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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Bioreattore guidato da imaging per la generazione di tessuto delle vie aeree bioingegnerizzato

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63544
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 4, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Stevens Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 3Department of Cell Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 4Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University

Summary

Il protocollo descrive un bioreattore abilitato all'imaging che consente la rimozione selettiva dell'epitelio endogeno dalla trachea di ratto e la distribuzione omogenea di cellule esogene sulla superficie del lume, seguita da una coltura in vitro a lungo termine del costrutto cellula-tessuto.

Abstract

Lesioni ripetute al tessuto delle vie aeree possono compromettere la funzione polmonare e causare malattie polmonari croniche, come la broncopneumopatia cronica ostruttiva. I progressi nella medicina rigenerativa e nelle tecnologie dei bioreattori offrono l'opportunità di produrre tessuti funzionali cresciuti in laboratorio e costrutti di organi che possono essere utilizzati per lo screening di farmaci, modelli di malattie e sostituzioni di tessuti ingegnerizzate. Qui viene descritto un bioreattore miniaturizzato accoppiato con una modalità di imaging che consente la visualizzazione in situ del lume interno della trachea di ratto espiantata durante la manipolazione e la coltura dei tessuti in vitro . Utilizzando questo bioreattore, il protocollo dimostra la rimozione selettiva guidata dall'imaging di componenti cellulari endogeni preservando le caratteristiche biochimiche intrinseche e l'ultrastruttura della matrice tissutale delle vie aeree. Inoltre, vengono mostrati il rilascio, la distribuzione uniforme e la successiva coltura prolungata di cellule esogene sul lume delle vie aeree decellularizzato con monitoraggio ottico in situ . I risultati evidenziano che il bioreattore guidato dall'imaging può potenzialmente essere utilizzato per facilitare la generazione di tessuti funzionali in vitro delle vie aeree.

Introduction

La superficie luminale delle vie respiratorie è rivestita da uno strato di epitelio costituito principalmente da cellule staminali multi-ciliate, club, calici e basali 1,2. Lo strato epiteliale funge da meccanismo di difesa primario del polmone, agendo come una barriera biofisica che protegge il tessuto delle vie aeree sottostante da agenti patogeni inalati, particolato o gas chimici. Protegge il tessuto delle vie aeree attraverso molteplici meccanismi, tra cui la formazione di giunzioni strette intercellulari, la clearance mucociliare e la secrezione antimicrobica e antiossidante 3,4. L'epitelio difettoso delle vie aeree è associato a malattie respiratorie devastanti, come la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO)5, la discinesia ciliare primaria (PCD)6 e la fibrosi cistica (CF)7.

I progressi nella tecnologia lung-on-chip (LOC) rappresentano un'opportunità per studiare lo sviluppo del polmone umano, modellare varie malattie polmonari e sviluppare nuovi materiali terapeutici in ambienti in vitro strettamente regolamentati. Ad esempio, l'epitelio e l'endotelio delle vie aeree possono essere coltivati su lati opposti di una membrana sottile e porosa per imitare il tessuto polmonare che scambia gas, consentendo una fedele modellazione della malattia e test antidroga8. Allo stesso modo, sono stati creati modelli di malattia in vitro per modellare le malattie delle vie aeree in vitro, come la BPCO9 e la fibrosi cistica10. Tuttavia, una delle principali sfide dei dispositivi LOC è ricapitolare la complessa architettura tridimensionale (3D) del tessuto polmonare e le interazioni dinamiche della matrice cellula-tessuto in vitro11.

Recentemente sono state sviluppate metodologie innovative di ingegneria tissutale che consentono la manipolazione di tessuti polmonari ex vivo 12. Utilizzando queste metodologie, gli innesti di tessuto allogenico o xenogenico denudato possono essere preparati rimuovendo le cellule endogene dal tessuto polmonare tramite trattamenti chimici, fisici e meccanici13. Inoltre, la matrice extracellulare del tessuto nativo conservato (ECM) negli scaffold polmonari decellularizzati fornisce i segnali strutturali, biochimici e biomeccanici fisio-mimetici per le cellule impiantate per attaccare, proliferare e differenziare14,15.

Qui, viene riportato un sistema di bioreattore guidato da imaging creato combinando tecnologie LOC e di ingegneria tissutale per consentire la manipolazione tissutale in vitro e la coltura di tessuti tracheali di ratto espiantati. Utilizzando questo bioreattore del tessuto delle vie aeree, il protocollo dimostra la rimozione selettiva delle cellule epiteliali endogene senza interrompere i componenti cellulari e biochimici subepiteliali sottostanti del tessuto delle vie aeree. Successivamente mostriamo la distribuzione omogenea e la deposizione istantanea delle cellule esogene appena seminate, come le cellule staminali mesenchimali (MSC), sul lume delle vie aeree denudato instillando la soluzione pre-gel di collagene I caricata con cellule. Inoltre, utilizzando il dispositivo di imaging micro-ottico integrato nel bioreattore, viene eseguita anche la visualizzazione del lume della trachea durante la rimozione dell'epitelio e la consegna delle cellule endogene. Inoltre, è dimostrato che la trachea e le cellule appena impiantate possono essere coltivate nel bioreattore senza morte cellulare evidente e degradazione tissutale per 4 giorni. Immaginiamo che la piattaforma di bioreattori abilitata per l'imaging, la tecnica di deepitelializzazione basata su film sottile e il metodo di consegna cellulare utilizzato in questo studio possano essere utili per generare tessuti delle vie aeree per la modellazione in vitro della malattia e lo screening farmacologico.

Il bioreattore comprende una camera rettangolare collegata a una pompa a siringa programmabile, una pompa di perfusione e un ventilatore per la coltivazione di trachee di ratto isolate. Il bioreattore presenta ingressi e uscite collegati alla trachea o alla camera di coltura tissutale per fornire separatamente reagenti (ad esempio, terreni di coltura) agli spazi interni ed esterni della trachea (Figura 1). Un sistema di imaging personalizzato può essere utilizzato per visualizzare l'interno della trachea di ratto coltivata in vitro a livello cellulare (Figura 2). L'epitelio endogeno della trachea viene rimosso attraverso l'instillazione di una soluzione di decellularizzazione a base di detergente seguita da lavaggio delle vie aeree assistito da vibrazioni (Figura 3). La soluzione di idrogel, come il collagene di tipo I, viene utilizzata come veicolo di consegna per la semina di cellule esogene in modo uniforme e istantaneo attraverso il lume della trachea denudato (Figura 4). Tutti i materiali utilizzati per costruire il bioreattore e condurre gli esperimenti sono forniti nella Tabella dei materiali.

