Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Billeddirigeret bioreaktor til generering af biomanirigeret luftvejsvæv

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63544
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 4, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Stevens Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 3Department of Cell Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 4Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University

Summary

Protokollen beskriver en billeddannelsesaktiveret bioreaktor, der muliggør selektiv fjernelse af det endogene epitel fra rotteluftrøret og homogen fordeling af eksogene celler på lumenoverfladen efterfulgt af langvarig in vitro-kultur af cellevævskonstruktionen.

Abstract

Gentagen skade på luftvejsvæv kan forringe lungefunktionen og forårsage kronisk lungesygdom, såsom kronisk obstruktiv lungesygdom. Fremskridt inden for regenerativ medicin og bioreaktorteknologier giver mulighed for at producere laboratoriedyrkede funktionelle vævs- og organkonstruktioner, der kan bruges til at screene lægemidler, modellere sygdomme og konstruere vævsudskiftninger. Her beskrives en miniaturiseret bioreaktor kombineret med en billeddannelsesmodalitet, der muliggør in situ-visualisering af det indre lumen i eksplanteret rottetrachea under in vitro-vævsmanipulation og -kultur. Ved hjælp af denne bioreaktor demonstrerer protokollen billedstyret selektiv fjernelse af endogene cellulære komponenter, samtidig med at de iboende biokemiske egenskaber og ultrastruktur af luftvejsvævsmatrixen bevares. Desuden vises levering, ensartet fordeling og efterfølgende langvarig dyrkning af eksogene celler på det decellulariserede luftvejslumen med optisk overvågning in situ . Resultaterne fremhæver, at den billeddiagnostiske bioreaktor potentielt kan bruges til at lette dannelsen af funktionelle in vitro-luftvejsvæv .

Introduction

Den lysende overflade af luftvejene er foret med et lag af epitel, der hovedsageligt består af multicilierede, klub-, bæger- og basale stamceller 1,2. Epitellaget tjener som en primær forsvarsmekanisme i lungen, der fungerer som en biofysisk barriere, der beskytter det underliggende luftvejsvæv mod indåndede patogener, partikler eller kemiske gasser. Det beskytter luftvejsvævet via flere mekanismer, herunder intercellulær tæt krydsdannelse, mucociliær clearance og antimikrobiel og antioxidantsekretion 3,4. Det defekte luftvejsepitel er forbundet med ødelæggende luftvejssygdomme, såsom kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL)5, primær ciliær dyskinesi (PCD)6 og cystisk fibrose (CF)7.

Fremskridt inden for lung-on-chip (LOC) teknologi repræsenterer en mulighed for at studere menneskelig lungeudvikling, modellere forskellige lungesygdomme og udvikle nye terapeutiske materialer i tæt regulerede in vitro-miljøer . For eksempel kan luftvejsepitel og endotel dyrkes på modsatte sider af en tynd, porøs membran for at efterligne gasudvekslingen af lungevæv, hvilket muliggør trofast sygdomsmodellering og lægemiddeltest8. Tilsvarende er der skabt in vitro-sygdomsmodeller til modellering af luftvejssygdomme in vitro, såsom KOL9 og cystisk fibrose10. En stor udfordring ved LOC-enheder er imidlertid at rekapitulere den komplekse tredimensionelle (3D) arkitektur i lungevævet og dynamiske celle-vævsmatrixinteraktioner in vitro11.

For nylig er der udviklet innovative vævstekniske metoder, der muliggør manipulation af ex vivo lungevæv12. Ved hjælp af disse metoder kan denuderede allogene eller xenogene vævstransplantater fremstilles ved at fjerne de endogene celler fra lungevævet via kemiske, fysiske og mekaniske behandlinger13. Derudover giver den bevarede indfødte vævs ekstracellulære matrix (ECM) i de decellulariserede lungestilladser de fysio-mimetiske strukturelle, biokemiske og biomekaniske signaler for implanterede celler til at vedhæfte, proliferere og differentiere14,15.

Her rapporteres et billeddiagnostisk styret bioreaktorsystem skabt ved at kombinere LOC og vævstekniske teknologier for at muliggøre in vitro-vævsmanipulation og dyrkning af udplantet rottetrachealvæv. Ved hjælp af denne luftvejsvævsbioreaktor demonstrerer protokollen selektiv fjernelse af de endogene epitelceller uden at forstyrre de underliggende subepitelcellulære og biokemiske komponenter i luftvejsvævet. Vi viser derefter den homogene fordeling og øjeblikkelige aflejring af de nyligt såede eksogene celler, såsom mesenkymale stamceller (MSC'er), på det denuderede luftvejslumen ved at indgyde det cellebelastede kollagen I pre-gel-opløsning. Derudover udføres visualiseringen af luftrørets lumen under epitelfjernelse og endogen cellelevering ved hjælp af den mikrooptiske billeddannelsesenhed, der er integreret i bioreaktoren. Endvidere er det vist, at luftrøret og nyligt implanterede celler kan dyrkes i bioreaktoren uden mærkbar celledød og vævsnedbrydning i 4 dage. Vi forestiller os, at den billeddannende bioreaktorplatform, den tyndfilmsbaserede de-epithelialiseringsteknik og celleleveringsmetoden, der anvendes i denne undersøgelse, kan være nyttige til generering af luftvejsvæv til in vitro-sygdomsmodellering og lægemiddelscreening.

Bioreaktoren omfatter et rektangulært kammer forbundet til en programmerbar sprøjtepumpe, perfusionspumpe og ventilator til dyrkning af isoleret rottetrachea. Bioreaktoren har indløb og udløb, der er forbundet med luftrøret eller vævskulturkammeret for separat at levere reagenser (f.eks. Kulturmedier) til luftrørets indre og ydre rum (figur 1). Et specialbygget billeddannelsessystem kan bruges til at visualisere det indre af den in vitro-dyrkede rottetrachea på celleniveau (figur 2). Luftrørets endogene epitel fjernes via indånding af en vaskemiddelbaseret decellulariseringsopløsning efterfulgt af vibrationsassisteret luftvejsvask (figur 3). Hydrogelopløsning, såsom type I-kollagen, anvendes som et leveringsmiddel til såning af eksogene celler ensartet og øjeblikkeligt over det denuderede luftrørslumen (figur 4). Alle de materialer, der bruges til at konstruere bioreaktoren og udføre eksperimenterne, findes i materialetabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nedenstående dyrevævsprotokol er godkendt af dyrevelfærdsretningslinjen og -reglerne fra Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Stevens Institute of Technology, og den overholder National Institutes of Health (NIH) retningslinjer for brugen af forsøgsdyr.

