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Bioengineering

बायोइंजीनियर्ड वायुमार्ग ऊतक उत्पन्न करने के लिए इमेजिंग-निर्देशित बायोरिएक्टर

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63544
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 4, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Stevens Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 3Department of Cell Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 4Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University

Summary

प्रोटोकॉल एक इमेजिंग-सक्षम बायोरिएक्टर का वर्णन करता है जो चूहे की श्वासनली से अंतर्जात उपकला के चयनात्मक निष्कासन और लुमेन सतह पर बहिर्जात कोशिकाओं के समरूप वितरण की अनुमति देता है, जिसके बाद सेल-ऊतक निर्माण की दीर्घकालिक इन विट्रो संस्कृति होती है।

Abstract

वायुमार्ग के ऊतकों को बार-बार चोट लगने से फेफड़ों के कार्य को खराब किया जा सकता है और पुरानी फेफड़ों की बीमारी हो सकती है, जैसे कि क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज। पुनर्योजी चिकित्सा और बायोरिएक्टर प्रौद्योगिकियों में प्रगति प्रयोगशाला में उगाए गए कार्यात्मक ऊतक और अंग निर्माणों का उत्पादन करने के अवसर प्रदान करती है जिनका उपयोग दवाओं, मॉडल रोग और इंजीनियर ऊतक प्रतिस्थापन की स्क्रीन के लिए किया जा सकता है। यहां, एक इमेजिंग पद्धति के साथ युग्मित एक लघुकृत बायोरिएक्टर जो इन विट्रो ऊतक हेरफेर और संस्कृति के दौरान निष्कासित चूहे की श्वासनली के आंतरिक लुमेन के सीटू विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है, का वर्णन किया गया है। इस बायोरिएक्टर का उपयोग करते हुए, प्रोटोकॉल आंतरिक जैव रासायनिक विशेषताओं और वायुमार्ग ऊतक मैट्रिक्स की अल्ट्रास्ट्रक्चर को संरक्षित करते हुए अंतर्जात सेलुलर घटकों के इमेजिंग-निर्देशित चयनात्मक हटाने को प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, वितरण, समान वितरण, और सीटू में ऑप्टिकल निगरानी के साथ decellularized वायुमार्ग लुमेन पर बहिर्जात कोशिकाओं की बाद में लंबे समय तक संस्कृति को दिखाया गया है। परिणाम इस बात पर प्रकाश डालते हैं कि इमेजिंग-निर्देशित बायोरिएक्टर का उपयोग संभावित रूप से इन विट्रो वायुमार्ग ऊतकों में कार्यात्मक की पीढ़ी को सुविधाजनक बनाने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

श्वसन पथ की ल्यूमिनल सतह को उपकला की एक परत द्वारा पंक्तिबद्ध किया जाता है जिसमें मुख्य रूप से बहु-सिलिएट, क्लब, गोब्लेट और बेसल स्टेम सेल 1,2 होते हैं। उपकला परत फेफड़ों के प्राथमिक रक्षा तंत्र के रूप में कार्य करती है, जो एक बायोफिजिकल बाधा के रूप में कार्य करती है जो अंतर्निहित वायुमार्ग ऊतक को साँस के रोगजनकों, कणों या रासायनिक गैसों के खिलाफ बचाती है। यह कई तंत्रों के माध्यम से वायुमार्ग के ऊतकों की रक्षा करता है, जिसमें अंतरकोशिकीय तंग जंक्शन गठन, म्यूकोसिलियरी क्लीयरेंस और रोगाणुरोधी और एंटीऑक्सिडेंट स्राव 3,4 शामिल हैं। दोषपूर्ण वायुमार्ग उपकला विनाशकारी श्वसन रोगों से जुड़ा हुआ है, जैसे कि क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) 5, प्राथमिक सिलिअरी डिस्किनेसिया (पीसीडी) 6, और सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) 7।

फेफड़े-ऑन-चिप (एलओसी) तकनीक में प्रगति मानव फेफड़ों के विकास का अध्ययन करने, विभिन्न फेफड़ों की बीमारियों को मॉडल करने और विट्रो वातावरण में कसकर विनियमित में नई चिकित्सीय सामग्री विकसित करने के अवसर का प्रतिनिधित्व करती है। उदाहरण के लिए, वायुमार्ग उपकला और एंडोथेलियम को फेफड़ों के ऊतकों के आदान-प्रदान वाली गैस की नकल करने के लिए एक पतली, झरझरा झिल्ली के विपरीत पक्षों पर सुसंस्कृत किया जा सकता है, जिससे वफादार रोग मॉडलिंग और दवा परीक्षण 8 की अनुमति मिलतीहै। इसी तरह, इन विट्रो रोग मॉडल को विट्रो में वायुमार्ग रोगों के मॉडल के लिए बनाया गया है, जैसे कि सीओपीडी9 और सिस्टिक फाइब्रोसिस10। हालांकि, एलओसी उपकरणों की एक बड़ी चुनौती फेफड़ों के ऊतकों के जटिल तीन-आयामी (3 डी) वास्तुकला और विट्रो11 में गतिशील सेल-ऊतक मैट्रिक्स इंटरैक्शन को दोहरा रही है।

हाल ही में, अभिनव ऊतक इंजीनियरिंग पद्धतियों को विकसित किया गया है जो पूर्व विवो फेफड़ों के ऊतकों के हेरफेर की अनुमति देतेहैं। इन तरीकों का उपयोग करते हुए, रासायनिक, भौतिक और यांत्रिक उपचार13 के माध्यम से फेफड़ों के ऊतकों से अंतर्जात कोशिकाओं को हटाकर डीन्यूडेड एलोजेनिक या ज़ेनोजेनिक ऊतक ग्राफ्ट तैयार किए जा सकते हैं। इसके अलावा, decellularized फेफड़ों scaffolds में संरक्षित देशी ऊतक extracellular मैट्रिक्स (ECM)14,15 संलग्न करने, प्रसार, और अंतर करने के लिए प्रत्यारोपित कोशिकाओं के लिए फिजियो-मिमेटिक संरचनात्मक, जैव रासायनिक, और बायोमैकेनिकल संकेत प्रदान करते हैं।

यहां, एक इमेजिंग-निर्देशित बायोरिएक्टर सिस्टम एलओसी और ऊतक इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकियों के संयोजन से बनाया गया है ताकि इन विट्रो ऊतक हेरफेर और निकाले गए चूहे के श्वासनली ऊतकों की संस्कृति की अनुमति मिल सके। इस वायुमार्ग ऊतक बायोरिएक्टर का उपयोग करते हुए, प्रोटोकॉल वायुमार्ग ऊतक के अंतर्निहित उपकला सेलुलर और जैव रासायनिक घटकों को बाधित किए बिना अंतर्जात उपकला कोशिकाओं के चयनात्मक निष्कासन को दर्शाता है। हम अगले सजातीय वितरण और नए बीज बहिर्जात कोशिकाओं के तात्कालिक जमाव, जैसे मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) को सेल-लोडेड कोलेजन I प्री-जेल समाधान को स्थापित करके डेन्यूडेड वायुमार्ग लुमेन पर दिखाते हैं। इसके अलावा, बायोरिएक्टर में एकीकृत माइक्रो-ऑप्टिकल इमेजिंग डिवाइस का उपयोग करके, उपकला हटाने और अंतर्जात सेल वितरण के दौरान श्वासनली लुमेन का विज़ुअलाइज़ेशन भी किया जाता है। इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि श्वासनली और नए प्रत्यारोपित कोशिकाओं को बायोरिएक्टर में 4 दिनों के लिए ध्यान देने योग्य कोशिका मृत्यु और ऊतक गिरावट के बिना सुसंस्कृत किया जा सकता है। हम कल्पना करते हैं कि इमेजिंग-सक्षम बायोरिएक्टर प्लेटफ़ॉर्म, पतली फिल्म-आधारित डी-एपिथेलियलाइजेशन तकनीक, और इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली सेल डिलीवरी विधि इन विट्रो रोग मॉडलिंग और दवा स्क्रीनिंग के लिए वायुमार्ग के ऊतकों को उत्पन्न करने के लिए उपयोगी हो सकती है।