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Protocol

Il protocollo sui tessuti animali di seguito è stato approvato dalle linee guida e dai regolamenti sul benessere degli animali dell'Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) presso lo Stevens Institute of Technology ed è conforme alle linee guida del National Institutes of Health (NIH) per l'uso di animali da esperimento.

1. Progettazione e costruzione di bioreattori per trachee di ratto guidati da imaging

  1. Progettazione e fabbricazione di bioreattori di trachea di ratto
    1. Creare un modello CAD (Computer-Aided Design) della camera del bioreattore con progettazione pertinente, ad esempio ingressi, uscite e camera di coltura tissutale, utilizzando il software del generatore CAD. Per questo studio, utilizzare la geometria e le dimensioni presentate nella Figura 1A-C. Il tutorial del software del generatore CAD può essere trovato in16,17.
    2. Esportare il modello CAD generato in un software di controllo numerico (CNC) e tagliare la plastica in politetrafluoroetilene (PTFE) utilizzando una macchina CNC per creare la camera del bioreattore. Il tutorial del software del controller CNC può essere trovato in18.
      NOTA: Oltre al PTFE, altri materiali plastici, come il polietilene ad altissimo peso molecolare (UHMWPE) e la polieterimmide possono essere utilizzati per fabbricare la camera di coltura.
    3. Sterilizzare tutti i componenti del bioreattore, come adattatori Luer e viti, per evitare la contaminazione dei tessuti e delle cellule coltivate nel dispositivo. Assemblare tutti i componenti del bioreattore nella camera di coltura tissutale principale in un ambiente pulito (Figura 1A).
  2. Costruzione di un dispositivo di imaging basato su lenti con indice di gradiente (GRIN)
    1. Per creare il dispositivo di imaging in situ , inserire una lente tubolare in un tubo impilabile e fissarla utilizzando un anello di fissaggio. Montare il gruppo obiettivo-tubo su una telecamera CMOS scientifica tramite un adattatore C-mount.
    2. Utilizzare software, come Micro-Manager, per utilizzare la fotocamera e acquisire foto e video. Puntare un oggetto situato a lunga distanza (ad esempio, a 10 m dalla fotocamera) e regolare la distanza tra l'obiettivo valvolare e il sensore di imaging della fotocamera fino a quando non si forma un'immagine focalizzata dell'oggetto sullo schermo del computer dal software di imaging utilizzato.
    3. Montare una lente filtrante su uno specchio dicroico a doppia risoluzione a super-risoluzione e un laser sul dispositivo utilizzando componenti del sistema di gabbia ottica, tra cui asta di assemblaggio, piastra di gabbia filettata e cubo di gabbia.
    4. Collegare l'obiettivo (20x) al dispositivo. Montare una lente GRIN (diametro = 500 μm) all'estremità distale del tubo dell'obiettivo tramite il traduttore XY. Regolare la distanza tra l'obiettivo GRIN e l'obiettivo per formare immagini microscopiche focalizzate (Figura 2A,B).

2. Isolamento della trachea del ratto

  1. Sanificare l'area chirurgica e sterilizzare gli strumenti chirurgici utilizzando un'autoclave a 121 °C per 30 minuti prima dell'intervento.
  2. Metti un topo nella camera di induzione e fornisci il 2,5% di isoflurano per 15 minuti usando un piccolo vaporizzatore per anestetizzare l'animale. Valutare la profondità dell'anestesia con il riflesso del pedale. Per fare questo, pizzicare saldamente la punta e confermare che l'animale non risponde al pizzico della punta.
  3. Dopo l'anestesia, rimuovere l'isoflurano dalla camera e somministrare 1 mL di 1.000 unità / mL di eparina attraverso la vena laterale della coda per prevenire la coagulazione del sangue nella vascolarizzazione polmonare.
  4. Per l'eutanasia dell'animale, esporre l'animale al 5% di isoflurano per altri 15-20 minuti. Rimuovere l'animale dalla camera di induzione e posizionarlo sulla lavagna chirurgica in posizione supina a faccia in su.
  5. Fissare il ratto sulla lavagna chirurgica immobilizzando le gambe e la coda con nastro adesivo. Successivamente, sterilizzare le regioni del collo e del torace del ratto utilizzando il 70% di alcol isopropilico (IPA). Aprire la cavità addominale facendo un'incisione di 3-4 cm usando le forbici nella pelle.
    NOTA: Fare attenzione a non tagliare la pelle in profondità puntando le punte delle forbici verso l'alto.
  6. Transect la vena cava inferiore (IVC) usando le forbici e confermare l'eutanasia con dissanguamento.
  7. Eseguire la tracheotomia facendo un'incisione usando le forbici nella linea mediana del collo ed esponendo la trachea. Eseguire la toracotomia della linea mediana facendo un'incisione nella parete toracica e tagliando tra le costole per raggiungere l'estremità della trachea collegata al polmone. Quindi, utilizzare un bicipite e forbici per tagliare entrambe le estremità della trachea e isolare la trachea.
  8. Dopo l'isolamento, sciacquare la trachea con 20 ml di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS). Trasferire la trachea al bioreattore utilizzando bicipiti sterilizzati. Fissare le due estremità della trachea al connettore Luer utilizzando una filettatura 4-0.
  9. Erogare 5 mL di terreno di coltura alla camera del bioreattore utilizzando la pompa a siringa programmabile attraverso il tubo collegato alla camera del bioreattore ad una portata di 5 ml/min.
    NOTA: Il terreno di coltura è composto dal mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco (DMEM), FGF-basic umano ricombinante (0,1 ng/mL), siero bovino fetale (FBS, 10%) e antibiotico-antimicotico (1%).
  10. Chiudere ermeticamente il coperchio del bioreattore con il coperchio in plastica acrilica e le viti. Chiudere i collegamenti dei tubi della camera del bioreattore con i tappi Luer maschio/femmina per impedire il flusso del terreno di coltura nel tubo.