1. Design og konstruktion af billedstyret rottetrachea bioreaktor

  1. Design og fremstilling af rotteluftrørsbioreaktor
    1. Opret en computerstøttet designmodel (CAD) af bioreaktorkammeret med relevant design, såsom indløb, udløb og vævskulturkammer, ved hjælp af CAD-generatorsoftware. Til denne undersøgelse skal du bruge geometrien og dimensionerne i figur 1A-C. Vejledningen om CAD-generatorsoftware findes i16,17.
    2. Eksporter den genererede CAD-model til en CNC-styringssoftware (Computer Numerical Control), og skær polytetrafluorethylenplasten (PTFE) ved hjælp af en CNC-maskine til at skabe bioreaktorkammeret. Vejledningen til CNC-controllersoftwaren findes i18.
      BEMÆRK: Ud over PTFE kan andre plastmaterialer, såsom polyethylen med ultrahøj molekylvægt (UHMWPE) og polyetherimid, bruges til at fremstille kulturkammeret.
    3. Steriliser alle bioreaktorkomponenter, såsom Luer-adaptere og skruer, for at undgå forurening af væv og celler, der dyrkes i enheden. Saml alle bioreaktorkomponenter til hovedvævskulturkammeret i et rent miljø (figur 1A).
  2. Konstruktion af gradientindeks (GRIN) linsebaseret billeddannelsesenhed
    1. For at oprette in situ-billeddannelsesenheden skal du indsætte en rørlinse i et stabelbart linserør og fastgøre det ved hjælp af en holdering. Monter objektivrørsenheden på et videnskabeligt CMOS-kamera via en C-mount-adapter.
    2. Brug software, såsom Micro-Manager, til at betjene kameraet og erhverve fotos og videoer. Ret mod et objekt, der er placeret på lang afstand (f.eks. 10 m fra kameraet), og juster afstanden mellem rørlinsen og billedsensoren på kameraet, indtil der dannes et fokuseret billede af objektet på computerskærmen af den billedbehandlingssoftware, der anvendes.
    3. Monter et filterobjektiv på et dobbeltkantet dichroisk spejl med superopløsning og en laser på enheden ved hjælp af optiske bursystemkomponenter, herunder monteringsstang, gevindburplade og burterning.
    4. Tilslut objektivobjektivet (20x) til enheden. Monter et GRIN-objektiv (diameter = 500 μm) i den distale ende af objektivrøret via XY-oversætteren. Juster afstanden mellem GRIN-objektivet og objektivobjektivet for at danne fokuserede mikroskopiske billeder (figur 2A,B).

2. Isolering af rotte luftrøret

  1. Desinficer det kirurgiske område og steriliser de kirurgiske instrumenter ved hjælp af en autoklave ved 121 ° C i 30 minutter før operationen.
  2. Placer en rotte i induktionskammeret og levér 2,5% isofluran i 15 minutter ved hjælp af en lille fordamper til at bide dyret. Vurder anæstesidybden ved pedalrefleks. For at gøre dette skal du klemme tåen fast og bekræfte, at dyret ikke reagerer på tåklemmet.
  3. Efter anæstesi skal isofluranen fjernes fra kammeret og administreres 1 ml 1.000 enhed / ml heparin gennem den laterale halevene for at forhindre blodkoagulation i lungevaskulaturen.
  4. For at aflive dyret skal du udsætte dyret for 5% isofluran i yderligere 15-20 minutter. Fjern dyret fra induktionskammeret og læg det på operationsbrættet i en liggende stilling med forsiden op.
  5. Fastgør rotten på operationsbrættet ved at immobilisere ben og hale ved hjælp af tape. Steriliser derefter rottens nakke- og brystområder ved hjælp af 70% isopropylalkohol (IPA). Åbn bukhulen ved at lave et snit på 3-4 cm ved hjælp af en saks i huden.
    BEMÆRK: Pas på ikke at skære huden dybt ved at pege saksens spidser opad.
  6. Transektér den ringere vena cava (IVC) ved hjælp af saksen og bekræft eutanasi ved ekssanguination.
  7. Udfør trakeotomien ved at lave et snit ved hjælp af en saks i nakkens midterlinje og udsætte luftrøret. Udfør midline thoracotomi ved at lave et snit i brystvæggen og skære mellem ribbenene for at nå luftrørenden forbundet med lungen. Brug derefter en bicep og en saks til at skære begge ender af luftrøret og isolere luftrøret.
  8. Efter isolering skylles luftrøret med 20 ml 1x fosfatbufret saltvand (1x PBS). Overfør luftrøret til bioreaktoren ved hjælp af steriliserede biceps. Fastgør de to ender af luftrøret til Luer-stikket ved hjælp af en 4-0 suturtråd.
  9. Levér 5 ml dyrkningsmedium til bioreaktorkammeret ved hjælp af den programmerbare sprøjtepumpe gennem slangen, der er forbundet med bioreaktorkammeret, med en strømningshastighed på 5 ml/min.
    BEMÆRK: Kulturmediet består af Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM), rekombinant human fGF-basisk (0,1 ng/ ml), føtalt kvægserum (FBS, 10%) og antibiotika-antimykotisk (1%).
  10. Tæt tæt på bioreaktorlåget med akrylplastlåget og skruerne. Luk bioreaktorkammerets slangeforbindelser med luerpropperne til han/hun for at forhindre strømmen af kulturmediet i slangen.

