。此外， 原位 成像系统可以修改并用于荧光可视化肺气道疾病患者的呼吸道。为了 在临床上用于原位评估气道组织，刚性GRIN透镜可以用柔性光纤成像探头代替，以导航气道。此外，使用基于水凝胶的细胞接种均匀分布呼吸道内细胞的能力可以提供前所未有的机会来替换患者中受损或受伤的上皮。特别是，本研究中开发和使用的细胞替代方法可以加速基于细胞的治疗，用于治疗呼吸系统疾病，例如囊性纤维化和原发性纤毛运动障碍，并修复由于气道组织严重损伤而拒绝移植的供体肺31，32，33，34。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项研究得到了美国胸科学会基金会研究计划，新泽西州健康基金会和国家科学基金会（CAREER奖2143620）的部分支持。和美国国立卫生研究院（P41 EB027062）至G.V.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× PBS | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10-010-031 | |
| 3-port connector | World Precision Instruments | 14048-20 | |
| 4-port connector | World Precision Instruments | 14047-10 | |
| Accelerometer | STMicroelectronics | IIS3DWBTR | |
| Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Aluminum pin stub | TED PELLA | 16111 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Assembly rod | Thorlabs | ER1 | |
| Button head screws | McMaster-Carr | 91255A274 | |
| Cage cube | Thorlabs | C4W | |
| Carbon double-sided conductive tape | TED PELLA | 16073 | |
| CFSE labelling kit | Abcam | ab113853 | |
| Citrisolv (clearing agent) | Decon | 1061 | |
| C-mount adapter | Thorlabs | SM1A9 | |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5153 | |
| Conductive liquid silver paint | TED PELLA | 16034 | |
| Dichroic mirror | Semrock | DI03-R488 | Reflected laser wavelengths: 473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11965118 | |
| Female luer bulkhead to hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45501-30 | |
| Female luer to tubing barb | Cole-Parmer | EW-45508-03 | |
| Female to male luer connector | Cole-Parmer | ZY-45508-80 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Filter lens | Chroma Technology Corp | ET535/50m | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse E1000 - D | |
| Fusion 360 | Autodesk | ||
| Hex nut | McMaster-Carr | 91813A160 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Fisher Scientifc | AC120585000 | |
| Imaging fiber | SELFOC, NSG group | GRIN lens | |
| Laser | Opto Engine | MDL-D-488-150mW | |
| Lens tubes | Thorlabs | SM1L40 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| MACH 3 CNC Control Software | Newfangled Solutions | ||
| Objective lens | Olympus | UCPLFLN20X | |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | L/S standard digital pump system | |
| Recombinant human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Retaining ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Scientific CMOS camera | PCO Panda | PCO Panda 4.2 | |
| Sodium dodecyl sulfate | VWR | 97064-472 | |
| Solidworks (2019) | Dassault Systèmes | ||
| Stackable lens tube | Thorlabs | SM1L10 | |
| Subwoofer plate amplifier | Dayton Audio | SPA250DSP | |
| Subwoofer speaker | Dayton Audio | RSS21OHO-4 | Diaphragm diameter: 21 cm |
| Syringe Pump | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Threaded cage plate | Thorlabs | CP33 | |
| Threaded luer adapter | Cole-Parmer | EW-45513-81 | |
| Tube lens | Thorlabs | AC254-150-A-ML | |
| Tygon Tubing | Cole-Parmer | 13-200-110 | |
| XY Translator | Thorlabs | CXY1 |
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