3. Rimozione guidata da imaging dell'epitelio tracheale

  1. Per visualizzare il lume della trachea in campo luminoso o fluorescente, posizionare il bioreattore sullo stadio di imaging (Figura 3A).
  2. Preparare la soluzione di estere di carbossifluoresceina succinimidil (CFSE) (concentrazione: 100 μM) nel kit di etichettatura delle cellule CFSE diluendo la soluzione CFSE con 1x PBS.
    NOTA: La concentrazione della soluzione originale di CFSE è di 10 mM (in dimetilsolfossido (DMSO)).
  3. Infondere 500 μL della soluzione CFSE attraverso la trachea attraverso la pompa della siringa attraverso il tubo collegato alla cannula tracheale ad una portata di 5 ml/min. Arrestare la pompa quando la soluzione CFSE riempie la trachea. Attendere 10 minuti, quindi lavare il lume della trachea mediante infusione di 10 ml di 1x PBS utilizzando la pompa della siringa per rimuovere il reagente CFSE residuo non incorporato.
  4. Inserire l'estremità di imaging distale della lente GRIN nella trachea tramite il connettore Luer collegato a un'estremità della trachea. Quindi, spostare delicatamente l'obiettivo GRIN all'interno della trachea fino a quando la superficie della trachea non è messa a fuoco e scattare foto e video in campo luminoso o fluorescenza con ingrandimento 20x.
  5. Per acquisire immagini in campo luminoso nel software Micro-Manager, attenersi alla seguente procedura.
    1. Introdurre la luce bianca attraverso il cubo della gabbia per illuminare il lume della trachea. Fare clic sull'icona Live per mostrare la superficie luminale della trachea in tempo reale. Utilizzare Imaging Setting > Exposure (ms) per modificare il tempo di esposizione al valore desiderato. In questo studio, il tempo di esposizione utilizzato era compreso tra 10 ms e 50 ms.
    2. Per regolare il contrasto e la luminosità delle immagini, utilizzare la finestra Istogramma e ridimensionamento intensità per spostare le frecce in bianco e nero all'estremità della visualizzazione interattiva dell'istogramma. In alternativa, utilizzare l'opzione Auto Stretch che consente al software di regolare automaticamente la luminosità e il contrasto a livelli ottimali.
    3. Fare clic sull'icona Snap per bloccare l'immagine. Quindi, utilizzare Impostazione > Esporta immagini come spostate per salvare le immagini nel formato desiderato. In alternativa, utilizzare Impostazioni > ImageJ per esportare direttamente l'immagine nel software ImageJ e salvarla.
  6. Per ottenere foto e video in modalità fluorescente, illuminare il lume della trachea con luce laser specifica CFSE (CFSE: lunghezza d'onda di eccitazione: 488 nm, lunghezza d'onda di emissione: 515 nm) attraverso il cubo della gabbia. Seguire i passaggi 3.5.2-3.5.3 per acquisire le immagini. Dopo aver scattato foto e video, rimuovere delicatamente l'obiettivo GRIN dalla trachea.
  7. Eseguire la deepitetalizzazione come descritto di seguito.
    1. Preparare la soluzione di decellularizzazione del dodecil solfato di sodio al 2% (SDS) in acqua distillata (DI). Instillare 50 μL di SDS attraverso la trachea ad una portata di 6,3 ml/min, utilizzando la pompa della siringa attraverso la cannula della trachea per generare un film sottile della soluzione detergente sul lume della trachea.
    2. Chiudere i collegamenti dei tubi del bioreattore utilizzando tappi Luer maschio/femmina e trasferire il bioreattore in un incubatore. Lasciare che la SDS rimanga all'interno della trachea per 10 minuti a 37 °C. Instillare altri 50 μL di soluzione SDS attraverso la trachea e incubare per 10 minuti.
    3. Rimuovere l'epitelio lisato e la SDS irrigando il lume della trachea con 500 μL di 1x PBS tramite pompa a siringa ad una portata di 10 mL/min per 3x. Posizionare il bioreattore su uno shaker e far vibrare meccanicamente il bioreattore a una frequenza di 20 Hz e un'ampiezza di spostamento di circa 0,3 mm per favorire fisicamente il distacco delle cellule epiteliali trattate con SDS dal lume della trachea.
      NOTA: in questo studio, lo shaker è stato costruito su misura assemblando un altoparlante subwoofer, un amplificatore a piastra subwoofer e un accelerometro. Una forma d'onda sinusoidale è stata generata da un computer e immessa nello shaker tramite l'amplificatore , mentre la risposta dello shaker è stata monitorata tramite l'accelerometro (Figura 3B). Inoltre, gli scuotitori convenzionali, come gli scuotitori elettromagnetici e inerziali, possono essere utilizzati per promuovere il distacco delle cellule. Per fare ciò, impostare la frequenza e l'accelerazione dello shaker su 20 Hz e 0,5 g, rispettivamente (equivalente all'ampiezza di spostamento di 0,3 mm).
    4. Instillare 500 μL di 1x PBS due volte attraverso il lume della trachea per rimuovere la SDS residua e i detriti cellulari mentre la trachea viene vibrata meccanicamente. Seguendo la procedura di rimozione dell'epitelio, valutare la clearance dello strato epiteliale misurando l'intensità della CFSE utilizzando il dispositivo di imaging con lente GRIN come nel passaggio 3.6 (Figura 3C).