3. Billeddannelsesstyret fjernelse af luftrørepitelet

  1. For at visualisere luftrørets lumen enten i lysfelt eller fluorescerende skal du placere bioreaktoren på billeddannelsestrinnet (figur 3A).
  2. Carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) opløsning (koncentration: 100 μM) fremstilles i CFSE-cellemærkningssættet ved at fortynde CFSE-opløsningen med 1x PBS.
    BEMÆRK: Koncentrationen af den oprindelige CFSE-opløsning er 10 mM (i dimethylsulfoxid (DMSO)).
  3. 500 μL af CFSE-opløsningen tilføres gennem luftrøret via sprøjtepumpen gennem slangen, der er forbundet med luftrørskyllen, med en strømningshastighed på 5 ml/min. Stop pumpen, når CFSE-opløsningen fylder luftrøret. Vent i 10 minutter, og vask derefter luftrørets lumen ved infusion af 10 ml 1x PBS ved hjælp af sprøjtepumpen for at fjerne det resterende ikke-inkorporerede CFSE-reagens.
  4. Indsæt den distale billeddannelsesende af GRIN-linsen i luftrøret via Luer-stikket, der er fastgjort til den ene ende af luftrøret. Flyt derefter forsigtigt GRIN-objektivet inde i luftrøret, indtil luftrørets overflade er fokuseret, og tag fotos og videoer i lysfelt eller fluorescens ved 20x forstørrelse.
  5. Følg nedenstående trin for at tage lysfeltbilleder i Micro-Manager-softwaren.
    1. Indfør hvidt lys gennem burkuben for at belyse luftrørets lumen. Klik på Live-ikonet for at vise luftrørets luminale overflade i realtid. Brug Imaging Setting > Exposure (ms) til at ændre eksponeringstiden til den ønskede værdi. I denne undersøgelse lå den anvendte eksponeringstid i området 10 ms og 50 ms.
    2. Hvis du vil justere kontrasten og lysstyrken i billeder, skal du bruge vinduet Histogram og Intensitetsskalering til at flytte sort-hvide pile ved slutpunktet for det interaktive histogramdisplay. Alternativt kan du bruge indstillingen Auto Stretch , der gør det muligt for softwaren at justere lysstyrken og kontrasten automatisk til optimale niveauer.
    3. Klik på Snap ikon for at fryse billedet. Brug derefter Indstilling > Eksporter billeder som forskudt for at gemme billederne i det ønskede format. Alternativt kan du bruge Indstilling > ImageJ til direkte at eksportere billedet til ImageJ-softwaren og gemme det.
  6. For at få fotos og videoer i fluorescerende tilstand skal du belyse luftrørets lumen med CFSE-specifikt laserlys (CFSE: excitationsbølgelængde: 488 nm, emissionsbølgelængde: 515 nm) gennem burkuben. Følg trinnene 3.5.2-3.5.3 for at hente billederne. Når du har taget billeder og videoer, skal du forsigtigt fjerne GRIN-objektivet fra luftrøret.
  7. Udfør de-epithelialisering som beskrevet nedenfor.
    1. Forbered 2% natriumdodecylsulfat (SDS) decellulariseringsopløsning i destilleret (DI) vand. Indsprøjt 50 μL SDS gennem luftrøret med en strømningshastighed på 6,3 ml/min ved at bruge sprøjtepumpen gennem luftrørskyllen til at generere en tynd film af vaskemiddelopløsningen på luftrørets lumen.
    2. Luk bioreaktorens slangeforbindelser ved hjælp af luerpropper til mænd/kvinder, og overfør bioreaktoren til en inkubator. Lad SDS'et dvæle i luftrøret i 10 minutter ved 37 °C. Indsæt yderligere 50 μL SDS-opløsning gennem luftrøret og inkuber i 10 minutter.
    3. Fjern lyseret epitel og SDS ved at vande luftrørets lumen med 500 μL 1x PBS via sprøjtepumpe med en strømningshastighed på 10 ml/min i 3x. Anbring bioreaktoren på en ryster, og vibrer bioreaktoren mekanisk ved 20 Hz frekvens og forskydningsamplitude på ca. 0,3 mm for fysisk at fremme frigørelse af SDS-behandlede epitelceller fra luftrørets lumen.
      BEMÆRK: I denne undersøgelse blev rysteren specialbygget ved at samle en subwooferhøjttaler, en subwooferpladeforstærker og et accelerometer. En sinusformet bølgeform blev genereret af en computer og ført ind i rysteren via forstærkeren, mens rysterens respons blev overvåget via accelerometeret (figur 3B). Derudover kan konventionelle rystere, såsom elektromagnetiske og inertirystere, bruges til at fremme cellernes løsrivelse. For at gøre dette skal du indstille rysterens frekvens og acceleration til henholdsvis 20 Hz og 0,5 g (svarende til 0,3 mm forskydningsamplitude).
    4. Indsprøjt 500 μL 1x PBS to gange gennem luftrørets lumen for at fjerne resterende SDS og celleaffald, mens luftrøret vibreteres mekanisk. Efter proceduren for fjernelse af epitel evalueres epitellagets clearance ved at måle intensiteten af CFSE ved hjælp af GRIN-linsebilleddannelsesenheden som i trin 3.6 (figur 3C).