बायोरिएक्टर में एक आयताकार कक्ष शामिल है जो एक प्रोग्राम योग्य सिरिंज पंप, परफ्यूजन पंप और अलग-थलग चूहे की श्वासनली को संवर्धित करने के लिए वेंटिलेटर से जुड़ा हुआ है। बायोरिएक्टर में श्वासनली या ऊतक संस्कृति कक्ष से जुड़े इनलेट्स और आउटलेट्स को ट्रेकिआ के आंतरिक और बाहरी स्थानों पर अलग-अलग अभिकर्मकों (जैसे, संस्कृति मीडिया) की आपूर्ति करने के लिए शामिल किया गया है (चित्रा 1)। एक कस्टम-निर्मित इमेजिंग सिस्टम का उपयोग सेलुलर स्तर पर इन विट्रो-सुसंस्कृत चूहे की श्वासनली के इंटीरियर की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है (चित्रा 2)। श्वासनली के अंतर्जात उपकला को एक डिटर्जेंट-आधारित डीसेल्युलराइजेशन समाधान के इन्स्टिलेशन के माध्यम से हटा दिया जाता है, जिसके बाद कंपन-सहायता प्राप्त वायुमार्ग धोने (चित्रा 3)। हाइड्रोजेल समाधान, जैसे कि प्रकार I कोलेजन, का उपयोग बहिर्जात कोशिकाओं को समान रूप से और तात्कालिक रूप से डीन्यूडेड ट्रेकिआ लुमेन (चित्रा 4) में सीडिंग के लिए एक वितरण वाहन के रूप में किया जाता है। बायोरिएक्टर के निर्माण और प्रयोगों का संचालन करने के लिए उपयोग की जाने वाली सभी सामग्री सामग्री की तालिका में प्रदान की गई हैं।

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Protocol

नीचे दिए गए पशु ऊतक प्रोटोकॉल को पशु कल्याण दिशानिर्देश और स्टीवंस इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी में पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) संस्थान के नियमों द्वारा अनुमोदित किया गया है, और यह प्रयोगात्मक जानवरों के उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) दिशानिर्देशों का अनुपालन करता है।

1. डिजाइन और इमेजिंग निर्देशित चूहा श्वासनली बायोरिएक्टर के निर्माण

  1. डिजाइनिंग और चूहे श्वासनली बायोरिएक्टर के निर्माण
    1. सीएडी जनरेटर सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रासंगिक डिज़ाइन, जैसे इनलेट्स, आउटलेट्स और टिश्यू कल्चर चैंबर के साथ बायोरिएक्टर चैंबर का एक कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (सीएडी) मॉडल बनाएं। इस अध्ययन के लिए, चित्र 1A-C में प्रस्तुत ज्यामिति और आयामों का उपयोग करें। सीएडी जनरेटर सॉफ्टवेयर के ट्यूटोरियल16,17 में पाया जा सकता है.
    2. एक कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण (सीएनसी) नियंत्रक सॉफ्टवेयर के लिए उत्पन्न सीएडी मॉडल निर्यात और bioreactor कक्ष बनाने के लिए एक सीएनसी मशीन का उपयोग कर polytetrafluoroethylene (PTFE) प्लास्टिक में कटौती। सीएनसी नियंत्रक सॉफ्टवेयर के ट्यूटोरियल18 में पाया जा सकता है.
      नोट: PTFE के अलावा, अन्य प्लास्टिक सामग्री, जैसे कि अल्ट्रा-उच्च आणविक भार पॉलीथीन (UHMWPE) और पॉलीएथरिमाइड का उपयोग संस्कृति कक्ष को बनाने के लिए किया जा सकता है।
    3. डिवाइस में सुसंस्कृत ऊतकों और कोशिकाओं के संदूषण से बचने के लिए सभी बायोरिएक्टर घटकों, जैसे कि ल्यूर एडेप्टर और शिकंजा, को निष्फल करें। एक स्वच्छ वातावरण में मुख्य ऊतक संस्कृति कक्ष के लिए सभी बायोरिएक्टर घटकों को इकट्ठा करें (चित्रा 1 ए)।
  2. ग्रेडिएंट इंडेक्स (GRIN) लेंस-आधारित इमेजिंग डिवाइस का निर्माण
    1. इन सीटू इमेजिंग डिवाइस बनाने के लिए, एक स्टैकेबल लेंस ट्यूब में एक ट्यूब लेंस डालें और इसे एक रिटेनिंग रिंग का उपयोग करके सुरक्षित करें। एक सी-माउंट एडाप्टर के माध्यम से एक वैज्ञानिक CMOS कैमरे पर लेंस-ट्यूब असेंबली माउंट करें।
    2. कैमरा संचालित करने और फ़ोटो और वीडियो प्राप्त करने के लिए माइक्रो-मैनेजर जैसे सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें. एक लंबी दूरी पर स्थित एक वस्तु का लक्ष्य रखें (उदाहरण के लिए, कैमरे से 10 मीटर) और कैमरे के ट्यूब लेंस और इमेजिंग सेंसर के बीच की दूरी को समायोजित करें जब तक कि उपयोग किए जा रहे इमेजिंग सॉफ़्टवेयर द्वारा कंप्यूटर स्क्रीन पर ऑब्जेक्ट की एक केंद्रित छवि नहीं बनती है।
    3. एक दोहरे किनारे सुपर रिज़ॉल्यूशन dichroic दर्पण पर एक फिल्टर लेंस माउंट और ऑप्टिकल पिंजरे प्रणाली घटकों का उपयोग कर डिवाइस के लिए एक लेजर, विधानसभा रॉड, थ्रेडेड पिंजरे की प्लेट, और पिंजरे घन सहित.
    4. ऑब्जेक्टिव लेंस (20x) को डिवाइस से कनेक्ट करें। XY अनुवादक के माध्यम से लेंस ट्यूब के दूरस्थ छोर पर एक GRIN लेंस (व्यास = 500 μm) माउंट करें। ध्यान केंद्रित माइक्रोस्कोपिक छवियों (चित्रा 2ए, बी) बनाने के लिए GRIN लेंस और उद्देश्य लेंस के बीच की दूरी को समायोजित करें।

2. चूहे की श्वासनली का अलगाव

  1. सर्जिकल क्षेत्र को साफ करें और सर्जरी से पहले 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर एक आटोक्लेव का उपयोग करके सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें।
  2. प्रेरण कक्ष में एक चूहे को रखें और जानवर को बेहोश करने के लिए एक छोटे से वेपोराइज़र का उपयोग करके 15 मिनट के लिए आइसोफ्लुरान का 2.5% वितरित करें। पेडल रिफ्लेक्स द्वारा संज्ञाहरण गहराई का आकलन करें। ऐसा करने के लिए, दृढ़ता से पैर की अंगुली को चुटकी लें और पुष्टि करें कि जानवर पैर की अंगुली की चुटकी का जवाब नहीं देता है।
  3. संज्ञाहरण के बाद, कक्ष से आइसोफ्लुरेन को हटा दें और फुफ्फुसीय वास्कुलचर में रक्त के थक्के को रोकने के लिए पार्श्व पूंछ शिरा के माध्यम से 1,000 यूनिट / एमएल हेपरिन के 1 मिलीलीटर का प्रशासन करें।
  4. जानवर को euthanize करने के लिए, एक अतिरिक्त 15-20 मिनट के लिए जानवर को 5% आइसोफ्लुरेन में उजागर करें। प्रेरण कक्ष से जानवर को हटा दें और इसे सर्जिकल बोर्ड पर एक फेस-अप सुपाइन स्थिति में रखें।
  5. चिपकने वाले टेप का उपयोग करके पैरों और पूंछ को स्थिर करके सर्जिकल बोर्ड पर चूहे को ठीक करें। इसके बाद, 70% आइसोप्रोपाइल अल्कोहल (आईपीए) का उपयोग करके चूहे की गर्दन और छाती के क्षेत्रों को निष्फल करें। त्वचा में कैंची का उपयोग करके 3-4 सेमी चीरा बनाकर उदर गुहा खोलें।
    नोट: कैंची की युक्तियों को ऊपर की ओर इंगित करके त्वचा को गहराई से न काटने के लिए सावधान रहें।
  6. कैंची का उपयोग करके अवर वेना कावा (आईवीसी) को ट्रांसेक्ट करें और एक्सेंगुइनेशन द्वारा इच्छामृत्यु की पुष्टि करें।
  7. गर्दन की मध्यरेखा में कैंची का उपयोग करके एक चीरा बनाकर और श्वासनली को उजागर करके ट्रेकिओटॉमी करें। छाती की दीवार में एक चीरा बनाकर और फेफड़ों से जुड़े श्वासनली के अंत तक पहुंचने के लिए पसलियों के बीच काटने से मिडलाइन थोराकोटॉमी करें। इसके बाद, श्वासनली के दोनों सिरों को काटने और श्वासनली को अलग करने के लिए बाइसेप और कैंची का उपयोग करें।
  8. अलगाव के बाद, 1x फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (1x PBS) के 20 मिलीलीटर का उपयोग करके श्वासनली को कुल्ला करें। श्वासनली को बायराइज्ड बाइसेप्स का उपयोग करके बायोरिएक्टर में स्थानांतरित करें। एक 4-0 सीवन धागे का उपयोग कर Luer कनेक्टर के लिए श्वासनली के दो सिरों को सुरक्षित.
  9. बायोरिएक्टर चैंबर को 5 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर बायोरिएक्टर चैंबर से जुड़े टयूबिंग के माध्यम से प्रोग्राम करने योग्य सिरिंज पंप का उपयोग करके बायोरिएक्टर चैंबर को 5 एमएल संस्कृति माध्यम प्रदान करें।
    नोट: संस्कृति माध्यम Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM), पुनः संयोजक मानव FGF-बुनियादी (0.1 ng / mL), भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS, 10%), और एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक (1%) से बना है।
  10. कसकर एक्रेलिक प्लास्टिक ढक्कन और शिकंजा के साथ बायोरिएक्टर ढक्कन बंद करें। ट्यूबिंग में संस्कृति माध्यम के प्रवाह को रोकने के लिए पुरुष / महिला लुएर प्लग के साथ बायोरिएक्टर चैंबर टयूबिंग कनेक्शन को बंद करें।