4. Preparazione del tessuto tracheale per ulteriori analisi

  1. Per confermare la rimozione dell'epitelio, eseguire ulteriori analisi tissutali, come la colorazione di ematossilina ed eosina (H & E), tricromo, pentacromo e immunocolorazione. Per fare ciò, rimuovere la trachea dal bioreattore e fissarla in 30 ml di soluzione di paraformaldeide tamponata neutra al 4% in 1x PBS (pH = 7,4) a 4 °C durante la notte.
  2. Disidratare e incorporare il tessuto tracheale fisso seguendo i passaggi seguenti.
    1. Dopo la fissazione, lavare il tessuto tracheale con 10 ml di 1x PBS, trasferire la trachea a 30 mL di alcol al 70% e mantenerlo a 4 °C durante la notte. Tagliare la trachea in piccole sezioni cilindriche (~5 mm) usando una lama affilata e inserire le sezioni di tessuto nelle cassette di incorporamento del tessuto (lunghezza x larghezza x altezza: 4 cm x 2,5 cm x 0,5 cm). Tenere due sezioni di trachea in ogni cassetta.
    2. Disidratare le sezioni in una serie di soluzioni di alcol isopropilico (IPA) - 85%, 90%, 95%, 100% - per 1 ora in 30 ml di ciascuna soluzione. Rimuovere la soluzione precedente prima di aggiungere la soluzione successiva.
    3. Al termine, immergere le cassette in 30 mL di agente di compensazione (ad esempio, xilene) per 2 ore per spostare completamente la soluzione IPA dalle sezioni di tessuto. Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante con una corretta ventilazione.
    4. Immergere le cassette in paraffina per 2 ore, quindi incorporarle in paraffina a 4 °C durante la notte. Quindi, tagliare i tessuti incorporati nella paraffina in sezioni sottili (5-8 μm) utilizzando un dispositivo microtome per H & E, tricromo, pentacromo e immunocolorazione.
  3. Per preparare i tessuti per l'analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM), fissare la trachea in 30 ml di soluzione di glutaraldeide al 2,5% in 1x PBS (pH = 7,4) a 4 °C durante la notte. Quindi, disidratare il tessuto tracheale fisso per SEM seguendo i passaggi seguenti.
    1. Dopo la fissazione, sciacquare il tessuto tracheale con 10 ml di 1x PBS. Tagliare longitudinalmente il tessuto tracheale in piccole sezioni semicilindriche (lunghezza: ~ 5 mm) usando le forbici e inserire le sezioni di tessuto nelle cassette.
    2. Disidratare le sezioni in una serie di soluzioni IPA - 35%, 50%, 70%, 85%, 95% e 100% - per 10 minuti in 30 ml di ciascuna soluzione. Rimuovere la soluzione precedente prima di aggiungere la soluzione successiva.
    3. Eseguire il metodo di essiccazione a base di esametildisillazano (HMDS) immergendo i tessuti nelle seguenti soluzioni: 100% IPA: HMDS (2:1; v/v) per 10 min, seguito da 100% IPA: HMDS (1:2; v/v) per 10 min e infine 100% HMDS per la notte.
      NOTA: HMDS è tossico. Lavorare sotto una cappa aspirante durante tutte le fasi di asciugatura.
    4. Rimuovere i tessuti dalla soluzione HMDS e lasciarli asciugare sotto la cappa aspirante per 1 ora. Montare la sezione su perni in alluminio utilizzando un nastro conduttivo bifacciale in carbonio o una pasta conduttiva argentata per l'imaging SEM.

5. Distribuzione omogenea delle cellule esogene sul lume tracheale denudato

  1. Preparare una trachea di ratto deepilelializzata utilizzando il protocollo nel passaggio 3. Scongelare le cellule staminali mesenchimali congelate (MSC) per 30 s a bagnomaria a 37 °C.
    NOTA: In questo studio, abbiamo usato cellule staminali mesenchimali (MSC) come cellula modello per mostrare la distribuzione delle cellule esogene sulla trachea deepitelializzata. Idealmente, le cellule epiteliali primarie delle vie aeree, le cellule basali o le cellule pluripotenti umane indotte (iPSC) possono essere utilizzate per scopi di rigenerazione dell'epitelio.
  2. Contare le cellule con un emocitometro e preparare una soluzione cellulare con una concentrazione di 5 x 106 cellule/ml. Etichettare le cellule in modo fluorescente incubando le cellule con 2 mL di soluzione di CFSE (concentrazione: 100 μM) a temperatura ambiente per 15 min. Risciacquare le cellule con 5 mL di 1x PBS per 3x e risospese le cellule in terreno di coltura fresco ad una concentrazione finale di 3 x 107 cellule/mL.
  3. Preparare la soluzione di pre-gel idrogel come veicolo per la consegna delle cellule. Per questo studio, utilizzare il collagene I come veicolo di consegna per le cellule MSC e seguire le istruzioni del produttore per preparare il pre-gel. Ad esempio, per ottenere 3,6 mg/mL di collagene pre-gel, mescolare una parte della soluzione di neutralizzazione refrigerata con nove parti del collagene della coda di ratto in un tubo sterile da 1,5 ml. Quindi, pipettare delicatamente la miscela su e giù per un'adeguata miscelazione.
    NOTA: Altri idrogel biocompatibili possono essere utilizzati al posto del collagene I in base allo studio e alle esigenze dell'utente.
  4. Una volta preparata la soluzione di idrogel, aggiungere rapidamente le cellule alla soluzione con la concentrazione desiderata (ad esempio, 5 x 106 celle/ml). Per ottenere una miscela uniforme di cellule-idrogel, mescolare le cellule e la soluzione di gel tubando delicatamente con una micropipetta.
  5. Collegare un'estremità della trachea all'interno del bioreattore a una pompa a siringa programmabile tramite un connettore Luer. Erogare 5 mL di terreno di coltura fresco a 37 °C nella camera del bioreattore per coprire la superficie esterna della trachea utilizzando la pompa della siringa ad una portata di 5 ml/min.
  6. Somministrare un bolo da 10 μL della miscela cellula-idrogel nella trachea deepilealizzata all'interno del bioreattore utilizzando la pompa della siringa ad una portata di 5 ml/min per generare uno strato di idrogel cellulare sul lume della trachea (Figura 4).
  7. Dopo l'iniezione cellulare, posizionare il bioreattore in un incubatore di colture cellulari sterile a 37 °C e al 5% di CO2 per la gelificazione. Per il collagene I, la gelificazione avviene in 30 minuti.
  8. Per visualizzare la distribuzione delle cellule impiantate, sterilizzare la lente GRIN pulendo con IPA al 70% o etanolo e posizionare il bioreattore sulla fase di imaging. Scatta foto e video in entrambe le modalità a campo luminoso e fluorescente, se necessario.
  9. Dopo 30 minuti di semina cellulare, infondere 1 mL di terreno di coltura nel lume della trachea utilizzando una pompa a siringa ad una portata di 1 mL/min.
  10. Coltivare la trachea a seme cellulare all'interno del bioreattore in un incubatore a 37 °C per il tempo desiderato. Per la coltura a lungo termine, aggiornare il terreno di coltura nel lume della trachea e nella camera del bioreattore ogni 24 ore. Durante la coltura cellulare, mantenere statico il fluido all'interno del lume e cambiarlo ogni 24 ore, mentre il fluido all'esterno della trachea viene continuamente perfuso tramite un flusso unidirezionale a 5 ml / min.
  11. Dopo aver coltivato le cellule per un certo periodo di tempo (ad esempio, 1 e 4 giorni in questo studio), rimuovere la trachea dal bioreattore. Utilizzare le forbici per tagliare longitudinalmente la trachea in due sezioni semicilindriche (cioè sezioni superiore e inferiore) nei giorni 1 e 4 della coltura in vitro per esporre le superfici interne per il monitoraggio della crescita cellulare e il calcolo della densità cellulare. Utilizzare un microscopio fluorescente convenzionale per visualizzare le cellule sulle superfici interne.
  12. Per acquisire le immagini utilizzando il software Micro-Manager, attenersi ai passaggi 3.5 e 3.6. Utilizzare un filtro isotiocianato di fluoresceina (FITC) per visualizzare le cellule marcate CON CFSE in modalità fluorescenza. Analizza le immagini scattate dal microscopio fluorescente e calcola le densità cellulari sulle sezioni superiore e inferiore utilizzando il software ImageJ. Per calcolare il numero di celle e la densità delle celle, attenersi alla seguente procedura.
    1. Aprire un'immagine nel software ImageJ e convertirla in un'immagine binaria (16 bit) utilizzando Image > Type > 16-bit. Impostare la scala dell'immagine con la barra di scala utilizzando Analizza > Imposta scala.
    2. Regolare la soglia dell'immagine per evidenziare le strutture delle celle da contare. Usa Immagine > Regola > soglia. Utilizzare Analizza > Analizza particelle per contare il numero di celle. Calcolare la densità delle celle dividendo il numero di celle per la superficie dell'immagine.
  13. Per valutare la vitalità dopo la semina cellulare, utilizzare un kit di vitalità cellulare. Per questo studio, incubare il tessuto tracheale e le cellule nel bioreattore a 37 °C per 6 ore e colorare le cellule con 4 mM calceina-AM e 2 mM etidium homodimer-1 in 1 mL di 1x PBS a temperatura ambiente per 15 min.
  14. Dopo il risciacquo con 1x PBS, visualizzare le cellule utilizzando un microscopio fluorescente. Contare le cellule vive e morte utilizzando i passaggi descritti nel passaggio 5.12. Calcolare la vitalità cellulare come percentuale di cellule vive (colorate con calceina-AM) per cellule totali (sia cellule vive che morte).

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Representative Results

La modalità di imaging in situ basata su lenti GRIN può consentire la visualizzazione del lume interno tracheale in situ (Figura 5A). Utilizzando questo metodo di imaging, è possibile ottenere sia immagini a campo luminoso che fluorescenti delle trachee native e deepilelializzate (Figura 5B,C). Nessun segnale fluorescente è stato osservato dalla trachea nativa prima dell'etichettatura CFSE (Figura 5Bii). Tuttavia, quando l'epitelio tracheale è stato etichettato con colorante CFSE, è stato osservato un segnale fluorescente uniforme (verde) in tutto l'epitelio (Figura 5Ci). A seguito della deepitelializzazione tramite SDS e irrigazione delle vie aeree assistita da vibrazioni, l'intensità del segnale fluorescente è diminuita significativamente (Figura 5Cii), indicando l'ablazione dell'epitelio.

Le immagini H&E della trachea deepitelializzata hanno mostrato la rimozione dell'epitelio pseudostratificato dal lume della trachea e la conservazione delle cellule e della microstruttura ECM negli strati tissutali sottostanti (Figura 6A). Inoltre, la colorazione pentacromo (Figura 6B) e tricromo (Figura 6C) ha confermato il mantenimento dell'architettura del tessuto tracheale e dei componenti ECM, come collagene e proteoglicani. Inoltre, immunofluorescenza di cellule epiteliali (molecola di adesione delle cellule epiteliali, EpCAM; Figura 6D) e il collagene I (Figura 6E) hanno rivelato la completa rimozione dell'epitelio e la conservazione del collagene I all'interno del tessuto subepiteliale. L'imaging SEM della trachea nativa ha mostrato che la superficie luminale della trachea di ratto nativo era popolata principalmente da cellule multi-ciliate e cellule caliciformi. D'altra parte, le immagini SEM del lume della trachea deepitelializzato hanno mostrato che la membrana basale era esposta come indicato da una rete a rete di fibre ECM e dall'assenza di cellule epiteliali (Figura 6F).

Utilizzando trachee di ratto deepilelializzate e cellule marcate fluorescentemente, abbiamo studiato se l'incorporazione di un idrogel come veicolo di consegna cellulare potesse ottenere una distribuzione cellulare omogenea sul lume tracheale deepitelializzato (Figura 7A, B). In questo studio, le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state utilizzate come cellule modello per lo studio di consegna e coltura cellulare. Come descritto nel protocollo (fase 5), abbiamo instillato il pre-gel di collagene I caricato con MSC in una trachea di ratto deepitelializzata e monitorato la distribuzione delle cellule sul lume tracheale utilizzando il sistema di imaging della lente GRIN. Come esperimento di controllo, abbiamo sospeso le MSC nel terreno di coltura, infuso il terreno di coltura caricato dalle cellule nella trachea e ispezionato visivamente la distribuzione delle cellule. I risultati dell'imaging in situ hanno mostrato che le cellule marcate fluorescentemente erogate tramite idrogel sono rimaste aderenti in modo più uniforme attraverso il lume rispetto a quelle seminate tramite terreno di coltura (Figura 7B). Abbiamo quindi testato la vitalità cellulare prima e dopo la consegna cellulare per valutare il potenziale danno cellulare e la morte a causa dello stress da taglio durante l'infusione cellulare. Il risultato ha mostrato che la vitalità cellulare non è stata influenzata in modo significativo dalla procedura di consegna cellulare poiché oltre il 90% delle cellule è rimasto vitale (Figura 7C).

Inoltre, abbiamo coltivato le trachee con semi cellulari per 4 giorni. Le cellule seminate sia attraverso il collagene che il terreno di coltura (controllo) proliferarono sulla superficie del lume tracheale deepilealizzato come indicato dall'aumento del numero di cellule che esprimono CFSE nel tempo sia nella metà superiore che in quella inferiore del lume tracheale (Figura 7D). In particolare, nel gruppo di rilascio dell'idrogel di collagene, la differenza nella densità delle cellule tra i lumen superiore e inferiore era inferiore a quella del gruppo di controllo, indicando che la consegna cellulare tramite idrogel promuove una distribuzione cellulare omogenea in tutto il lume della trachea.

Figure 1
Figura 1: Disegno tridimensionale (3D) al computer del bioreattore della trachea. (A) (i) vista laterale, (ii) vista dall'alto. (B) Le dimensioni della camera del bioreattore. (C) Un foglio di plastica acrilica trasparente viene tagliato e fissato alla parte superiore della camera principale utilizzando viti. Unità = mm; R = raggio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Imaging in microfibra personalizzato per la visualizzazione in situ della trachea del ratto. (A) (i) Schema dei componenti di configurazione dell'imaging del percorso luminoso. Abbreviazioni: C = fotocamera, TL = obiettivo valvolare, F = filtro, DM = specchio dicroico, OL = obiettivo obiettivo; (ii) la fotografia dei componenti di configurazione dell'imaging che mostrano la sonda di imaging (lente GRIN) è inserita nel connettore Luer del bioreattore. (B) Schema che dimostri che la lente GRIN è integrata con il bioreattore. (C) Una fotografia che mostra la sonda di imaging viene utilizzata per visualizzare la trachea all'interno del bioreattore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: La piattaforma per la deepitelializzazione della trachea di ratto. (A) Fotografia che mostra la configurazione sperimentale per la deepitelializzazione e l'imaging in fibra ottica in situ . (B) Diagramma che mostra il componente e l'assemblaggio dello scuotitore elettromagnetico costruito su misura utilizzato per facilitare la rimozione dell'epitelio. ω: frequenza, a: ampiezza (C) Schema che mostra il flusso di lavoro della procedura di deepitetalizzazione della trachea di ratto. PBS = soluzione salina tamponata con fosfato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Consegna di cellule esogene in trachea di ratto deepilelializzata usando idrogel. Schema che mostra la soluzione di idrogel utilizzata come veicolo di consegna per depositare localmente le cellule sul lume interno della trachea di ratto de-epitelizzata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Imaging in situ della trachea deepitelializzata. (A) Fotografia che mostra l'imaging fluorescente del lume della trachea mentre l'epitelio marcato CFSE è eccitato con laser blu a 488 nm attraverso la lente GRIN. (B) (i) Immagini a campo luminoso e (ii) fluorescenza del lume della trachea prima dell'etichettatura dell'epitelio. (C) Immagini di fluorescenza della trachea (i) nativa e (ii) deepiletalizzata (trachea De-Epi) mentre l'epitelio è etichettato con colorante fluorescente CFSE. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Analisi istologiche, immunofluorescenza e SEM di trachee di ratto native e deepilializzate. (A) Colorazione H&E. (B) Colorazione del pentacromo dove viola è il citoplasma cellulare, il blu è i nuclei cellulari, il verde è proteoglicani (ad esempio, la mucina) e il giallo è fibre di collagene. (C) Colorazione tricromica dove il rosa è il citoplasma cellulare, il blu scuro è i nuclei cellulari e il blu è il collagene. Immagini di fluorescenza di trachee native e deepilelializzate. (D) EpCAM e (E) collagene I. Le punte di freccia mostrano la superficie del lume della trachea. F) Micrografie SEM del lume della trachea. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Deposizione topica delle MSC esogene nel lume della trachea. (A) (i) Campo luminoso e (ii) immagini di fluorescenza della trachea deepilelializzata. (B) Immagini fluorescenti del lume della trachea deepilializzato quando è seminato con (i) PBS e (ii) collagene I pre-gel. La distribuzione omogenea delle cellule sul lume della trachea si ottiene quando il collagene pre-gel viene utilizzato come veicolo di consegna per le cellule. (C) (i) Immagini fluorescenti e (ii) vitalità quantificata delle cellule prima e dopo 6 ore di somministrazione mediante collagene pre-gel. n: numero di campioni. Sono stati seguiti i passaggi 5.1 e 5.17 del protocollo per valutare la vitalità delle cellule. D) Densità di semina cellulare misurata dopo (i) 1 giorno e (ii) 4 giorni dopo la semina e la coltura cellulare. La densità cellulare è stata calcolata dividendo i numeri di cella per l'area della superficie esaminata. Tutti i valori rappresentano la deviazione media ± standard. L'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) è stata utilizzata per determinare differenze statisticamente significative tra i gruppi, con p < 0,05 considerati significativi. Abbreviazioni: CM = terreno di coltura, C = collagene. *p < 0,05. **p < 0,01. ns: non significativo. Nessuna differenza significativa (ns) tra le superfici superiore e inferiore significa una distribuzione uniforme delle cellule attraverso la circonferenza della trachea. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

In questo lavoro, abbiamo creato un bioreattore guidato dall'imaging che può consentire (i) il monitoraggio del lume della trachea in situ dopo la rimozione cellulare e la consegna esogena delle cellule e (ii) la coltura in vitro a lungo termine del tessuto tracheale seminato dalle cellule. Utilizzando questo bioreattore personalizzato, abbiamo dimostrato (i) la rimozione selettiva delle cellule epiteliali endogene dal lume della trachea utilizzando detergenti e lavaggio delle vie aeree assistito da vibrazioni e (ii) distribuzione uniforme delle cellule esogene sulla superficie luminale della trachea denudata utilizzando il pre-gel di collagene I caricato con cellule. Inoltre, la modalità di imaging basata su lenti GRIN ha confermato la rimozione dell'epitelio in situ. Inoltre, con ulteriori analisi, tra cui H&E, tricromo, pentacromo, colorazione immunofluorescenza e SEM, abbiamo confermato la rimozione dell'epitelio e il mantenimento dell'architettura e dei componenti degli strati tissutali sottostanti. Inoltre, l'imaging basato su lenti GRIN di MSC esogene appena impiantate ha mostrato la distribuzione uniforme delle cellule quando il collagene I pre-gel è stato utilizzato come veicolo di consegna. Infine, le cellule impiantate sono sopravvissute e proliferate sulla trachea deepitelializzata, evidenziando l'efficacia del bioreattore nella coltura a lungo termine dei tessuti delle vie aeree con semi cellulari.

Il passaggio critico nel protocollo di deepitelializzazione è la creazione di un sottile strato di soluzione detergente nel lume della trachea. Negli attuali protocolli di decellularizzazione, vengono utilizzati cicli multipli di sostanze chimiche ed enzimi per un lungo periodo, riducendo il numero di fibre di collagene, glicosaminoglicani (GAG), proteoglicani e condrociti, compromettendo le proprietà biologiche e biomeccaniche dell'impalcatura delle vie aeree 19,20,21. D'altra parte, l'ECM fornisce segnali biochimici e meccanici e ambienti fisici adatti per la sopravvivenza, la proliferazione e la differenziazione delle cellule esogene impiantate22,23. Il metodo di deposizione a film sottile descritto in questo studio utilizza una piccola quantità di detergente (meno di 50 μL) per l'ablazione dell'epitelio, consentendo al contempo la conservazione dello strato tissutale sottostante e dei componenti cellulari subepiteliali. La vibrazione meccanica del tessuto esposto al detergente dimostrata in questo studio è una procedura importante in quanto consente il distacco e la clearance delle cellule lisate. I detriti cellulari e le cellule parzialmente interrotte derivanti dall'esposizione dell'epitelio al detergente sono difficili da lavare solo inondando la trachea con la soluzione di lavaggio. Pertanto, la vibrazione meccanica della trachea durante il lavaggio fornisce forze di taglio sufficienti per eliminare i detriti cellulari dal lume tracheale.

In generale, l'approccio di semina cellulare pre-gel-based può essere influenzato dalla velocità di consegna, dalla viscosità del pre-gel (che è direttamente correlata alla concentrazione pre-gel), dalla tensione superficiale e dal tempo di gelificazione. In particolare, durante la preparazione pre-gel, è essenziale mantenere la concentrazione di pre-gel abbastanza bassa da trasportare il pre-gel sospeso dalla cellula nel tubo e abbastanza alta da mantenere le cellule sulla superficie superiore della trachea. Pertanto, si consiglia vivamente di trovare la concentrazione ottimale per ogni pre-gel testando varie concentrazioni. Inoltre, pratica la tecnica di consegna come la velocità di consegna con celle meno preziose per garantire la consegna di successo del pre-gel caricato con cellule. Inoltre, mentre abbiamo usato le MSC come modello cellulare per dimostrare (i) la distribuzione delle cellule con pre-gel come veicolo di consegna e (ii) la capacità del sistema di bioreattori di coltivare le cellule appena seminate sul lume della trachea denudato, l'uso di cellule staminali (ad esempio, cellule basali) e cellule epiteliali primarie delle vie aeree in studi futuri potrebbe consentire di studiare la differenziazione cellulare e la rigenerazione funzionale delle cellule epiteliali24, 25. Inoltre, studi futuri possono includere l'aggiunta di un'interfaccia aria-liquido (ALI) alla piattaforma attuale per generare uno stress di taglio simile a quello in vivo sulle cellule seminate per la generazione di epitelio funzionale. Per aggiungere ALI al dispositivo attuale, un piccolo ventilatore per animali può essere collegato all'ingresso della trachea per ventilare la trachea. Inoltre, per ottenere l'ALI, il metodo di deposizione a film sottile può essere utilizzato per instillare un tappo liquido del terreno di coltura nella trachea seminata dalle cellule. Lo spessore del film liquido può essere modulato modificando la velocità del tappo del liquido26,27. Il tappo può essere avviato dopo che le cellule appena seminate aderiscono e si innestano saldamente sul lume della trachea.

Inoltre, l'approccio di imaging in situ basato su lenti GRIN utilizzato in questo protocollo è fondamentale per confermare l'efficacia della deepitelializzazione e valutare la qualità della distribuzione delle cellule appena seminate. A differenza dei metodi convenzionali di analisi dei tessuti, come l'istologia e l'immunofluorescenza, che richiedono la dissezione dei campioni dal tessuto tracheale per l'analisi, la piattaforma di imaging sviluppata nel nostro studio consente un monitoraggio rapido e non distruttivo del lume delle vie aeree durante la deepitelializzazione e la consegna cellulare. Per mantenere la trachea sterilizzata durante l'imaging in situ , assicurarsi di sterilizzare la lente GRIN pulendola con ipa al 70% o etanolo prima di introdurla nel lume della trachea. Inoltre, per visualizzare le cellule utilizzando la lente GRIN, le cellule (cellule epiteliali tracheali endogene o cellule appena impiantate) possono essere etichettate con vari coloranti fluorescenti con diverse lunghezze d'onda di eccitazione / emissione. Per fare ciò, assicurarsi di utilizzare il generatore di luce laser appropriato per eccitare le celle etichettate fluorescentemente e integrare le giuste lenti filtranti nello specchio dicroico a super-risoluzione a doppio bordo.

Nonostante la novità e l'innovatività dei metodi di deepitelializzazione, consegna cellulare e imaging in situ , questo studio ha diverse limitazioni. I metodi di deepitelializzazione e somministrazione cellulare descritti in questo studio sono applicabili alle piccole vie aeree (diametro: meno di 3-4 mm) dove la tensione superficiale è dominante. Formare un tappo liquido e creare un film sottile della soluzione di deepitelializzazione o sospensione pre-gel caricata con cellule nelle vie aeree più grandi, come la trachea suina e umana o bronchi, può essere difficile in quanto la tensione superficiale diventa trascurabile rispetto ad altre forze, la gravità in particolare. Inoltre, utilizzando l'approccio della deposizione a film sottile e modulando il tempo e la concentrazione, siamo stati in grado di ablare l'epitelio con un detergente forte (SDS) e preservare lo strato tissutale sottostante. In studi futuri, tuttavia, i detergenti di decellularizzazione più lievi, come il 3-[(3-colamidopropil)-dimetilammonio]-1-propansolfonato (CHAPS)28, o la soluzione non detergente, come l'idrossido di sodio (NaOH)29, possono essere testati per la conservazione dei componenti ECM e il supporto delle cellule appena impiantate. Inoltre, l'intensità di fluorescenza delle cellule marcate con CFSE si riduce nel tempo a causa della divisione delle cellule. Nel nostro studio, le immagini fluorescenti di MSC coltivate sulle trachee deepitelializzate per 4 giorni hanno mostrato una sostanziale diminuzione della loro intensità di fluorescenza. Per il monitoraggio prolungato e il tracciamento delle cellule esogene seminate sugli scaffold tissutali, sarebbero necessari diversi metodi di etichettatura cellulare che possano consentire l'etichettatura fluorescente a lungo termine o permanente delle cellule.

Prevediamo che la piattaforma del bioreattore guidato dall'imaging e i protocolli di rimozione e consegna delle cellule descritti in questo rapporto possano consentire la creazione di scaffold di tessuto delle vie aeree deepitelializzati che possono essere utilizzati per generare i tessuti delle vie aeree bioingegnerizzati. Tali vie aeree in vitro possono offrire modelli in vitro ad alta fedeltà delle malattie delle vie aeree umane e screening farmacologico. Ad esempio, per stabilire l'epitelio funzionale delle vie aeree, le cellule staminali basali delle vie aeree possono essere prima impiantate sul tessuto delle vie aeree deepitelializzato30. Quindi, l'interfaccia aria-liquido (ALI), che è fondamentale per la differenziazione delle cellule staminali basali in varie cellule epiteliali, può essere generata all'interno della trachea. Inoltre, il sistema di imaging in situ può essere modificato e utilizzato per visualizzare in modo fluorescente il tratto respiratorio di pazienti con disturbi delle vie aeree polmonari. Per essere utilizzata clinicamente per valutare i tessuti delle vie aeree in situ, la lente GRIN rigida può essere sostituita con sonde di imaging flessibili in fibra ottica per navigare nelle vie aeree. Inoltre, la capacità di distribuire in modo omogeneo le cellule all'interno del tratto respiratorio utilizzando la semina cellulare a base di idrogel può fornire un'opportunità senza precedenti per sostituire l'epitelio danneggiato o danneggiato nei pazienti. In particolare, l'approccio di sostituzione cellulare sviluppato e utilizzato in questo studio può accelerare il trattamento basato sulle cellule per il trattamento di disturbi respiratori, come la fibrosi cistica e la discinesia ciliare primaria, e la riparazione dei polmoni del donatore che vengono rifiutati per il trapianto a causa di tessuti delle vie aeree gravemente danneggiati 31,32,33,34.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta in parte dall'American Thoracic Society Foundation Research Program, dalla New Jersey Health Foundation e dalla National Science Foundation (CAREER Award 2143620) a J.K.; e il National Institutes of Health (P41 EB027062) al G.V.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1× PBS Gibco, Thermo Fisher Scientific 10-010-031
3-port connector World Precision Instruments 14048-20
4-port connector World Precision Instruments 14047-10
Accelerometer STMicroelectronics IIS3DWBTR
Achromatic doublet Thorlabs AC254-150-A-ML
Aluminum pin stub TED PELLA 16111
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240062
Assembly rod Thorlabs ER1
Button head screws McMaster-Carr 91255A274
Cage cube Thorlabs C4W
Carbon double-sided conductive tape TED PELLA 16073
CFSE labelling kit Abcam ab113853
Citrisolv (clearing agent) Decon 1061
C-mount adapter Thorlabs SM1A9
Collagen I Advanced BioMatrix 5153
Conductive liquid silver paint TED PELLA 16034
Dichroic mirror Semrock DI03-R488 Reflected laser wavelengths:  473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco, Thermo Fisher Scientific 11965118
Female luer bulkhead to hose barb adapter Cole-Parmer EW-45501-30
Female luer to tubing barb Cole-Parmer EW-45508-03
Female to male luer connector Cole-Parmer ZY-45508-80
Fetal bovine serum Gibco, Thermo Fisher Scientific 10082147
Filter lens Chroma Technology Corp ET535/50m
Fluorescent microscope Nikon Eclipse E1000 - D
Fusion 360 Autodesk
Hex nut McMaster-Carr 91813A160
Hexamethyldisilazane (HMDS) Fisher Scientifc AC120585000
Imaging fiber SELFOC, NSG group GRIN lens
Laser Opto Engine MDL-D-488-150mW
Lens tubes Thorlabs SM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) Thermo Fisher Scientific L3224
MACH 3 CNC Control Software Newfangled Solutions
Objective lens Olympus UCPLFLN20X
Peristaltic Pump Cole Parmer L/S standard digital pump system
Recombinant human FGF-basic PeproTech 100-18B
Retaining ring Thorlabs SM1RR
Scientific CMOS camera PCO Panda PCO Panda 4.2
Sodium dodecyl sulfate VWR 97064-472
Solidworks (2019) Dassault Systèmes
Stackable lens tube Thorlabs SM1L10
Subwoofer plate amplifier Dayton Audio SPA250DSP
Subwoofer speaker Dayton Audio RSS21OHO-4 Diaphragm diameter: 21 cm
Syringe Pump World Precision Instruments AL-4000
Threaded cage plate Thorlabs CP33
Threaded luer adapter Cole-Parmer EW-45513-81
Tube lens Thorlabs AC254-150-A-ML
Tygon Tubing Cole-Parmer 13-200-110
XY Translator Thorlabs CXY1

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