4. Forberedelse af luftrørsvæv til yderligere analyser

  1. For at bekræfte epitelfjernelsen skal du udføre yderligere vævsanalyser, såsom hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning, trikrom, pentakrom og immunfarvning. For at gøre dette skal du fjerne luftrøret fra bioreaktoren og fastgøre det i 30 ml 4% neutral bufret paraformaldehydopløsning i 1x PBS (pH = 7,4) ved 4 ° C natten over.
  2. Dehydrer og indlejr det faste luftrørsvæv ved at følge nedenstående trin.
    1. Efter fiksering vaskes luftrørsvævet med 10 ml 1x PBS, overføres luftrøret til 30 ml 70% alkohol og opbevares ved 4 °C natten over. Skær luftrøret i små cylindriske sektioner (~ 5 mm) ved hjælp af et skarpt blad og indsæt vævssektionerne i vævsindlejringskassetterne (længde x bredde x højde: 4 cm x 2,5 cm x 0,5 cm). Opbevar to luftrørssektioner i hver kassette.
    2. Dehydrer sektionerne i en række isopropylalkoholopløsninger (IPA) - 85%, 90%, 95%, 100% - til 1 time i 30 ml af hver opløsning. Fjern den forrige løsning, før du tilføjer den næste løsning.
    3. Efter færdiggørelsen nedsænkes kassetterne i 30 ml clearingmiddel (f.eks. xylen) i 2 timer for at fortrænge IPA-opløsningen fuldstændigt fra vævssektionerne. Udfør dette trin i en stinkhætte med korrekt ventilation.
    4. Sænk kassetterne i paraffin i 2 timer, og indlejr dem derefter i paraffin ved 4 ° C natten over. Skær derefter det paraffinindlejrede væv i tynde sektioner (5-8 μm) ved hjælp af en mikrotomanordning til H & E, trikrom, pentakrom og immunfarvning.
  3. For at forberede vævene til scanning elektronmikroskopi (SEM) analyse, fastgør luftrøret i 30 ml 2,5% glutaraldehydopløsning i 1x PBS (pH = 7,4) ved 4 ° C natten over. Dehydrer derefter det faste luftrørsvæv til SEM ved at følge nedenstående trin.
    1. Efter fiksering skylles luftrørsvævet med 10 ml 1x PBS. Skær luftrørsvævet i længderetningen i små halvcylindrede sektioner (længde: ~ 5 mm) ved hjælp af en saks og indsæt vævssektionerne i kassetterne.
    2. Dehydrer sektionerne i en række IPA-opløsninger - 35%, 50%, 70%, 85%, 95% og 100% - i 10 minutter i 30 ml af hver opløsning. Fjern den forrige løsning, før du tilføjer den næste løsning.
    3. Udfør hexamethyldisilazan (HMDS)-baseret tørringsmetode ved at nedsænke vævene i følgende opløsninger: 100% IPA: HMDS (2:1; v/v) i 10 minutter, efterfulgt af 100% IPA: HMDS (1:2; v/v) i 10 minutter og til sidst 100% HMDS natten over.
      BEMÆRK: HMDS er giftigt. Arbejd under en stinkhætte under alle tørringstrin.
    4. Fjern vævene fra HMDS-opløsningen, og lad dem tørre under stinkhætten i 1 time. Monter sektionen på aluminiumsstiftstubbe ved hjælp af et kulstof dobbeltsidet ledende tape eller sølvledende pasta til SEM-billeddannelse.

5. Homogen fordeling af eksogene celler på det denuderede trakeale lumen

  1. Forbered en de-epitelialiseret rotte luftrør ved hjælp af protokollen i trin 3. Optø frosne mesenkymale stamceller (MSC'er) i 30 s i et 37 ° C vandbad.
    BEMÆRK: I denne undersøgelse brugte vi mesenkymale stamceller (MSC'er) som en modelcelle til at vise fordelingen af eksogene celler på det de-epithelialiserede luftrør. Ideelt set kan primære luftvejsepitelceller, basalceller eller inducerede humane pluripotente celler (iPSC'er) anvendes til epitelregenereringsformål.
  2. Tæl cellerne med et hæmocytometer, og tilbered en celleopløsning med en koncentration på 5 x 106 celler/ml. Mærk cellerne fluorescerende ved at inkubere cellerne med 2 ml CFSE-opløsning (koncentration: 100 μM) ved stuetemperatur i 15 minutter. Skyl cellerne med 5 ml 1x PBS til 3x og resuspend cellerne i friskdyrkningsmedium i en endelig koncentration på 3 x 107 celler/ml.
  3. Forbered hydrogel pre-gel opløsning som et køretøj til celle levering. Til denne undersøgelse skal du bruge kollagen I som leveringsmiddel til MSC-celler og følge producentens anvisninger for at forberede pre-gelen. For eksempel, for at opnå 3,6 mg / ml kollagen pre-gel, bland en del af den kølede neutraliseringsopløsning med ni dele af rottehalekollagen i et 1,5 ml sterilt rør. Rør derefter forsigtigt blandingen op og ned for tilstrækkelig blanding.
    BEMÆRK: Andre biokompatible hydrogeler kan anvendes i stedet for kollagen I i henhold til undersøgelsen og brugernes behov.
  4. Når hydrogelopløsningen er fremstillet, tilsættes cellerne hurtigt til opløsningen med den ønskede koncentration (f.eks. 5 x 106 celler/ml). For at opnå en ensartet celle-hydrogelblanding blandes cellerne og gelopløsningen ved forsigtigt pipettering med en mikropipette.
  5. Fastgør den ene ende af luftrøret i bioreaktoren til en programmerbar sprøjtepumpe gennem et Luer-stik. Levér 5 ml friskkulturmedium ved 37 °C i bioreaktorkammeret for at dække luftrørets udvendige overflade ved hjælp af sprøjtepumpen med en strømningshastighed på 5 ml/min.
  6. Administrer en 10 μL bolus af celle-hydrogelblandingen i det de-epithelialiserede luftrør i bioreaktoren ved hjælp af sprøjtepumpen med en strømningshastighed på 5 ml / min for at generere et cellehydrogellag på luftrøret lumen (figur 4).
  7. Efter celleinjektion anbringes bioreaktoren i en steril cellekulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2 til gelering. For kollagen I sker geleringen på 30 minutter.
  8. For at visualisere fordelingen af implanterede celler skal du sterilisere GRIN-linsen ved at tørre med 70% IPA eller ethanol og placere bioreaktoren på billeddannelsestrinnet. Tag billeder og videoer i både lysfelt- og fluorescerende tilstande efter behov.
  9. Efter 30 minutters cellesåning tilføres 1 ml dyrkningsmedium i luftrørets lumen ved hjælp af en sprøjtepumpe med en strømningshastighed på 1 ml/min.
  10. Det cellefrøede luftrør i bioreaktoren dyrkes i en inkubator ved 37 °C i det ønskede tidsrum. For langsigtet kultur skal du opdatere kulturmediet i luftrørets lumen og bioreaktorkammeret hver 24. time. Under cellekulturen skal du holde mediet inde i lumen statisk og ændre det hver 24. time, mens mediet uden for luftrøret kontinuerligt perfunderes via en ensrettet strøm ved 5 ml / min.
  11. Efter dyrkning af cellerne i en vis periode (f.eks. 1 og 4 dage i denne undersøgelse) skal du fjerne luftrøret fra bioreaktoren. Brug en saks til at skære luftrøret i længderetningen i to halvcylindrede sektioner (dvs. øvre og nedre sektioner) på dag 1 og 4 i in vitro-kultur for at udsætte de indre overflader til overvågning af cellevækst og beregning af celletæthed. Brug et konventionelt fluorescerende mikroskop til at visualisere cellerne på de indre overflader.
  12. Følg trin 3.5 og 3.6 for at hente billederne ved hjælp af Micro-Manager-software. Brug et fluoresceinisothiocyanatfilter (FITC) til at visualisere de CFSE-mærkede celler i fluorescenstilstand. Analyser de billeder, der er taget af det fluorescerende mikroskop, og beregn celletætheder på øvre og nedre sektioner ved hjælp af ImageJ-softwaren. Følg nedenstående trin for at beregne antallet af celler og celletætheden.
    1. Åbn et billede i ImageJ-softwaren, og konverter billedet til et binært billede (16-bit) ved hjælp af Image > Type > 16-bit. Indstil billedskalaen med skalalinjen ved hjælp af Analysér > Indstil skala.
    2. Juster tærsklen for billedet for at fremhæve strukturerne i de celler, der skal tælles. Brug Image > Juster > tærskel. Brug Analysér > Analysér partikler til at tælle antallet af celler. Beregn tætheden af cellerne ved at dividere antallet af celler med billedets overfladeareal.
  13. For at vurdere levedygtigheden efter cellesåning skal du bruge et cellelevedygtighedssæt. Til denne undersøgelse inkuberes luftrørsvævet og cellerne i bioreaktoren ved 37 °C i 6 timer og pletter cellerne med 4 mM calcein-AM og 2 mM ethidiumhomodimer-1 i 1 ml 1x PBS ved stuetemperatur i 15 minutter.
  14. Efter skylning med 1x PBS skal du visualisere cellerne ved hjælp af et fluorescerende mikroskop. Tæl levende og døde celler ved hjælp af de trin, der er beskrevet i trin 5.12. Beregn cellelevedygtighed som procentdelen af levende celler (farvet med calcein-AM) pr. Total celler (både levende og døde celler).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den GRIN-linsebaserede in situ-billeddannelsesmodalitet kan muliggøre visualisering af det trakeale indre lumen in situ (figur 5A). Ved hjælp af denne billeddannelsesmetode kan der opnås både lysfelt- og fluorescerende billeder af de indfødte og de-epithelialiserede luftrør (figur 5B,C). Der blev ikke observeret noget fluorescerende signal fra det oprindelige luftrør før CFSE-mærkning (figur 5Bii). Men når trakealepitelet blev mærket med CFSE-farvestof, blev der observeret et ensartet fluorescerende signal (grønt) i hele epitelet (figur 5Ci). Efter de-epithelialisering via SDS og vibrationsassisteret luftvejsvanding blev intensiteten af det fluorescerende signal reduceret signifikant (figur 5Cii), hvilket indikerer ablation af epitelet.