3. श्वासनली उपकला के इमेजिंग-निर्देशित हटाने

  1. श्वासनली लुमेन को या तो उज्ज्वल-क्षेत्र या फ्लोरोसेंट में कल्पना करने के लिए, बायोरिएक्टर को इमेजिंग चरण (चित्रा 3 ए) पर रखें।
  2. 1x PBS के साथ CFSE समाधान को पतला करके CFSE सेल लेबलिंग किट में carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) समाधान (एकाग्रता: 100 μM) तैयार करें।
    नोट: मूल CFSE समाधान की एकाग्रता 10 mM (dimethyl sulfoxide (DMSO) में) है।
  3. 5 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर ट्रेकिआ कैनुला से जुड़े टयूबिंग के माध्यम से सिरिंज पंप के माध्यम से श्वासनली पंप के माध्यम से श्वासनली के माध्यम से सीएफएसई समाधान के 500 μL को शामिल करें। जब CFSE समाधान श्वासनली भरता है तो पंप को रोकें। 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, और फिर अवशिष्ट अनिगमित CFSE अभिकर्मक को हटाने के लिए सिरिंज पंप का उपयोग करके 1x PBS के 10 mL के जलसेक द्वारा ट्रेकिआ लुमेन को धोएं।
  4. श्वासनली के एक छोर से जुड़े लुएर कनेक्टर के माध्यम से श्वासनली में GRIN लेंस के डिस्टल इमेजिंग अंत को सम्मिलित करें। फिर, धीरे से श्वासनली के अंदर GRIN लेंस को स्थानांतरित करें जब तक कि श्वासनली की सतह केंद्रित न हो जाए और 20x आवर्धन पर उज्ज्वल क्षेत्र या प्रतिदीप्ति में फ़ोटो और वीडियो लें।
  5. माइक्रो-मैनेजर सॉफ़्टवेयर में उज्ज्वल-फ़ील्ड छवियों को कैप्चर करने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. श्वासनली लुमेन को रोशन करने के लिए पिंजरे के घन के माध्यम से सफेद प्रकाश का परिचय दें। वास्तविक समय में श्वासनली की ल्यूमिनल सतह दिखाने के लिए लाइव आइकन पर क्लिक करें। वांछित मान के लिए एक्सपोज़र समय परिवर्तित करने के लिए एक्सपोज़र > इमेजिंग सेटिंग (ms) का उपयोग करें। इस अध्ययन में, उपयोग किया गया एक्सपोजर समय 10 एमएस और 50 एमएस की सीमा में था।
    2. छवियों के कंट्रास्ट और चमक को समायोजित करने के लिए, इंटरैक्टिव हिस्टोग्राम प्रदर्शन के समापन बिंदु पर काले और सफेद तीर ले जाने के लिए हिस्टोग्राम और तीव्रता स्केलिंग विंडो का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, ऑटो स्ट्रेच विकल्प का उपयोग करें जो सॉफ़्टवेयर को इष्टतम स्तरों पर स्वचालित रूप से चमक और कंट्रास्ट को समायोजित करने की अनुमति देता है।
    3. छवि को फ्रीज करने के लिए स्नैप आइकन पर क्लिक करें। उसके बाद, इच्छित स्वरूप में छवियों को सहेजने के लिए विस्थापित के रूप में छवियों को सेट करना > निर्यात करें का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, छवि को सीधे ImageJ सॉफ़्टवेयर में निर्यात करने और इसे सहेजने के लिए सेटिंग > ImageJ का उपयोग करें.
  6. फ्लोरोसेंट मोड में फ़ोटो और वीडियो प्राप्त करने के लिए, पिंजरे के घन के माध्यम से सीएफएसई-विशिष्ट लेजर लाइट (सीएफएसई: उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: 488 एनएम, उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य: 515 एनएम) के साथ ट्रेकिआ लुमेन को रोशन करें। छवियों को प्राप्त करने के लिए 3.5.2-3.5.3 चरणों का पालन करें। फ़ोटो और वीडियो लेने के बाद, श्वासनली से GRIN लेंस को धीरे से हटा दें।
  7. नीचे वर्णित के रूप में de-epithelialization प्रदर्शन करें।
    1. आसुत (DI) पानी में 2% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (SDS) decellularization समाधान तैयार करें। श्वासनली के माध्यम से 6.3 मिलीलीटर / मिनट की प्रवाह दर पर श्वासनली के माध्यम से एसडीएस के 50 μL को स्थापित करें, ट्रेकिआ कैनुला के माध्यम से सिरिंज पंप का उपयोग करके ट्रेकिआ लुमेन पर डिटर्जेंट समाधान की एक पतली फिल्म उत्पन्न करने के लिए।
    2. पुरुष / महिला ल्यूर प्लग का उपयोग करके बायोरिएक्टर के ट्यूबिंग कनेक्शन को बंद करें और बायोरिएक्टर को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। एसडीएस को 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए श्वासनली के भीतर रहने की अनुमति दें। श्वासनली के माध्यम से एसडीएस समाधान का एक और 50 μL instill और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    3. 3x के लिए 10 mL / मिनट की प्रवाह दर पर सिरिंज पंप के माध्यम से 1x PBS के 500 μL के साथ श्वासनली लुमेन सिंचाई करके lysed उपकला और SDS निकालें। एक शेकर पर बायोरिएक्टर रखें और यांत्रिक रूप से 20 हर्ट्ज आवृत्ति और लगभग 0.3 मिमी के विस्थापन आयाम पर बायोरिएक्टर कंपन करें ताकि श्वासनली लुमेन से एसडीएस-उपचारित उपकला कोशिकाओं की टुकड़ी को शारीरिक रूप से बढ़ावा दिया जा सके।
      नोट: इस अध्ययन में, शेकर को एक सबवूफर स्पीकर, एक सबवूफर प्लेट एम्पलीफायर और एक एक्सेलेरोमीटर को इकट्ठा करके कस्टम-निर्मित किया गया था। एक sinusoidal तरंग एक कंप्यूटर द्वारा उत्पन्न किया गया था और एम्पलीफायर के माध्यम से शेकर में खिलाया गया था, जबकि शेकर की प्रतिक्रिया accelerometer (चित्रा 3 बी) के माध्यम से निगरानी की गई थी। इसके अलावा, पारंपरिक शेकर्स, जैसे कि विद्युत चुम्बकीय और जड़ता शेकर्स, का उपयोग कोशिकाओं की टुकड़ी को बढ़ावा देने के लिए किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, शेकर की आवृत्ति और त्वरण को क्रमशः 20 हर्ट्ज और 0.5 ग्राम पर सेट करें, (0.3 मिमी विस्थापन आयाम के बराबर)।
    4. अवशिष्ट एसडीएस और सेल मलबे को हटाने के लिए ट्रेकिआ लुमेन के माध्यम से दो बार 1x पीबीएस के 500 μL को स्थापित करें, जबकि श्वासनली यंत्रवत् कंपन होती है। उपकला हटाने की प्रक्रिया के बाद, चरण 3.6 (चित्रा 3 सी) के रूप में GRIN लेंस इमेजिंग डिवाइस का उपयोग करके CFSE की तीव्रता को मापकर उपकला परत की निकासी का मूल्यांकन करें।