H & E-billederne af de-epithelialiseret luftrør viste fjernelsen af det pseudostratificerede epitel fra luftrørets lumen og bevarelse af cellerne og ECM-mikrostrukturen i underliggende vævslag (figur 6A). Desuden bekræftede pentakrom (figur 6B) og trikromfarvning (figur 6C) opretholdelsen af luftrørsvævsarkitekturen og ECM-komponenterne, såsom kollagen og proteoglycaner. Endvidere immunofluorescens af epitelceller (epitelcelleadhæsionsmolekyle, EpCAM; Figur 6D) og kollagen I (figur 6E) afslørede fuldstændig fjernelse af epitelet og konservering af kollagen I i subepitelvævet. SEM-billeddannelse af indfødte luftrør viste, at luminaloverfladen af indfødte rotteluftrør hovedsageligt var befolket med multicilierede celler og bægerceller. På den anden side viste SEM-billeder af de-epithelialiseret luftrørslumen, at kældermembranen blev eksponeret som angivet af et mesh-netværk af ECM-fibre og fraværet af epitelceller (figur 6F).

Ved hjælp af de-epitelialiserede rotte luftrør og fluorescerende mærkede celler undersøgte vi, om inkorporering af en hydrogel som et celleleveringskøretøj kunne opnå homogen cellefordeling på det de-epitelialiserede trakeallumen (figur 7A, B). I denne undersøgelse blev de mesenkymale stamceller (MSC'er) anvendt som modelceller til celleleverings- og kulturundersøgelsen. Som beskrevet i protokollen (trin 5) indførte vi MSC-belastet kollagen I pre-gel i en de-epithelialiseret rottetrachea og overvågede fordelingen af cellerne på trakeal lumen ved hjælp af GRIN-linsebilleddannelsessystemet. Som et kontroleksperiment suspenderede vi MSC'er i dyrkningsmediet, infunderede det cellebelastede kulturmedium i luftrøret og inspicerede visuelt fordelingen af cellerne. In situ-billeddannelsesresultater viste, at de fluorescerende mærkede celler, der blev leveret via hydrogel, forblev klæbet mere ensartet over lumen end dem, der blev podet via dyrkningsmedium (figur 7B). Vi testede derefter cellens levedygtighed før og efter cellelevering for at evaluere potentiel celleskade og død på grund af forskydningsstress under celleinfusion. Resultatet viste, at cellernes levedygtighed ikke blev signifikant påvirket af celleleveringsproceduren, da over 90% af cellerne forblev levedygtige (figur 7C).