4. आगे के विश्लेषण के लिए श्वासनली ऊतक तैयारी

  1. उपकला हटाने की पुष्टि करने के लिए, आगे के ऊतक विश्लेषण करें, जैसे कि हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) स्टेनिंग, ट्राइक्रोम, पेंटाक्रोम और इम्यूनोस्टेनिंग। ऐसा करने के लिए, बायोरिएक्टर से ट्रेकिआ को हटा दें, और इसे 4% तटस्थ बफ़र्ड पैराफॉर्मेल्डिहाइड समाधान के 30 मिलीलीटर में 1x PBS (pH = 7.4) में 4 °C पर रात भर ठीक करें।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करके निश्चित श्वासनली ऊतक को निर्जलित और एम्बेड करें।
    1. निर्धारण के बाद, ट्रेकिआ ऊतक को 1x पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ धोएं, श्वासनली को 70% अल्कोहल के 30 मिलीलीटर में स्थानांतरित करें, और इसे रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। एक तेज ब्लेड का उपयोग करके श्वासनली को छोटे बेलनाकार वर्गों (~ 5 मिमी) में काटें और ऊतक एम्बेडिंग कैसेट (लंबाई एक्स चौड़ाई एक्स ऊंचाई: 4 सेमी x 2.5 सेमी x 0.5 सेमी) में ऊतक वर्गों को डालें। प्रत्येक कैसेट में दो श्वासनली वर्गों रखें।
    2. आइसोप्रोपिल अल्कोहल (आईपीए) समाधानों की एक श्रृंखला में वर्गों को निर्जलित करें - 85%, 90%, 95%, 100% - प्रत्येक समाधान के 30 मिलीलीटर में 1 घंटे के लिए। अगला समाधान जोड़ने से पहले पिछले समाधान को निकालें.
    3. पूरा होने पर, ऊतक वर्गों से आईपीए समाधान को पूरी तरह से विस्थापित करने के लिए 2 घंटे के लिए समाशोधन एजेंट (जैसे, जाइलीन) के 30 मिलीलीटर में कैसेट्स को डुबोएं। उचित वेंटिलेशन के साथ एक धुएं हुड में इस कदम को निष्पादित करें।
    4. पैराफिन में कैसेट को 2 घंटे के लिए डुबोएं, और फिर उन्हें पैराफिन में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एम्बेड करें। इसके बाद, पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों को पतले वर्गों (5-8 μm) में काटें, एच एंड ई, ट्राइक्रोम, पेंटाक्रोम और इम्यूनोस्टेनिंग के लिए एक माइक्रोटोम डिवाइस का उपयोग करके।
  3. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) विश्लेषण के लिए ऊतकों को तैयार करने के लिए, 1x PBS (pH = 7.4) में 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड समाधान के 30 mL में श्वासनली को रात भर 4 °C पर ठीक करें। फिर, नीचे दिए गए चरणों का पालन करके SEM के लिए निश्चित श्वासनली ऊतक को निर्जलित करें।
    1. निर्धारण के बाद, 1x PBS के 10 मिलीलीटर के साथ श्वासनली ऊतक कुल्ला। कैंची का उपयोग करके श्वासनली ऊतक को अनुदैर्ध्य रूप से छोटे अर्ध-सिलेंडर वर्गों (लंबाई: ~ 5 मिमी) में काटें और कैसेट में ऊतक वर्गों को डालें।
    2. आईपीए समाधानों की एक श्रृंखला में वर्गों को निर्जलित करें - 35%, 50%, 70%, 85%, 95%, और 100% - प्रत्येक समाधान के 30 मिलीलीटर में 10 मिनट के लिए। अगला समाधान जोड़ने से पहले पिछले समाधान को निकालें.
    3. निम्नलिखित समाधानों में ऊतकों को डुबोकर हेक्सामिथाइलडिसिलाज़ेन (एचएमडीएस) -आधारित सुखाने की विधि निष्पादित करें: 100% आईपीए: एचएमडीएस (2: 1; वी / वी) 10 मिनट के लिए, इसके बाद 100% आईपीए: एचएमडीएस (1: 2; वी / वी) 10 मिनट के लिए, और अंत में रात भर के लिए 100% एचएमडीएस।
      नोट: HMDS विषाक्त है। सभी सुखाने के चरणों के दौरान एक धुएं हुड के तहत काम करें।
    4. HMDS समाधान से ऊतकों को निकालें और उन्हें 1 ज के लिए धुएं हुड के नीचे सूखने की अनुमति दें। एक कार्बन डबल पक्षीय प्रवाहकीय टेप या SEM इमेजिंग के लिए चांदी प्रवाहकीय पेस्ट का उपयोग कर एल्यूमीनियम पिन stubs पर अनुभाग माउंट.

5. बहिर्जात कोशिकाओं के सजातीय वितरण पर denuded श्वासनली लुमेन

  1. चरण 3 में प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक डी-एपिथेलियलाइज्ड चूहा श्वासनली तैयार करें। एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 30 s के लिए जमे हुए मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (एमएससी) को पिघलाएं।
    नोट: इस अध्ययन में, हमने मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) का उपयोग एक मॉडल सेल के रूप में किया ताकि डी-एपिथेलियलाइज्ड ट्रेकिआ पर बहिर्जात कोशिकाओं के वितरण को दिखाया जा सके। आदर्श रूप से, प्राथमिक वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं, बेसल कोशिकाओं, या प्रेरित-मानव प्लुरिपोटेंट कोशिकाओं (आईपीएससी) का उपयोग उपकला पुनर्जनन उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है।
  2. एक हेमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें और 5 x 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता के साथ एक सेल समाधान तैयार करें। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर CFSE समाधान (एकाग्रता: 100 μM) के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को incubating द्वारा फ्लोरोसेंटली लेबल। 3x के लिए 1x PBS के 5 mL के साथ कोशिकाओं को कुल्ला और 3 x 107 कोशिकाओं / mL की अंतिम एकाग्रता पर ताजा संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  3. सेल डिलीवरी के लिए एक वाहन के रूप में हाइड्रोजेल प्री-जेल समाधान तैयार करें। इस अध्ययन के लिए, एमएससी कोशिकाओं के लिए एक वितरण वाहन के रूप में कोलेजन I का उपयोग करें और पूर्व-जेल तैयार करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें। उदाहरण के लिए, 3.6 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन प्री-जेल प्राप्त करने के लिए, 1.5 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में चूहे की पूंछ कोलेजन के नौ हिस्सों के साथ ठंडा न्यूट्रलाइजेशन समाधान का एक हिस्सा मिलाएं। फिर, पर्याप्त मिश्रण के लिए मिश्रण को धीरे से ऊपर और नीचे करें।
    नोट: अन्य biocompatible hydrogels कोलेजन मैं अध्ययन और उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुसार के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. एक बार हाइड्रोजेल समाधान तैयार होने के बाद, कोशिकाओं को वांछित एकाग्रता के साथ समाधान में जल्दी से जोड़ें (उदाहरण के लिए, 5 x 106 कोशिकाएं / एमएल)। एक समान सेल-हाइड्रोजेल मिश्रण प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं और जेल समाधान को माइक्रोपिपेट के साथ धीरे से पिपेट करके मिलाएं।
  5. बायोरिएक्टर के भीतर ट्रेकिआ के एक छोर को एक ल्यूर कनेक्टर के माध्यम से एक प्रोग्राम योग्य सिरिंज पंप पर संलग्न करें। बायोरिएक्टर चैंबर में 37 डिग्री सेल्सियस पर ताजा संस्कृति माध्यम के 5 मिलीलीटर वितरित करने के लिए 5 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर सिरिंज पंप का उपयोग करके श्वासनली की बाहरी सतह को कवर करने के लिए।
  6. श्वासनली लुमेन (चित्रा 4) पर एक सेल-हाइड्रोजेल परत उत्पन्न करने के लिए 5 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर सिरिंज पंप का उपयोग करके बायोरिएक्टर के भीतर डी-एपिथेलियलाइज्ड ट्रेकिआ में सेल-हाइड्रोजेल मिश्रण के 10 μL बोलस का प्रशासन करें (चित्रा 4)।
  7. सेल इंजेक्शन के बाद, बायोरिएक्टर को एक बाँझ सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और जेलेशन के लिए 5% सीओ2 पर रखें। कोलेजन I के लिए, जेलेशन 30 मिनट में होता है।
  8. प्रत्यारोपित कोशिकाओं के वितरण की कल्पना करने के लिए, 70% आईपीए या इथेनॉल के साथ पोंछकर GRIN लेंस को निष्फल करें और बायोरिएक्टर को इमेजिंग चरण पर रखें। आवश्यकतानुसार उज्ज्वल-क्षेत्र और फ्लोरोसेंट मोड दोनों में फ़ोटो और वीडियो लें।
  9. सेल सीडिंग के 30 मिनट के बाद, 1 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर एक सिरिंज पंप का उपयोग करके श्वासनली लुमेन में 1 एमएल संस्कृति माध्यम को शामिल करें।
  10. वांछित समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में बायोरिएक्टर के भीतर सेल-बीज वाली श्वासनली को संस्कृति करें। दीर्घकालिक संस्कृति के लिए, श्वासनली लुमेन और बायोरिएक्टर चैंबर में संस्कृति माध्यम को हर 24 घंटे में ताज़ा करें। सेल संस्कृति के दौरान, मीडिया को लुमेन स्थैतिक के अंदर रखें और इसे हर 24 घंटे में बदलें, जबकि श्वासनली के बाहर का मीडिया लगातार 5 एमएल / मिनट पर एक यूनिडायरेक्शनल प्रवाह के माध्यम से फैल रहा है।
  11. एक निश्चित समय अवधि के लिए कोशिकाओं को कल्चर करने के बाद (उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में 1 और 4 दिन), बायोरिएक्टर से श्वासनली को हटा दें। सेल विकास की निगरानी और सेल घनत्व की गणना के लिए आंतरिक सतहों को उजागर करने के लिए इन विट्रो संस्कृति के दिनों 1 और 4 पर श्वासनली को अनुदैर्ध्य रूप से दो अर्ध-सिलेंडर वर्गों (यानी, ऊपरी और निचले वर्गों) में काटने के लिए कैंची का उपयोग करें। आंतरिक सतहों पर कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए एक पारंपरिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  12. माइक्रो-मैनेजर सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करने के लिए, चरण 3.5 और 3.6 का पालन करें। प्रतिदीप्ति मोड में CFSE-लेबल कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए एक fluorescein isothiocyanate (FITC) फ़िल्टर का उपयोग करें। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप द्वारा ली गई छवियों का विश्लेषण करें और ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके ऊपरी और निचले वर्गों पर सेल घनत्व की गणना करें। कक्षों की संख्या और कक्ष घनत्व की गणना करने के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें.
    1. ImageJ सॉफ़्टवेयर में एक छवि खोलें और छवि को बाइनरी छवि (16-बिट) में कनवर्ट करें , छवि > प्रकार > 16-बिट का उपयोग करके। स्केल सेट करें का उपयोग करके स्केल पट्टी के साथ छवि स्केल सेट > विश्लेषण करें.
    2. गणना करने के लिए कक्षों की संरचनाओं को हाइलाइट करने के लिए छवि की दहलीज को समायोजित करें। > थ्रेशोल्ड समायोजित > छवि का उपयोग करें। कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए कणों का विश्लेषण > का विश्लेषण करें का उपयोग करें। कोशिकाओं की संख्या को छवि के सतह क्षेत्र से विभाजित करके कोशिकाओं के घनत्व की गणना करें।
  13. सेल सीडिंग के बाद व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए, सेल व्यवहार्यता किट का उपयोग करें। इस अध्ययन के लिए, ट्रेकिआ ऊतक और बायोरिएक्टर में कोशिकाओं को 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1x पीबीएस के 1 एमएल में 4 एमएम कैल्सीन-एएम और 2 एमएम एथिडियम होमोडिमर -1 के साथ कोशिकाओं को दाग दें।
  14. 1x PBS के साथ कुल्ला करने के बाद, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं की कल्पना करें। चरण 5.12 में वर्णित चरणों का उपयोग करके जीवित और मृत कक्षों की गणना करें। कुल कोशिकाओं (जीवित और मृत कोशिकाओं दोनों) के प्रति जीवित कोशिकाओं (कैल्सीन-एएम के साथ दाग) के प्रतिशत के रूप में सेल व्यवहार्यता की गणना करें।

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Representative Results

GRIN लेंस-सीटू इमेजिंग मोडलिटी में आधारित सीटू में श्वासनली आंतरिक लुमेन के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति दे सकता है (चित्रा 5 ए)। इस इमेजिंग विधि का उपयोग करते हुए, देशी और डी-एपिथेलियलाइज्ड ट्रेकिया की उज्ज्वल-क्षेत्र और फ्लोरोसेंट छवियों दोनों को प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 5 बी, सी)। सीएफएसई लेबलिंग (चित्रा 5Bii) से पहले देशी श्वासनली से कोई फ्लोरोसेंट सिग्नल नहीं देखा गया था। हालांकि, जब श्वासनली उपकला को सीएफएसई डाई के साथ लेबल किया गया था, तो एक समान फ्लोरोसेंट सिग्नल (हरा) पूरे उपकला (चित्रा 5सीआई) में देखा गया था। एसडीएस और कंपन-सहायता प्राप्त वायुमार्ग सिंचाई के माध्यम से डी-एपिथेलियलाइजेशन के बाद, फ्लोरोसेंट सिग्नल की तीव्रता काफी कम हो गई थी (चित्रा 5Cii), उपकला के एब्लेशन का संकेत देता है।

डी-एपिथेलियलाइज्ड ट्रेकिआ की एच एंड ई छवियों ने ट्रेकिआ लुमेन से स्यूडोस्ट्रैटिफाइड एपिथेलियम को हटाने और अंतर्निहित ऊतक परतों में कोशिकाओं और ईसीएम माइक्रोस्ट्रक्चर के संरक्षण को दिखाया (चित्रा 6 ए)। इसके अलावा, पेंटाक्रोम (चित्रा 6 बी) और ट्राइक्रोम स्टेनिंग (चित्रा 6 सी) ने श्वासनली ऊतक वास्तुकला और ईसीएम घटकों के रखरखाव की पुष्टि की, जैसे कि कोलेजन और प्रोटिओग्लाइकन। इसके अलावा, उपकला कोशिकाओं (उपकला सेल आसंजन अणु, EpCAM) के immunofluorescence; चित्रा 6D) और कोलेजन मैं (चित्रा 6E) उपकला के पूर्ण हटाने और subepithelial ऊतक के भीतर कोलेजन मैं के संरक्षण का पता चला. देशी श्वासनली के एसईएम इमेजिंग से पता चला है कि देशी चूहे की श्वासनली की ल्यूमिनल सतह मुख्य रूप से बहु-सिलिटेड कोशिकाओं और गोब्लेट कोशिकाओं के साथ आबाद थी। दूसरी ओर, डी-एपिथेलियलाइज्ड ट्रेकिआ लुमेन की एसईएम छवियों से पता चला है कि तहखाने की झिल्ली को उजागर किया गया था जैसा कि ईसीएम फाइबर के जाल नेटवर्क और उपकला कोशिकाओं की अनुपस्थिति (चित्रा 6 एफ) द्वारा इंगित किया गया था।

डी-एपिथेलियलाइज्ड चूहे के श्वासनली और फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं का उपयोग करते हुए, हमने जांच की कि क्या सेल डिलीवरी वाहन के रूप में हाइड्रोजेल को शामिल करने से डी-एपिथेलियल ट्रेकियल लुमेन (चित्रा 7 ए, बी) पर सजातीय सेल वितरण प्राप्त हो सकता है। इस अध्ययन में, मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) का उपयोग सेल वितरण और संस्कृति अध्ययन के लिए मॉडल कोशिकाओं के रूप में किया गया था। जैसा कि प्रोटोकॉल (चरण 5) में वर्णित है, हमने एमएससी-लोडेड कोलेजन I प्री-जेल को एक डी-एपिथेलियलाइज्ड चूहा श्वासनली में शामिल किया और GRIN लेंस इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके श्वासनली लुमेन पर कोशिकाओं के वितरण की निगरानी की। एक नियंत्रण प्रयोग के रूप में, हमने संस्कृति माध्यम में एमएससी को निलंबित कर दिया, सेल-लोडेड संस्कृति माध्यम को श्वासनली में संक्रमित किया, और नेत्रहीन रूप से कोशिकाओं के वितरण का निरीक्षण किया। सीटू इमेजिंग परिणामों से पता चला है कि हाइड्रोजेल के माध्यम से वितरित फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाएं संस्कृति माध्यम (चित्रा 7 बी) के माध्यम से बीज वाले लोगों की तुलना में लुमेन में अधिक समान रूप से पालन करती हैं। फिर हमने सेल जलसेक के दौरान कर्तन तनाव के कारण संभावित सेल क्षति और मृत्यु का मूल्यांकन करने के लिए सेल डिलीवरी से पहले और बाद में सेल व्यवहार्यता का परीक्षण किया। परिणाम से पता चला है कि सेल व्यवहार्यता सेल वितरण प्रक्रिया से काफी प्रभावित नहीं हुई थी क्योंकि 90% से अधिक कोशिकाएं व्यवहार्य बनी हुई थीं (चित्रा 7 सी)।

इसके अलावा, हमने 4 दिनों के लिए सेल-बीज वाले ट्रेकिया को सुसंस्कृत किया। कोलेजन और संस्कृति माध्यम (नियंत्रण) दोनों के माध्यम से सीडेड कोशिकाएं डी-एपिथेलियलाइज्ड ट्रेकिआ लुमेन सतह पर फैलती हैं, जैसा कि श्वासनली लुमेन के ऊपरी और निचले आधे हिस्से में समय के साथ सीएफएसई व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की बढ़ी हुई संख्या से संकेत मिलता है (चित्रा 7 डी)। विशेष रूप से, कोलेजन हाइड्रोजेल वितरण समूह में, ऊपरी और निचले लुमेन के बीच कोशिकाओं के घनत्व में अंतर नियंत्रण समूह की तुलना में छोटा था, जो हाइड्रोजेल के माध्यम से सेल वितरण को दर्शाता है जो पूरे ट्रेकिआ लुमेन में सजातीय सेल वितरण को बढ़ावा देता है।

Figure 1
चित्र 1: ट्रेकिआ बायोरिएक्टर का त्रि-आयामी (3D) कंप्यूटर ड्राइंग। (A) (i) साइड व्यू, (ii) शीर्ष दृश्य। (बी) बायोरिएक्टर कक्ष के आयाम। (c) एक पारदर्शी ऐक्रेलिक प्लास्टिक शीट को काट दिया जाता है और शिकंजा का उपयोग करके मुख्य कक्ष के शीर्ष से जोड़ा जाता है। इकाई = मिमी; R = त्रिज्या। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: कस्टम निर्मित माइक्रो फाइबर इमेजिंग चूहे की श्वासनली के सीटू विज़ुअलाइज़ेशन में के लिए. (ए) (i) प्रकाश पथ के इमेजिंग सेटअप घटकों की योजनाबद्ध। संक्षेप: C = कैमरा, TL = ट्यूब लेंस, F = फ़िल्टर, DM = dichroic दर्पण, OL = उद्देश्य लेंस; (ii) इमेजिंग प्रोब (GRIN लेंस) को दर्शाने वाले इमेजिंग सेटअप घटकों की तस्वीर बायोरिएक्टर के लुएर कनेक्टर में डाली जाती है। (बी) योजनाबद्ध दिखा रहा है कि GRIN लेंस बायोरिएक्टर के साथ एकीकृत है। (सी) इमेजिंग जांच को दिखाने वाली एक तस्वीर का उपयोग बायोरिएक्टर के अंदर श्वासनली की कल्पना करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: चूहे की श्वासनली के डी-एपिथेलियलाइजेशन के लिए मंच। (ए) डी-एपिथेलियलाइजेशन और इन सीटू ऑप्टिकल फाइबर इमेजिंग के लिए प्रयोगात्मक सेटअप को दिखाने वाली तस्वीर। (बी) एपिथेलियम हटाने की सुविधा के लिए उपयोग किए जाने वाले कस्टम-निर्मित विद्युत चुम्बकीय शेकर के घटक और असेंबली को दर्शाने वाला आरेख। ω: आवृत्ति, ए: आयाम (सी) योजनाबद्ध चूहे ट्रेकिआ डी-एपिथेलियलाइजेशन प्रक्रिया के वर्कफ़्लो को दिखा रहा है। PBS = फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: हाइड्रोजेल का उपयोग करके डी-एपिथेलियलाइज्ड चूहे की श्वासनली में बहिर्जात कोशिकाओं का वितरण। हाइड्रोजेल समाधान दिखा रहा है जो एक वितरण वाहन के रूप में उपयोग किया जाता है ताकि कोशिकाओं को डी-एपिथेलाइज्ड चूहा श्वासनली के आंतरिक लुमेन पर शीर्ष रूप से जमा किया जा सके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: डी-एपिथेलियलाइज्ड ट्रेकिआ के सीटू इमेजिंग में । (ए) ट्रेकिआ लुमेन की फ्लोरोसेंट इमेजिंग दिखाते हुए फोटोग्राफ, जबकि सीएफएसई-लेबल वाले उपकला ग्रिन लेंस के माध्यम से 488 एनएम नीले लेजर के साथ उत्साहित है। (बी) (i) उज्ज्वल क्षेत्र और (ii) उपकला लेबलिंग से पहले ट्रेकिआ लुमेन की प्रतिदीप्ति छवियां। (सी) (i) देशी और (ii) डी-एपिथेलियलाइज्ड ट्रेकिआ (डी-एपि ट्रेकिआ) की प्रतिदीप्ति छवियां, जबकि उपकला को सीएफएसई फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: Histology, immunofluorescence, और देशी और de-epithelialized चूहे tracheas के SEM विश्लेषण। (ए) एच एंड ई धुंधला। (बी) पेंटाक्रोम धुंधला जहां बैंगनी सेल साइटोप्लाज्म है, नीला सेल नाभिक है, हरा प्रोटिओग्लाइकन (जैसे, म्यूसिन) है, और पीला कोलेजन फाइबर है। (सी) ट्राइक्रोम धुंधला जहां गुलाबी सेल साइटोप्लाज्म है, गहरा नीला सेल नाभिक है, और नीला कोलेजन है। देशी और डी-एपिथेलियलाइज्ड ट्रेकिया की प्रतिदीप्ति छवियां। (D) EpCAM और (E) कोलेजन I. Arrowheads श्वासनली लुमेन की सतह को दिखाते हैं। (एफ) श्वासनली लुमेन के एसईएम माइक्रोग्राफ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: श्वासनली लुमेन में बहिर्जात एमएससी का सामयिक जमाव। (ए) (i) उज्ज्वल क्षेत्र और (ii) डी-एपिथेलियलाइज्ड ट्रेकिआ की प्रतिदीप्ति छवियां। (बी) डी-एपिथेलियलाइज्ड ट्रेकिआ लुमेन की फ्लोरोसेंट छवियां जब इसे (i) पीबीएस और (ii) कोलेजन I प्री-जेल के साथ सीड किया जाता है। श्वासनली लुमेन पर कोशिकाओं का समरूप वितरण तब प्राप्त किया जाता है जब पूर्व-जेल कोलेजन का उपयोग कोशिकाओं के लिए वितरण वाहन के रूप में किया जाता है। (C) (i) फ्लोरोसेंट छवियां और (ii) प्री-जेल कोलेजन द्वारा प्रसव के 6 घंटे से पहले और बाद में कोशिकाओं की मात्रात्मक व्यवहार्यता। n: नमूनों की संख्या। कोशिकाओं की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल के चरण 5.1 और 5.17 का पालन किया गया था। (d) सेल सीडिंग घनत्व (i) 1 दिन और (ii) सेल सीडिंग और संस्कृति के 4 दिनों के बाद मापा जाता है। सेल घनत्व की गणना सेल संख्याओं को जांचे गए सतह क्षेत्र से विभाजित करके की गई थी। सभी मान माध्य ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। विचरण (एनोवा) के एक तरफा विश्लेषण का उपयोग समूहों के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित करने के लिए किया गया था, जिसमें पी < 0.05 को महत्वपूर्ण माना जाता है। संक्षिप्त रूप: सीएम = संस्कृति माध्यम, सी = कोलेजन। * पी < 0.05. ** पी < 0.01. एनएस: महत्वपूर्ण नहीं है। ऊपरी और निचली सतहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर (एनएस) का मतलब है कि श्वासनली की परिधि में समान सेल वितरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस काम में, हमने एक इमेजिंग-निर्देशित बायोरिएक्टर बनाया जो (i) सेल हटाने और बहिर्जात सेल डिलीवरी के बाद सीटू में ट्रेकिआ लुमेन की निगरानी की अनुमति दे सकता है और (ii) सेल-सीडेड ट्रेकिआ ऊतक की लंबी अवधि के इन विट्रो संस्कृति। इस कस्टम-निर्मित बायोरिएक्टर का उपयोग करते हुए, हमने प्रदर्शित किया (i) डिटर्जेंट और कंपन-सहायता प्राप्त वायुमार्ग धोने का उपयोग करके श्वासनली लुमेन से अंतर्जात उपकला कोशिकाओं को चयनात्मक रूप से हटाने और (ii) सेल-लोडेड कोलेजन I प्री-जेल का उपयोग करके डिन्यूडेड ट्रेकिआ की ल्यूमिनल सतह पर बहिर्जात कोशिकाओं का समान वितरण। इसके अलावा, GRIN लेंस-आधारित इमेजिंग रूपरेखा ने सीटू में उपकला को हटाने की पुष्टि की। इसके अलावा, एच एंड ई, ट्राइक्रोम, पेंटाक्रोम, इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग और एसईएम सहित आगे के विश्लेषणों के साथ, हमने उपकला को हटाने और अंतर्निहित ऊतक परतों के वास्तुकला और घटकों के रखरखाव की पुष्टि की। इसके अलावा, नए प्रत्यारोपित बहिर्जात एमएससी के GRIN लेंस-आधारित इमेजिंग ने कोशिकाओं के समान वितरण को दिखाया जब कोलेजन I प्री-जेल का उपयोग डिलीवरी वाहन के रूप में किया गया था। अंत में, प्रत्यारोपित कोशिकाएं बच गईं और डी-एपिथेलियलाइज्ड ट्रेकिआ पर फैल गईं, जो सेल-बीज वाले वायुमार्ग ऊतकों की दीर्घकालिक संस्कृति में बायोरिएक्टर की प्रभावकारिता को उजागर करती हैं।

डी-एपिथेलियलाइजेशन प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम श्वासनली लुमेन में एक पतली डिटर्जेंट समाधान परत बना रहा है। वर्तमान डीसेल्युलराइजेशन प्रोटोकॉल में, रसायनों और एंजाइमों के कई चक्रों का उपयोग लंबी अवधि में किया जा रहा है, कोलेजन फाइबर, ग्लाइकोसामिनोग्लाइकन (जीएजी), प्रोटिओग्लाइकन और चोंड्रोसाइट्स की संख्या को कम करता है, वायुमार्ग पाड़ के जैविक और बायोमैकेनिकल गुणों से समझौता करताहै 19,20,21। दूसरी ओर, ईसीएम जैव रासायनिक और यांत्रिक संकेतों और जीवित रहने, प्रसार, और प्रत्यारोपित बहिर्जात कोशिकाओं के भेदभाव के लिए उपयुक्त भौतिक वातावरण प्रदान करता है 22,23। इस अध्ययन में वर्णित पतली-फिल्म जमाव विधि उपकला एब्लेशन के लिए डिटर्जेंट (50 μL से कम) की एक छोटी राशि का उपयोग करती है, जबकि अंतर्निहित ऊतक परत और उपकला सेलुलर घटकों के संरक्षण की अनुमति देती है। इस अध्ययन में प्रदर्शित डिटर्जेंट-उजागर ऊतक का यांत्रिक कंपन एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है क्योंकि यह लाइस्ड कोशिकाओं की टुकड़ी और निकासी की अनुमति देता है। डिटर्जेंट के लिए उपकला के संपर्क के परिणामस्वरूप सेल मलबे और आंशिक रूप से बाधित कोशिकाओं को केवल धोने के समाधान के साथ श्वासनली में बाढ़ से धोया जाना चुनौतीपूर्ण है। इसलिए, धोने के दौरान श्वासनली को यांत्रिक रूप से कंपन करने से श्वासनली लुमेन से सेल मलबे को साफ करने के लिए पर्याप्त कतरनी बल प्रदान करता है।

सामान्य तौर पर, प्री-जेल-आधारित सेल सीडिंग दृष्टिकोण वितरण की गति, पूर्व-जेल की चिपचिपाहट (जो सीधे पूर्व-जेल एकाग्रता से संबंधित है), सतह तनाव और जेलेशन समय से प्रभावित हो सकता है। विशेष रूप से, पूर्व-जेल तैयारी के दौरान, पूर्व-जेल एकाग्रता को बनाए रखना आवश्यक है जो टयूबिंग में सेल-निलंबित पूर्व-जेल को परिवहन करने के लिए पर्याप्त कम है और श्वासनली की ऊपरी सतह पर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए पर्याप्त उच्च है। इसलिए, विभिन्न सांद्रता का परीक्षण करके प्रत्येक पूर्व-जेल के लिए इष्टतम एकाग्रता खोजने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, सेल-लोडेड प्री-जेल की सफल डिलीवरी सुनिश्चित करने के लिए कम कीमती कोशिकाओं के साथ डिलीवरी की गति जैसी डिलीवरी तकनीक का अभ्यास करें। इसके अलावा, जबकि हमने एमएससी को सेल मॉडल के रूप में प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया (i) एक डिलीवरी वाहन के रूप में प्री-जेल के साथ कोशिकाओं का वितरण और (ii) डिन्यूडेड ट्रेकिआ लुमेन पर नए बीज वाली कोशिकाओं को संवर्धित करने के लिए बायोरिएक्टर सिस्टम की क्षमता, स्टेम कोशिकाओं (जैसे, बेसल कोशिकाओं) और भविष्य के अध्ययनों में प्राथमिक वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं का उपयोग सेल भेदभाव और कार्यात्मक उपकला सेल पुनर्जनन24 का अध्ययन करने की अनुमति दे सकता है, २५ । इसके अलावा, भविष्य के अध्ययनों में कार्यात्मक उपकला की पीढ़ी के लिए बीज कोशिकाओं पर विवो-जैसे कतरनी तनाव उत्पन्न करने के लिए वर्तमान मंच पर एक वायु-तरल इंटरफ़ेस (ALI) जोड़ना शामिल हो सकता है। वर्तमान डिवाइस में ALI जोड़ने के लिए, श्वासनली को हवादार करने के लिए एक छोटे से पशु वेंटिलेटर को ट्रेकिआ इनलेट से जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, ALI को प्राप्त करने के लिए, पतली-फिल्म जमाव विधि का उपयोग सेल-सीडेड ट्रेकिआ में एक संस्कृति मध्यम तरल प्लग को स्थापित करने के लिए किया जा सकता है। तरल फिल्म की मोटाई तरल प्लग वेग26,27 को बदलकर संशोधित किया जा सकता है। प्लग नए बीज कोशिकाओं का पालन करने और श्वासनली लुमेन पर मजबूती से engraft के बाद शुरू किया जा सकता है.

इसके अलावा, सीटू में GRIN लेंस-आधारित इमेजिंग दृष्टिकोण इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है, डी-एपिथेलियलाइजेशन की प्रभावकारिता की पुष्टि करने और नए बीज वाली कोशिकाओं के वितरण की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। पारंपरिक ऊतक विश्लेषण विधियों के विपरीत, जैसे कि हिस्टोलॉजी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस, जिसके लिए विश्लेषण के लिए श्वासनली ऊतक से नमूनों को विच्छेदन की आवश्यकता होती है, हमारे अध्ययन में विकसित इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म डी-एपिथेलियलाइजेशन और सेल डिलीवरी के दौरान वायुमार्ग लुमेन की तेजी से और गैर-विनाशकारी निगरानी की अनुमति देता है। इन सीटू इमेजिंग के दौरान श्वासनली को निष्फल रखने के लिए, श्वासनली लुमेन में पेश करने से पहले इसे 70% आईपीए या इथेनॉल के साथ पोंछकर GRIN लेंस को निष्फल करना सुनिश्चित करें। इसके अलावा, GRIN लेंस का उपयोग करके कोशिकाओं की छवि बनाने के लिए, कोशिकाओं (या तो अंतर्जात श्वासनली उपकला कोशिकाओं या नए प्रत्यारोपित कोशिकाओं) को विभिन्न उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ विभिन्न फ्लोरोसेंट रंजक के साथ लेबल किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए उपयुक्त लेजर लाइट जनरेटर का उपयोग करना सुनिश्चित करें और सही फ़िल्टर लेंस को दोहरे-किनारे सुपर-रिज़ॉल्यूशन डाइक्रोइक दर्पण में एकीकृत करें।