Desuden dyrkede vi de cellefrøede luftrør i 4 dage. Cellerne podet via både kollagen og dyrkningsmedium (kontrol) spredte sig på den de-epithelialiserede luftrørslumenoverflade som indikeret af det øgede antal celler, der udtrykker CFSE over tid i både den øvre og nedre halvdel af trakeallumen (figur 7D). Især i kollagenhydrogelleveringsgruppen var forskellen i cellernes densitet mellem øvre og nedre lumen mindre end i kontrolgruppen, hvilket indikerer cellelevering via hydrogel fremmer homogen cellefordeling i hele luftrøret lumen.

Figure 1
Figur 1: Tredimensionel (3D) computertegning af luftrørsbioreaktoren. (A) (i) set fra siden, ii) øverste visning. (B) Bioreaktorkammerets dimensioner. (C) En gennemsigtig akrylplastplade skæres og fastgøres til toppen af hovedkammeret ved hjælp af skruer. Enhed = mm; R = radius. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Specialbygget mikrofiberbilleddannelse til in situ-visualisering af rottetracheaen. (A) (i) Skematisk oversigt over billeddannelsesopsætningskomponenterne i lysbanen. Forkortelser: C = kamera, TL = rørlinse, F = filter, DM = dikroisk spejl, OL = objektiv linse; ii) fotografi af de billedbehandlingsopsætningskomponenter, der viser billedsonden (GRIN-objektivet), indsættes i Luer-stikket på bioreaktoren. (B) Skematisk visning af, at GRIN-objektivet er integreret med bioreaktoren. (C) Et fotografi, der viser billeddannelsessonden, bruges til at visualisere luftrøret inde i bioreaktoren. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Platformen til de-epithelialisering af rotte luftrør. (A) Fotografi, der viser den eksperimentelle opsætning til de-epithelialisering og in situ optisk fiberbilleddannelse. B) Diagram, der viser komponenten og samlingen af den specialbyggede elektromagnetiske ryster, der anvendes til at lette fjernelse af epitel. ω: frekvens, a: amplitude (C) Skematisk visning af arbejdsgangen for rotte luftrør de-epithelialiseringsprocedure. PBS = fosfatbufret saltvand. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Levering af eksogene celler i de-epithelialiseret rotte luftrør ved hjælp af hydrogel. Skematisk viser hydrogelopløsning, der anvendes som et leveringsmiddel til topisk deponering af cellerne på det indre lumen i det de-epiteliserede rottetrachea. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: In situ-billeddannelse af de-epithelialiseret luftrør. (A) Fotografi, der viser fluorescerende billeddannelse af luftrørets lumen, mens det CFSE-mærkede epitel er spændt med 488 nm blå laser gennem GRIN-linsen. (B) (i) Lysfelt- og (ii) fluorescensbilleder af luftrørets lumen før epitelmærkning. (C) Fluorescensbilleder af (i) indfødte og (ii) de-epitelialiserede luftrør (De-Epi luftrør), mens epitelet er mærket med CFSE fluorescerende farvestof. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Histologi, immunofluorescens og SEM-analyser af indfødte og de-epithelialiserede rottetråhjul. (A) H&E-farvning. (B) Pentachromfarvning, hvor lilla er cellecytoplasma, blå er cellekerner, grøn er proteoglycaner (f.eks. Mucin), og gul er kollagenfibre. (C) Trikromfarvning, hvor lyserød er cellecytoplasma, mørkeblå er cellekerner, og blå er kollagen. Fluorescensbilleder af indfødte og de-epithelialiserede luftrør. (D) EpCAM og (E) kollagen I. Pilespidser viser overfladen af luftrørets lumen. F) SEM-mikrografer af luftrørets lumen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Aktuel aflejring af de eksogene MSC'er i luftrørets lumen. (A) (i) Lyse felt og (ii) fluorescensbilleder af det de-epithelialiserede luftrør. (B) Fluorescerende billeder af det de-epithelialiserede luftrørslumen, når det er podet med (i) PBS og (ii) kollagen I pre-gel. Den homogene fordeling af cellerne på luftrørets lumen opnås, når pre-gel kollagen anvendes som et leveringsmiddel til celler. (C) (i) Fluorescerende billeder og (ii) kvantificeret levedygtighed af cellerne før og efter 6 timers levering med pre-gel kollagen. n: antal prøver. Trin 5.1 og 5.17 i protokollen blev fulgt for at vurdere cellernes levedygtighed. D) Cellesåningstæthed målt efter i) 1 dag og ii) 4 dage efter såning og dyrkning af celler. Celletætheden blev beregnet ved at dividere celletal med det undersøgte overfladeareal. Alle værdier repræsenterer middelværdi ± standardafvigelse. Envejsanalyse af varians (ANOVA) blev brugt til at bestemme statistisk signifikante forskelle mellem grupper, hvor p -< 0,05 betragtes som signifikant. Forkortelser: CM = kulturmedium, C = kollagen. *p < 0,05. **p < 0,01. ns: ikke signifikant. Ingen signifikant forskel (ns) mellem øvre og nedre overflader betyder ensartet cellefordeling over luftrørets omkreds. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbejde skabte vi en billeddiagnostisk guidet bioreaktor, der kan muliggøre (i) overvågning af luftrøret lumen in situ efter cellefjernelse og eksogen cellelevering og (ii) langsigtet in vitro-kultur af det cellefrøede luftrørsvæv. Ved hjælp af denne specialbyggede bioreaktor demonstrerede vi (i) selektiv fjernelse af de endogene epitelceller fra luftrørets lumen ved hjælp af vaskemiddel og vibrationsassisteret luftvejsvask og (ii) ensartet fordeling af eksogene celler på luminaloverfladen af det denuderede luftrør ved hjælp af cellebelastet kollagen I pre-gel. Desuden bekræftede den GRIN-linsebaserede billeddannelsesmodalitet fjernelsen af epitelet in situ. Med yderligere analyser, herunder H&E, trikrom, pentakrom, immunofluorescensfarvning og SEM, bekræftede vi desuden fjernelsen af epitelet og vedligeholdelsen af arkitekturen og komponenterne i de underliggende vævslag. Derudover viste den GRIN-linsebaserede billeddannelse af nyligt implanterede eksogene MSC'er den ensartede fordeling af cellerne, når kollagen I pre-gel blev brugt som leveringskøretøj. Endelig overlevede de implanterede celler og spredte sig på det de-epitelialiserede luftrør, hvilket fremhævede bioreaktorens effektivitet i den langsigtede kultur af de cellefrøede luftvejsvæv.