डी-एपिथेलियलाइजेशन, सेल डिलीवरी और इन सीटू इमेजिंग विधियों की नवीनता और नवीनता के बावजूद, इस अध्ययन की कई सीमाएं हैं। इस अध्ययन में वर्णित डी-एपिथेलियलाइजेशन और सेल डिलीवरी विधियां छोटे वायुमार्ग (व्यास: 3-4 मिमी से कम) पर लागू होती हैं जहां सतह तनाव प्रमुख है। एक तरल प्लग बनाना और बड़े वायुमार्गों में डी-एपिथेलियलाइजेशन समाधान या सेल-लोडेड प्री-जेल निलंबन की एक पतली फिल्म बनाना, जैसे कि सूअर और मानव श्वासनली, या ब्रोंची, चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि सतह का तनाव अन्य बलों की तुलना में नगण्य हो जाता है, विशेष रूप से गुरुत्वाकर्षण। इसके अलावा, पतली-फिल्म जमाव दृष्टिकोण का उपयोग करके और समय और एकाग्रता को संशोधित करके, हम एक मजबूत डिटर्जेंट (एसडीएस) के साथ उपकला को कम करने और अंतर्निहित ऊतक परत को संरक्षित करने में सक्षम थे। भविष्य के अध्ययनों में, हालांकि, हल्के डीसेल्युलराइजेशन डिटर्जेंट, जैसे कि 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-प्रोपेनसल्फोनेट (CHAPS)28, या गैर-डिटर्जेंट समाधान, जैसे सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH)29, ईसीएम घटकों के संरक्षण और नए प्रत्यारोपित कोशिकाओं के समर्थन के लिए परीक्षण किया जा सकता है। इसके अलावा, सीएफएसई-लेबल वाली कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति तीव्रता कोशिकाओं के विभाजन के कारण समय के साथ कम हो जाती है। हमारे अध्ययन में, 4 दिनों के लिए डी-एपिथेलियलाइज्ड ट्रेकिया पर सुसंस्कृत एमएससी की फ्लोरोसेंट छवियों ने उनकी प्रतिदीप्ति तीव्रता में काफी कमी दिखाई। लंबे समय तक निगरानी और ऊतक scaffolds पर seeded बहिर्जात कोशिकाओं की ट्रैकिंग के लिए, विभिन्न सेल लेबलिंग विधियां जो कोशिकाओं के दीर्घकालिक या स्थायी फ्लोरोसेंट लेबलिंग की अनुमति दे सकती हैं, आवश्यक होंगी।

हम कल्पना करते हैं कि इस रिपोर्ट में वर्णित इमेजिंग-निर्देशित बायोरिएक्टर प्लेटफ़ॉर्म और सेल हटाने और वितरण प्रोटोकॉल डी-एपिथेलियलाइज्ड वायुमार्ग ऊतक मचानों के निर्माण की अनुमति दे सकते हैं जिनका उपयोग बायोइंजीनियर्ड वायुमार्ग ऊतकों को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। इस तरह के इन विट्रो वायुमार्ग मानव वायुमार्ग रोगों और दवा स्क्रीनिंग के विट्रो मॉडलिंग में उच्च-निष्ठा प्रदान कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, कार्यात्मक वायुमार्ग उपकला स्थापित करने के लिए, वायुमार्ग बेसल स्टेम कोशिकाओं को पहले डी-एपिथेलियलाइज्ड वायुमार्ग ऊतक30 पर प्रत्यारोपित किया जा सकता है। फिर, वायु-तरल इंटरफ़ेस (ALI), जो विभिन्न उपकला कोशिकाओं में बेसल स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है, श्वासनली के भीतर उत्पन्न किया जा सकता है। इसके अलावा, इन सीटू इमेजिंग सिस्टम को संशोधित किया जा सकता है और फेफड़ों के वायुमार्ग विकारों वाले रोगियों के श्वसन पथ को फ्लोरोसेंट रूप से कल्पना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। सीटू में वायुमार्ग के ऊतकों का मूल्यांकन करने के लिए नैदानिक रूप से उपयोग किए जाने के लिए, कठोर GRIN लेंस को वायुमार्ग को नेविगेट करने के लिए लचीले ऑप्टिकल फाइबर इमेजिंग जांच के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। इसके अलावा, हाइड्रोजेल-आधारित सेल सीडिंग का उपयोग करके श्वसन पथ के अंदर कोशिकाओं को सजातीय रूप से वितरित करने की क्षमता रोगियों में क्षतिग्रस्त या घायल उपकला को बदलने का एक अभूतपूर्व अवसर प्रदान कर सकती है। विशेष रूप से, इस अध्ययन में विकसित और उपयोग किए जाने वाले सेल प्रतिस्थापन दृष्टिकोण श्वसन विकारों के इलाज के लिए सेल-आधारित उपचार में तेजी ला सकते हैं, जैसे कि सिस्टिक फाइब्रोसिस और प्राथमिक सिलियरी डिस्किनेसिया, और दाता फेफड़ों की मरम्मत करना जो गंभीर रूप से घायल वायुमार्ग ऊतकों के कारण प्रत्यारोपण के लिए मना कर दिया जाता है 31,32,33,34।

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Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस शोध को अमेरिकन थोरैसिक सोसाइटी फाउंडेशन रिसर्च प्रोग्राम, न्यू जर्सी हेल्थ फाउंडेशन और नेशनल साइंस फाउंडेशन (कैरियर अवार्ड 2143620) द्वारा जे.के.; और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (P41 EB027062) G.V.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1× PBS Gibco, Thermo Fisher Scientific 10-010-031
3-port connector World Precision Instruments 14048-20
4-port connector World Precision Instruments 14047-10
Accelerometer STMicroelectronics IIS3DWBTR
Achromatic doublet Thorlabs AC254-150-A-ML
Aluminum pin stub TED PELLA 16111
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240062
Assembly rod Thorlabs ER1
Button head screws McMaster-Carr 91255A274
Cage cube Thorlabs C4W
Carbon double-sided conductive tape TED PELLA 16073
CFSE labelling kit Abcam ab113853
Citrisolv (clearing agent) Decon 1061
C-mount adapter Thorlabs SM1A9
Collagen I Advanced BioMatrix 5153
Conductive liquid silver paint TED PELLA 16034
Dichroic mirror Semrock DI03-R488 Reflected laser wavelengths:  473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco, Thermo Fisher Scientific 11965118
Female luer bulkhead to hose barb adapter Cole-Parmer EW-45501-30
Female luer to tubing barb Cole-Parmer EW-45508-03
Female to male luer connector Cole-Parmer ZY-45508-80
Fetal bovine serum Gibco, Thermo Fisher Scientific 10082147
Filter lens Chroma Technology Corp ET535/50m
Fluorescent microscope Nikon Eclipse E1000 - D
Fusion 360 Autodesk
Hex nut McMaster-Carr 91813A160
Hexamethyldisilazane (HMDS) Fisher Scientifc AC120585000
Imaging fiber SELFOC, NSG group GRIN lens
Laser Opto Engine MDL-D-488-150mW
Lens tubes Thorlabs SM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) Thermo Fisher Scientific L3224
MACH 3 CNC Control Software Newfangled Solutions
Objective lens Olympus UCPLFLN20X
Peristaltic Pump Cole Parmer L/S standard digital pump system
Recombinant human FGF-basic PeproTech 100-18B
Retaining ring Thorlabs SM1RR
Scientific CMOS camera PCO Panda PCO Panda 4.2
Sodium dodecyl sulfate VWR 97064-472
Solidworks (2019) Dassault Systèmes
Stackable lens tube Thorlabs SM1L10
Subwoofer plate amplifier Dayton Audio SPA250DSP
Subwoofer speaker Dayton Audio RSS21OHO-4 Diaphragm diameter: 21 cm
Syringe Pump World Precision Instruments AL-4000
Threaded cage plate Thorlabs CP33
Threaded luer adapter Cole-Parmer EW-45513-81
Tube lens Thorlabs AC254-150-A-ML
Tygon Tubing Cole-Parmer 13-200-110
XY Translator Thorlabs CXY1

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Bioengineering अंक 182
बायोइंजीनियर्ड वायुमार्ग ऊतक उत्पन्न करने के लिए इमेजिंग-निर्देशित बायोरिएक्टर
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Mir, S. M., Chen, J., Pinezich, M.… More

Mir, S. M., Chen, J., Pinezich, M. R., O’Neill, J. D., Guenthart, B. A., Vunjak-Novakovic, G., Kim, J. Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue. J. Vis. Exp. (182), e63544, doi:10.3791/63544 (2022).

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