Det kritiske trin i de-epithelialiseringsprotokollen er at skabe et tyndt vaskemiddelopløsningslag i luftrørets lumen. I de nuværende decellulariseringsprotokoller anvendes flere cyklusser af kemikalier og enzymer over en lang periode, hvilket reducerer antallet af kollagenfibre, glycosaminoglycaner (GAG'er), proteoglycaner og chondrocytter, hvilket kompromitterer de biologiske og biomekaniske egenskaber af luftvejsstilladset 19,20,21. På den anden side giver ECM biokemiske og mekaniske signaler og egnede fysiske miljøer til overlevelse, spredning og differentiering af implanterede eksogene celler22,23. Tyndfilmsaflejringsmetoden, der er beskrevet i denne undersøgelse, bruger en lille mængde vaskemiddel (mindre end 50 μL) til epitelablationen, samtidig med at det underliggende vævslag og subepitelcellulære komponenter bevares. Mekanisk vibration af det vaskemiddeleksponerede væv, der er demonstreret i denne undersøgelse, er en vigtig procedure, da det tillader løsrivelse og clearance af de lyserede celler. Celleaffaldet og delvist forstyrrede celler som følge af epitelets eksponering for vaskemidlet er udfordrende at vaske kun ved at oversvømme luftrøret med vaskeopløsningen. Derfor giver mekanisk vibrerende luftrøret under vask tilstrækkelige forskydningskræfter til at rydde celleaffaldet fra trakeallumen.

Generelt kan den præ-gelbaserede cellesåningsmetode påvirkes af leveringshastigheden, viskositeten af pre-gelen (der er direkte relateret til prægelkoncentrationen), overfladespænding og geleringstid. Især under prægelpræparation er det vigtigt at opretholde prægelkoncentrationen lav nok til at transportere den cellesuspenderede pre-gel i slangen og høj nok til at opretholde cellerne på luftrørets øvre overflade. Derfor anbefales det kraftigt at finde den optimale koncentration for hver pre-gel ved at teste forskellige koncentrationer. Derudover skal du øve leveringsteknikken såsom leveringshastigheden med mindre dyrebare celler for at sikre en vellykket levering af den cellebelastede forgel. Selv om vi brugte MSC'er som cellemodel til at demonstrere (i) fordelingen af cellerne med pre-gel som leveringsmiddel og (ii) bioreaktorsystemets evne til at dyrke de nyfrøede celler på denuderet luftrørslumen, kunne brugen af stamceller (f.eks. basalceller) og primære luftvejsepitelceller i fremtidige undersøgelser gøre det muligt at studere celledifferentiering og funktionel epitelregenerering24, 25. Derudover kan fremtidige undersøgelser omfatte tilføjelse af en luft-væske-grænseflade (ALI) til den nuværende platform for at generere in vivo-lignende forskydningsstress på podede celler til generering af funktionelt epitel. For at tilføje ALI til den aktuelle enhed kan en lille dyreventilator tilsluttes luftrøret for at ventilere luftrøret. For at opnå ALI kan tyndfilmsaflejringsmetoden desuden bruges til at indgyde et kulturmedium flydende stik i det cellefrøede luftrør. Tykkelsen af den flydende film kan moduleres ved at ændre væskeproppens hastighed26,27. Stikket kan startes, når de nyfrøede celler klæber og indpodes fast på luftrørets lumen.

Derudover er in situ GRIN-linsebaseret billeddannelsesmetode, der anvendes i denne protokol, afgørende for at bekræfte effekten af de-epithelialiseringen og vurdere kvaliteten af fordelingen af nyfrøede celler. I modsætning til konventionelle vævsanalysemetoder, såsom histologi og immunofluorescens, som kræver dissekering af prøverne fra luftrørsvævet til analyse, tillader billeddannelsesplatformen, der er udviklet i vores undersøgelse, hurtig og ikke-destruktiv overvågning af luftvejslumen under de-epithelialisering og cellelevering. For at holde luftrøret steriliseret under in situ-billeddannelse skal du sørge for at sterilisere GRIN-linsen ved at tørre den af med 70% IPA eller ethanol, før den indføres i luftrørets lumen. For at afbilde cellerne ved hjælp af GRIN-linsen kan cellerne (enten endogene trakealepitelceller eller nyligt implanterede celler) desuden mærkes med forskellige fluorescerende farvestoffer med forskellige excitations- / emissionsbølgelængder. For at gøre dette skal du sørge for at bruge den passende laserlysgenerator til at ophidse de fluorescerende mærkede celler og integrere de rigtige filterlinser til det dobbeltkantede superopløsningsdikroiske spejl.

På trods af nyheden og innovativiteten af de-epithelialisering, cellelevering og in situ-billeddannelsesmetoder har denne undersøgelse flere begrænsninger. De de-epithelialiserings- og celleleveringsmetoder, der er beskrevet i denne undersøgelse, gælder for små luftveje (diameter: mindre end 3-4 mm), hvor overfladespændingen er dominerende. Dannelse af et flydende stik og skabelse af en tynd film af de-epithelialiseringsopløsningen eller cellebelastet pre-gel-suspension i større luftveje, såsom svin og human luftrør eller bronkier, kan være udfordrende, da overfladespændingen bliver ubetydelig sammenlignet med andre kræfter, især tyngdekraften. Desuden var vi ved at bruge tyndfilmsaflejringsmetoden og modulere tid og koncentration i stand til at ablate epitelet med et stærkt vaskemiddel (SDS) og bevare det underliggende vævslag. I fremtidige undersøgelser kan mildere decellulariseringsvaskemidler, såsom 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS)28 eller ikke-vaskemiddelopløsning, såsom natriumhydroxid (NaOH)29, testes til bevarelse af ECM-komponenter og støtte af nyligt implanterede celler. Desuden reduceres fluorescensintensiteten af CFSE-mærkede celler over tid på grund af cellernes opdeling. I vores undersøgelse viste de fluorescerende billeder af MSC'er dyrket på de de-epithelialiserede luftrør i 4 dage et betydeligt fald i deres fluorescensintensitet. For langvarig overvågning og sporing af eksogene celler, der er podet på vævsstilladserne, vil forskellige cellemærkningsmetoder, der kan muliggøre langvarig eller permanent fluorescerende mærkning af cellerne, være nødvendige.

Vi forestiller os, at den billeddiagnostiske bioreaktorplatform og cellefjernelses- og leveringsprotokoller, der er beskrevet i denne rapport, kan muliggøre oprettelse af de-epitelialiserede luftvejsvævsstilladser, der kan bruges til at generere det biomanipilerede luftvejsvæv. Sådanne in vitro-luftveje kan tilbyde high-fidelity in vitro-modellering af humane luftvejssygdomme og lægemiddelscreening. For eksempel for at etablere funktionelt luftvejsepitel kan luftvejsbasale stamceller først implanteres på det de-epithelialiserede luftvejsvæv30. Derefter kan luft-væske-grænsefladen (ALI), som er kritisk for differentieringen af basale stamceller i forskellige epitelceller, genereres i luftrøret. Desuden kan in situ-billeddannelsessystemet ændres og bruges til fluorescerende at visualisere luftvejene hos patienter med lungeluftvejsforstyrrelser. For at blive brugt klinisk til at evaluere luftvejsvæv in situ kan den stive GRIN-linse udskiftes med fleksible optiske fiberbilleddannelsessonder til at navigere i luftvejene. Desuden kan evnen til homogent at fordele cellerne inde i luftvejene ved hjælp af hydrogelbaseret cellesåning give en hidtil uset mulighed for at erstatte beskadiget eller skadet epitel hos patienter. Især kan celleudskiftningsmetoden, der er udviklet og anvendt i denne undersøgelse, fremskynde cellebaseret behandling til behandling af luftvejssygdomme, såsom cystisk fibrose og primær ciliær dyskinesi, og reparere donorlunger, der nægtes til transplantation på grund af alvorligt skadede luftvejsvæv 31,32,33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Denne forskning er delvist støttet af American Thoracic Society Foundation Research Program, New Jersey Health Foundation og National Science Foundation (CAREER Award 2143620) til J.K.; og National Institutes of Health (P41 EB027062) til G.V.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1× PBS Gibco, Thermo Fisher Scientific 10-010-031
3-port connector World Precision Instruments 14048-20
4-port connector World Precision Instruments 14047-10
Accelerometer STMicroelectronics IIS3DWBTR
Achromatic doublet Thorlabs AC254-150-A-ML
Aluminum pin stub TED PELLA 16111
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240062
Assembly rod Thorlabs ER1
Button head screws McMaster-Carr 91255A274
Cage cube Thorlabs C4W
Carbon double-sided conductive tape TED PELLA 16073
CFSE labelling kit Abcam ab113853
Citrisolv (clearing agent) Decon 1061
C-mount adapter Thorlabs SM1A9
Collagen I Advanced BioMatrix 5153
Conductive liquid silver paint TED PELLA 16034
Dichroic mirror Semrock DI03-R488 Reflected laser wavelengths:  473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco, Thermo Fisher Scientific 11965118
Female luer bulkhead to hose barb adapter Cole-Parmer EW-45501-30
Female luer to tubing barb Cole-Parmer EW-45508-03
Female to male luer connector Cole-Parmer ZY-45508-80
Fetal bovine serum Gibco, Thermo Fisher Scientific 10082147
Filter lens Chroma Technology Corp ET535/50m
Fluorescent microscope Nikon Eclipse E1000 - D
Fusion 360 Autodesk
Hex nut McMaster-Carr 91813A160
Hexamethyldisilazane (HMDS) Fisher Scientifc AC120585000
Imaging fiber SELFOC, NSG group GRIN lens
Laser Opto Engine MDL-D-488-150mW
Lens tubes Thorlabs SM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) Thermo Fisher Scientific L3224
MACH 3 CNC Control Software Newfangled Solutions
Objective lens Olympus UCPLFLN20X
Peristaltic Pump Cole Parmer L/S standard digital pump system
Recombinant human FGF-basic PeproTech 100-18B
Retaining ring Thorlabs SM1RR
Scientific CMOS camera PCO Panda PCO Panda 4.2
Sodium dodecyl sulfate VWR 97064-472
Solidworks (2019) Dassault Systèmes
Stackable lens tube Thorlabs SM1L10
Subwoofer plate amplifier Dayton Audio SPA250DSP
Subwoofer speaker Dayton Audio RSS21OHO-4 Diaphragm diameter: 21 cm
Syringe Pump World Precision Instruments AL-4000
Threaded cage plate Thorlabs CP33
Threaded luer adapter Cole-Parmer EW-45513-81
Tube lens Thorlabs AC254-150-A-ML
Tygon Tubing Cole-Parmer 13-200-110
XY Translator Thorlabs CXY1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).
  3. Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
  4. Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).
  5. De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).
  6. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  7. Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
  8. Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
  9. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  10. Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
  11. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  12. Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).
  13. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
  14. Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
  15. Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
  16. Planchard, D. Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , SDC Publications. (2022).
  17. Coward, C. A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , No Starch Press. (2019).
  18. Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
  19. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  20. Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
  21. Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
  22. Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
  23. Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
  24. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
  25. Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
  26. Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
  27. Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).
  28. O'Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
  29. Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
  30. Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).
  31. O'Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).
  32. Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).
  33. Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
  34. Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).

Tags

Bioengineering udgave 182
Billeddirigeret bioreaktor til generering af biomanirigeret luftvejsvæv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mir, S. M., Chen, J., Pinezich, M.… More

Mir, S. M., Chen, J., Pinezich, M. R., O’Neill, J. D., Guenthart, B. A., Vunjak-Novakovic, G., Kim, J. Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue. J. Vis. Exp. (182), e63544, doi:10.3791/63544 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter