Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Bildestyrt bioreaktor for generering av bioingeniør luftveisvev

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63544
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 4, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Stevens Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 3Department of Cell Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 4Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University

Summary

Protokollen beskriver en bildeaktivert bioreaktor som tillater selektiv fjerning av det endogene epitelet fra rotterøret og homogen fordeling av eksogene celler på lumenoverflaten, etterfulgt av langsiktig in vitrokultur av cellevevskonstruksjonen.

Abstract

Gjentatt skade på luftveisvev kan svekke lungefunksjonen og forårsake kronisk lungesykdom, for eksempel kronisk obstruktiv lungesykdom. Fremskritt innen regenerativ medisin og bioreaktorteknologier gir muligheter til å produsere lab-dyrkede funksjonelle vevs- og organkonstruksjoner som kan brukes til å screene legemidler, modellsykdom og ingeniørvevserstatninger. Her beskrives en miniatyrisert bioreaktor kombinert med en avbildningsmodalitet som tillater in situ visualisering av de indre lumen av utplantet rottetrachea under in vitro vev manipulasjon og kultur. Ved hjelp av denne bioreaktoren demonstrerer protokollen avbildningsstyrt selektiv fjerning av endogene cellulære komponenter samtidig som den bevarer de iboende biokjemiske egenskapene og ultrastrukturen til luftveisvevsmatrisen. Videre vises leveransen, ensartet distribusjon og påfølgende langvarig kultur av eksogene celler på decellulariserte luftveislumenene med optisk overvåking in situ . Resultatene fremhever at den bildestyrte bioreaktoren potensielt kan brukes til å lette genereringen av funksjonelle in vitro luftveisvev.

Introduction

Luftveienes lysende overflate er foret av et lag epitel som hovedsakelig består av multi-ciliated, klubb, beger og basale stamceller 1,2. Epitellaget fungerer som en primærforsvarsmekanisme i lungen, og fungerer som en biofysisk barriere som beskytter det underliggende luftveisvevet mot inhalerte patogener, partikler eller kjemiske gasser. Det beskytter luftveisvevet via flere mekanismer, inkludert intercellulær tett koblingsdannelse, mucociliary clearance og antimikrobiell og antioksidant sekresjon 3,4. Det defekte luftveisepitelet er forbundet med ødeleggende luftveissykdommer, som kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS)5, primær ciliary dyskinesi (PCD)6 og cystisk fibrose (CF)7.

Fremskritt innen lunge-på-chip (LOC)-teknologi representerer en mulighet til å studere menneskelig lungeutvikling, modellere ulike lungesykdommer og utvikle nye terapeutiske materialer i tett regulerte in vitro-miljøer . For eksempel kan airway epitel og endotel dyrkes på motsatte sider av en tynn, porøs membran for å etterligne gassen som utveksler lungevev, slik at trofast sykdomsmodellering og legemiddeltesting8. På samme måte er in vitro sykdomsmodeller opprettet for å modellere luftveissykdommer in vitro, som KOLS9 og cystisk fibrose10. Imidlertid er en stor utfordring med LOC-enheter å rekapitulere den komplekse tredimensjonale (3D) arkitekturen til lungevevet og dynamiske cellevevsmatriseinteraksjoner in vitro11.

Nylig har innovative vevsteknikk metoder blitt utviklet som tillater manipulering av ex vivo lungevev12. Ved hjelp av disse metodene kan denuderte allogene eller xenogene vevstransplantasjoner fremstilles ved å fjerne endogene celler fra lungevevet via kjemiske, fysiske og mekaniske behandlinger13. I tillegg gir den bevarte innfødte vevs-ekstracellulære matrisen (ECM) i decellulæriserte lungestillasene de fysio-mimetiske strukturelle, biokjemiske og biomekaniske signalene for implanterte celler for å feste, spre seg og skille14,15.

Her rapporteres et bildestyrt bioreaktorsystem opprettet ved å kombinere LOC- og vevsteknologier for å tillate in vitro vevsmanipulering og kultur av utplantet rottetrakealvev. Ved hjelp av denne luftveisvevbioreaktoren demonstrerer protokollen selektiv fjerning av endogene epitelceller uten å forstyrre de underliggende subepitheliale cellulære og biokjemiske komponentene i luftveisvevet. Vi viser deretter den homogene fordelingen og øyeblikkelig avsetning av de nylig frø eksogene cellene, for eksempel mesenchymale stamceller (MSCs), på denuded airway lumen ved å innpode det cellebelastede kollagenet jeg pre-gel løsning. I tillegg, ved å bruke den mikrooptiske bildeenheten integrert i bioreaktoren, gjøres også visualiseringen av luftrørets lumen under epitelfjerning og endogen cellelevering. Videre er det vist at luftrøret og nylig implanterte celler kan dyrkes i bioreaktoren uten merkbar celledød og vevsforringelse i 4 dager. Vi ser for oss at den bildeaktiverte bioreaktorplattformen, den tynne filmbaserte de-epitelialiseringsteknikken og celleleveringsmetoden som brukes i denne studien, kan være nyttig for å generere luftveisvev for in vitro sykdomsmodellering og legemiddelscreening.

Bioreaktoren inkluderer et rektangulært kammer koblet til en programmerbar sprøytepumpe, perfusjonspumpe og ventilator for dyrking av isolert rottetreksett. Bioreaktoren har innløp og uttak koblet til luftrøret eller vevskulturkammeret for å levere reagenser separat (f.eks. kulturmedier) til de indre og ytre områdene i luftrøret (figur 1). Et spesialbygd bildebehandlingssystem kan brukes til å visualisere det indre av den in vitrokulturerte rotterøret på cellenivå (figur 2). Det endogene epitelet i luftrøret fjernes ved innånding av en vaskemiddelbasert decellulariseringsløsning etterfulgt av vibrasjonsassistert luftveisvask (figur 3). Hydrogelløsning, for eksempel type I kollagen, brukes som leveringskjøretøy for såing av eksogene celler jevnt og øyeblikkelig over den denuded trachea lumen (figur 4). Alle materialene som brukes til å konstruere bioreaktoren og utføre forsøkene er gitt i materialtabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyrevevsprotokollen nedenfor er godkjent av dyrevelferdsretningslinjen og forskriftene til Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Stevens Institute of Technology, og den overholder National Institutes of Health (NIH) retningslinjer for bruk av eksperimentelle dyr.

1. Design og konstruksjon av bildestyrt rotte luftrør bioreaktor

  1. Betegnelse og fabrikasjon av rotte luftrør bioreaktor
    1. Lag en CAD-modell (computer-aided design) av bioreaktorkammeret med relevant design, for eksempel innløp, uttak og vevskulturkammer, ved hjelp av CAD-generatorprogramvare. For denne studien bruker du geometrien og dimensjonene som presenteres i figur 1A-C. Opplæringen av CAD generator programvare finner du i16,17.
    2. Eksporter den genererte CAD-modellen til en CNC-kontrollerprogramvare (Computer Numerical Control) og klipp polytetrafluoretylen (PTFE)-plasten ved hjelp av en CNC-maskin for å lage bioreaktorkammeret. Opplæringen av CNC-kontrollerprogramvaren finner du i18.
      MERK: I tillegg til PTFE kan andre plastmaterialer, som ultrahøy molekylvekt polyetylen (UHMWPE) og polyeterimid, brukes til å fremstille kulturkammeret.
    3. Steriliser alle bioreaktorkomponenter, for eksempel Luer-adaptere og skruer, for å unngå forurensning av vev og celler som dyrkes i enheten. Monter alle bioreaktorkomponenter til hovedvevskulturkammeret i et rent miljø (figur 1A).
  2. Konstruksjon av graderingsindeks (GRIN) linsebasert bildebehandlingsenhet
    1. For å lage in situ-bildeenheten , sett inn et rørlinse i et linserør som kan stables, og fest det ved hjelp av en holdering. Monter linserørenheten på et vitenskapelig CMOS-kamera via en C-montert adapter.
    2. Bruk programvare, for eksempel Micro-Manager, til å betjene kameraet og skaffe bilder og videoer. Rett et objekt som er plassert på lang avstand (f.eks. 10 m fra kameraet) og juster avstanden mellom rørlinsen og bildesensoren til kameraets fokusbilde dannes på dataskjermen av bildebehandlingsprogramvaren som brukes.
    3. Monter et filterlinse på et dichroic-speil med dobbel kantoppløsning og en laser på enheten ved hjelp av optiske bursystemkomponenter, inkludert monteringsstang, gjenget burplate og burkube.
    4. Koble objektivet (20x) til enheten. Monter en GRIN-linse (diameter = 500 μm) i den distale enden av linserøret via XY-oversetteren. Juster avstanden mellom GRIN-objektivet og objektivet for å danne fokuserte mikroskopiske bilder (figur 2A,B).

2. Isolering av rotterøret

  1. Desinfiser det kirurgiske området og steriliser de kirurgiske instrumentene ved hjelp av en autoklav ved 121 °C i 30 minutter før operasjonen.
  2. Plasser en rotte i induksjonskammeret og lever 2,5% isofluran i 15 minutter ved hjelp av en liten fordamper for å bedøve dyret. Vurder anestesidybden ved pedalrefleks. For å gjøre dette, klem tåen fast og bekreft at dyret ikke reagerer på tåklemmen.
  3. Etter anestesi, fjern isofluranen fra kammeret og administrer 1 ml 1000 enhet / ml heparin gjennom sidehalevenen for å forhindre blodpropp i lungevaskulaturen.
  4. For å avlive dyret, eksponer dyret for 5% isofluran i ytterligere 15-20 min. Fjern dyret fra induksjonskammeret og legg det på operasjonsplaten i en ansikt-opp liggende stilling.
  5. Fest rotten på det kirurgiske brettet ved å immobilisere bena og halen ved hjelp av tape. Deretter steriliserer rottehalsen og brystregionene ved hjelp av 70% isopropylalkohol (IPA). Åpne bukhulen ved å lage et 3-4 cm snitt ved hjelp av saks i huden.
    MERK: Vær forsiktig så du ikke skjærer huden dypt ved å peke saksespissene oppover.
  6. Transekter den dårligere vena cava (IVC) ved hjelp av saksen og bekreft eutanasi ved ekssanguinasjon.
  7. Utfør trakeotomi ved å lage et snitt ved hjelp av saks i midtlinjen av nakken og utsette luftrøret. Utfør midline thoracotomy ved å lage et snitt i brystveggen og kutte mellom ribbeina for å nå luftrøretden som er koblet til lungen. Deretter bruker du en bicep og saks for å kutte begge ender av luftrøret og isolere luftrøret.
  8. Etter isolasjon, skyll luftrøret med 20 ml 1x fosfatbufret saltvann (1x PBS). Overfør luftrøret til bioreaktoren ved hjelp av steriliserte biceps. Fest de to endene av luftrøret til Luer-kontakten ved hjelp av en 4-0 suturtråd.
  9. Lever 5 ml kulturmedium til bioreaktorkammeret ved hjelp av den programmerbare sprøytepumpen gjennom slangen som er koblet til bioreaktorkammeret med en strømningshastighet på 5 ml/min.
    MERK: Kulturmediet består av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), rekombinant human FGF-basic (0,1 ng/ml), foster bovint serum (FBS, 10%) og antibiotika-antimykotisk (1%).
  10. Lukk bioreaktorlokket tett med akrylplastlokket og skruene. Lukk bioreaktorkammerrørforbindelsene med de mannlige / kvinnelige Luer-pluggene for å forhindre strømmen av kulturmediet i slangen.

3. Avbildningsstyrt fjerning av luftrøret epitel

  1. For å visualisere luftrørets lumen enten i lysfelt eller fluorescerende, plasser bioreaktoren på bildestadiet (figur 3A).
  2. Forbered karboksyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-løsning (konsentrasjon: 100 μM) i CFSE-cellemerkingssettet ved å fortynne CFSE-løsningen med 1x PBS.
    MERK: Konsentrasjonen av den opprinnelige CFSE-oppløsningen er 10 mM (i dimetylsulfoksid (DMSO)).
  3. Tilsett 500 μL av CFSE-oppløsningen gjennom luftrøret via sprøytepumpen gjennom slangen som er koblet til luftrørets kanyle med en strømningshastighet på 5 ml/min. Stopp pumpen når CFSE-løsningen fyller luftrøret. Vent i 10 min, og vask deretter luftrørets lumen ved infusjon av 10 ml 1x PBS ved hjelp av sprøytepumpen for å fjerne det gjenværende, ikke-korporerte CFSE-reagenset.
  4. Sett den distale bildeenden av GRIN-objektivet inn i luftrøret via Luer-kontakten som er festet til den ene enden av luftrøret. Beveg deretter GRIN-objektivet forsiktig inne i luftrøret til luftrørets overflate er fokusert og ta bilder og videoer i lyst felt eller fluorescens ved 20x forstørrelse.
  5. Følg fremgangsmåten nedenfor for å ta bilder med lyse felt i Micro-Manager-programvaren.
    1. Introduser hvitt lys gjennom burkuben for å belyse luftrørets lumen. Klikk på Live-ikonet for å vise lysflaten til luftrøret i sanntid. Bruk Bildebehandlingsinnstilling > Eksponering (ms) for å endre eksponeringstiden til ønsket verdi. I denne studien var eksponeringstiden som ble brukt i området 10 ms og 50 ms.
    2. Hvis du vil justere kontrasten og lysstyrken i bilder, bruker du vinduet Histogram og Intensitetsskalering til å flytte svarte og hvite piler på endepunktet til den interaktive histogramvisningen. Alternativt kan du bruke alternativet Automatisk strekk som gjør at programvaren kan justere lysstyrken og kontrasten automatisk til optimale nivåer.
    3. Klikk på Snap-ikonet for å fryse bildet. Deretter bruker du Angi > Eksporter bilder som forskjøvet for å lagre bildene i ønsket format. Alternativt kan du bruke Setting > ImageJ til å eksportere bildet direkte til ImageJ-programvaren og lagre det.
  6. For å få bilder og videoer i fluorescerende modus, belys luftrøret lumen med CFSE-spesifikt laserlys (CFSE: eksitasjonsbølgelengde: 488 nm, utslippsbølgelengde: 515 nm) gjennom burkuben. Følg trinnene 3.5.2-3.5.3 for å hente bildene. Når du har tatt bilder og videoer, fjerner du GRIN-objektivet forsiktig fra luftrøret.
  7. Utfør de-epitelialisering som beskrevet nedenfor.
    1. Forbered 2% natrium dodecylsulfat (SDS) decellulariseringsløsning i destillert (DI) vann. Innpod 50 μL SDS gjennom luftrøret med en strømningshastighet på 6,3 ml/min, ved å bruke sprøytepumpen gjennom luftrørets kanyle for å generere en tynn film av vaskemiddelløsningen på luftrørets lumen.
    2. Lukk bioreaktorens rørtilkoblinger ved hjelp av mannlige/kvinnelige Luer-plugger og overfør bioreaktoren til en inkubator. La SDS bo i luftrøret i 10 minutter ved 37 °C. Innpod ytterligere 50 μL SDS-oppløsning gjennom luftrøret og inkuber i 10 minutter.
    3. Fjern lyslagt epitel og SDS ved å vanne luftrørets lumen med 500 μL 1x PBS via sprøytepumpe med en strømningshastighet på 10 ml/min i 3x. Plasser bioreaktoren på en shaker og vibrer bioreaktoren mekanisk ved 20 Hz frekvens og forskyvningsamplitude på ca. 0,3 mm for å fysisk fremme løsrivelse av SDS-behandlede epitelceller fra luftrørets lumen.
      MERK: I denne studien ble shakeren spesialbygget ved å montere en subwooferhøyttaler, en subwooferplateforsterker og et akselerometer. En sinusformet bølgeform ble generert av en datamaskin og matet inn i shakeren via forsterkeren, mens responsen til shakeren ble overvåket via akselerometeret (figur 3B). I tillegg kan konvensjonelle shakere, som elektromagnetiske og treghet shakers, brukes til å fremme løsrivelse av cellene. For å gjøre dette, sett ristens frekvens og akselerasjon til henholdsvis 20 Hz og 0,5 g (tilsvarende 0,3 mm forskyvningsamplitude).
    4. Innpod 500 μL 1x PBS to ganger gjennom luftrøret lumen for å fjerne gjenværende SDS og cellerester mens luftrøret er mekanisk vibrert. Etter epitelfjerningsprosedyren evaluerer du clearance av epitellaget ved å måle intensiteten til CFSE ved hjelp av GRIN-objektivavbildningsenheten som i trinn 3.6 (figur 3C).

4. Trachea vev forberedelse for videre analyser

  1. For å bekrefte epitelfjerningen, utfør ytterligere vevsanalyser, for eksempel hematoksylin og eosin (H&E) farging, trichrom, pentachrom og immunostaining. For å gjøre dette, fjern luftrøret fra bioreaktoren, og fest den i 30 ml 4% nøytral bufret paraformaldehydoppløsning i 1x PBS (pH = 7,4) ved 4 °C over natten.
  2. Dehydrer og bygg inn det faste luftrøret ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Etter fiksering, vask luftrøret vev med 10 ml 1x PBS, overfør luftrøret til 30 ml 70% alkohol, og hold det ved 4 °C over natten. Skjær luftrøret i små sylindriske seksjoner (~5 mm) med et skarpt blad og sett inn vevsdelene i vevsinnbyggingskassettene (lengde x bredde x høyde: 4 cm x 2,5 cm x 0,5 cm). Oppbevar to luftrørsdeler i hver kassett.
    2. Dehydrer seksjonene i en serie isopropylalkoholløsninger (IPA) - 85%, 90%, 95%, 100% - i 1 time i 30 ml av hver løsning. Fjern den forrige løsningen før du legger til neste løsning.
    3. Etter ferdigstillelse, senk kassettene i 30 ml clearingmiddel (f.eks. xylen) i 2 timer for å fortrenge IPA-løsningen helt fra vevsdelene. Utfør dette trinnet i en avtrekkshette med riktig ventilasjon.
    4. Senk kassettene i parafin i 2 timer, og legg dem deretter inn i parafin ved 4 °C over natten. Deretter kutter du det parafinin innebygde vevet i tynne seksjoner (5-8 μm) ved hjelp av en mikrotom enhet for H&E, trichrome, pentachrome og immunostaining.
  3. For å forberede vevet for skanning elektronmikroskopi (SEM) analyse, fest luftrøret i 30 ml 2,5% glutaraldehydoppløsning i 1x PBS (pH = 7,4) ved 4 °C over natten. Deretter dehydrerer du det faste luftrøret for SEM ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Etter fiksering, skyll luftrøret vev med 10 ml 1x PBS. Klipp luftrørets luftrørsvev i små halvsylindrede seksjoner (lengde: ~ 5 mm) ved hjelp av saks og sett vevsdelene i kassettene.
    2. Dehydrer seksjonene i en serie IPA-løsninger - 35%, 50%, 70%, 85%, 95% og 100% - i 10 min i 30 ml av hver løsning. Fjern den forrige løsningen før du legger til neste løsning.
    3. Utfør heksametyldisilazan (HMDS)-basert tørkemetode ved å senke vevet i følgende løsninger: 100% IPA: HMDS (2:1; v/v) i 10 min, etterfulgt av 100% IPA: HMDS (1:2; v/v) i 10 min, og til slutt 100% HMDS for overnatting.
      MERK: HMDS er giftig. Arbeid under en avtrekkshette under alle tørketrinn.
    4. Fjern vevet fra HMDS-oppløsningen og la dem tørke under avtrekkshetten i 1 time. Monter delen på aluminiumspinnestubber ved hjelp av et dobbeltsidig konduktivt karbonbånd eller sølvledende pasta for SEM-avbildning.

5. Homogen fordeling av eksogene celler på den denuded trakeal lumen

  1. Forbered en de-epitelialisert rotte luftrør ved hjelp av protokollen i trinn 3. Tine frosne mesenchymale stamceller (MSC) i 30 s i et 37 °C vannbad.
    MERK: I denne studien brukte vi mesenchymale stamceller (MSC) som modellcelle for å vise fordelingen av eksogene celler på de-epitelialiserte luftrøret. Ideelt sett kan primære luftveis epitelceller, basale celler eller induserte humane pluripotente celler (iPSCer) brukes til epitelregenereringsformål.
  2. Tell cellene med et hemocytometer og lag en celleløsning med en konsentrasjon på 5 x 106 celler / ml. Merk cellene fluorescerende ved å inkubere cellene med 2 ml CFSE-løsning (konsentrasjon: 100 μM) ved romtemperatur i 15 minutter. Skyll cellene med 5 ml 1x PBS i 3x og resuspend cellene i friskt kulturmedium ved en endelig konsentrasjon på 3 x 107 celler / ml.
  3. Forbered hydrogel pre-gel løsning som et kjøretøy for cellelevering. For denne studien, bruk kollagen I som leveringskjøretøy for MSCs celler og følg produsentens instruksjoner for å forberede pre-gel. For eksempel, for å oppnå 3,6 mg / ml kollagen pre-gel, bland en del av den avkjølte nøytraliseringsløsningen med ni deler av rottehale kollagenet i et 1,5 ml sterilt rør. Rør deretter blandingen forsiktig opp og ned for tilstrekkelig blanding.
    MERK: Andre biokompatible hydrogeler kan brukes i stedet for kollagen I i henhold til studie- og brukerbehov.
  4. Når hydrogeloppløsningen er klargjort, tilsett cellene raskt til løsningen med ønsket konsentrasjon (f.eks. 5 x 106 celler / ml). For å oppnå en jevn celle-hydrogelblanding, bland cellene og geloppløsningen ved forsiktig pipettering med en mikropipette.
  5. Fest den ene enden av luftrøret i bioreaktoren til en programmerbar sprøytepumpe gjennom en Luer-kontakt. Lever 5 ml ferskt kulturmedium ved 37 °C inn i bioreaktorkammeret for å dekke den utvendige overflaten av luftrøret ved hjelp av sprøytepumpen med en strømningshastighet på 5 ml/min.
  6. Administrer en 10 μL bolus av celle-hydrogelblandingen i av-epitelialisert luftrør i bioreaktoren ved hjelp av sprøytepumpen med en strømningshastighet på 5 ml/min for å generere et cellehydrogellag på luftrørets lumen (figur 4).
  7. Etter celleinjeksjon, plasser bioreaktoren i en steril cellekulturinkubator ved 37 °C og 5 % CO2 for gelering. For kollagen I forekommer gelasjonen i 30 min.
  8. For å visualisere fordelingen av implanterte celler, steriliser GRIN-linsen ved å tørke av med 70% IPA eller etanol og plasser bioreaktoren på bildestadiet. Ta bilder og videoer i både lysfelt og fluorescerende modus etter behov.
  9. Etter 30 min med cellesåing, tilsett 1 ml kulturmedium i luftrørets lumen ved hjelp av en sprøytepumpe med en strømningshastighet på 1 ml/ min.
  10. Kultur cellefrørøret i bioreaktoren i en inkubator ved 37 °C for ønsket tid. For langsiktig kultur, oppdater kulturmediet i luftrøret lumen og bioreaktorkammeret hver 24. Under cellekulturen, hold mediene inne i lumen statisk og endre det hver 24 h, mens media utenfor luftrøret kontinuerlig perfused via en enveis strømning på 5 ml / min.
  11. Etter å ha dyrket cellene i en viss tidsperiode (f.eks. 1 og 4 dager i denne studien), fjern luftrøret fra bioreaktoren. Bruk saks til å kutte luftrøret langsgående i to halvsylindrede seksjoner (dvs. øvre og nedre seksjoner) på dag 1 og 4 av in vitrokulturen for å eksponere de indre overflatene for overvåking av cellevekst og beregning av celletetthet. Bruk et konvensjonelt fluorescerende mikroskop for å visualisere cellene på de indre overflatene.
  12. Følg trinn 3.5 og 3.6 for å skaffe bildene ved hjelp av Micro-Manager-programvaren. Bruk et fluorescein isothiocyanate (FITC)-filter for å visualisere CFSE-merkede celler i fluorescensmodus. Analyser bildene tatt av det fluorescerende mikroskopet og beregn celletetthet på øvre og nedre seksjoner ved hjelp av ImageJ-programvaren. Følg fremgangsmåten nedenfor for å beregne antall celler og celletettheten.
    1. Åpne et bilde i ImageJ-programvare og konverter bildet til et binært bilde (16-biters) ved hjelp av Image > Type > 16-biters. Angi bildeskalaen med skalalinjen ved hjelp av Analyser > Angi skala.
    2. Juster terskelen for bildet for å utheve strukturene i cellene som skal telles. Bruk bilde > juster > terskelverdi. Bruk Analyser > Analyser partikler for å telle antall celler. Beregn tettheten til cellene ved å dele antall celler på overflaten av bildet.
  13. For å vurdere levedyktigheten etter cellesåing, bruk et celle levedyktighetssett. For denne studien, inkubere luftrøret vev og cellene i bioreaktor ved 37 °C i 6 timer og flekk cellene med 4 mM calcein-AM og 2 mM ethidium homodimer-1 i 1 ml 1x PBS ved romtemperatur i 15 min.
  14. Etter skylling med 1x PBS, visualiser cellene ved hjelp av et fluorescerende mikroskop. Tell levende og døde celler ved hjelp av trinnene som er beskrevet i trinn 5.12. Beregn celle levedyktighet som prosentandelen levende celler (farget med calcein-AM) per totalceller (både levende og døde celler).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Grin linsebasert in situ-avbildningsmodalitet kan tillate visualisering av den trakeale indre lumen in situ (figur 5A). Ved hjelp av denne avbildningsmetoden kan både lyse felt og fluorescerende bilder av de innfødte og de-epitelialiserte trakeaene oppnås (figur 5B, C). Det ble ikke observert fluorescerende signal fra den opprinnelige luftrøret før CFSE-merking (figur 5Bii). Men da trakealepitelet ble merket med CFSE-fargestoff, ble det observert et jevnt fluorescerende signal (grønt) gjennom hele epitelet (figur 5Ci). Etter de-epitelialisering via SDS og vibrasjonsassistert luftveisvanning ble intensiteten av fluorescerende signal redusert betydelig (figur 5Cii), noe som indikerer ablasjon av epitelet.

H&E-bildene av de-epitelialisert luftrør viste fjerning av det pseudostratifiserte epitelet fra luftrørets lumen og bevaring av cellene og ECM-mikrostruktur i underliggende vevslag (figur 6A). Videre bekreftet pentachrome (figur 6B) og trichrome farging (figur 6C) vedlikehold av luftrøret vevsarkitektur og ECM-komponentene, for eksempel kollagen og proteoglykaner. Videre immunfluorescens av epitelceller (epitelcelleadhesjonsmolekyl, EpCAM; Figur 6D) kollagen I (figur 6E) avslørte fullstendig fjerning av epitelet og bevaring av kollagen I i det subepitheliale vevet. SEM-avbildning av innfødt luftrør viste at den lysende overflaten av innfødt rottetrachea hovedsakelig var befolket med multi-ciliated celler og begerceller. På den annen side viste SEM-bilder av de-epitelialiserte luftrørslumen at kjellermembranen ble utsatt som indikert av et mesh-nettverk av ECM-fibre og fravær av epitelceller (figur 6F).

Ved hjelp av de-epitelialiserte rottetracheas og fluorescerende merkede celler undersøkte vi om det å innlemme en hydrogel som celleleveringskjøretøy kunne oppnå homogen cellefordeling på de-epitelialiserte trakeallumen (figur 7A, B). I denne studien ble de mesenchymale stamcellene (MSC) brukt som modellceller for celleleverings- og kulturstudien. Som beskrevet i protokollen (trinn 5), innpodet vi MSC-lastet kollagen I pre-gel i en de-epitelialisert rotte luftrør og overvåket fordelingen av cellene på trakeal lumen ved hjelp av GRIN linse bildebehandlingssystem. Som et kontrolleksperiment suspenderte vi MSCer i kulturmediet, infunderte det cellebelastede kulturmediet inn i luftrøret, og inspiserte visuelt fordelingen av cellene. In situ bilderesultater viste at de fluorescerende merkede cellene som ble levert via hydrogel, forble mer jevnt over lumen enn de som ble sådd via kulturmedium (figur 7B). Vi testet deretter celle levedyktigheten før og etter cellelevering for å evaluere potensiell celleskade og død på grunn av skjærende stress under celleinfusjon. Resultatet viste at celle levedyktighet ikke ble signifikant påvirket av celleleveringsprosedyren, da over 90% av cellene forble levedyktige (figur 7C).

Videre dyrket vi cellefrøtracheas i 4 dager. Cellene som ble sådd via både kollagen og kulturmedium (kontroll) spredte seg på den aveptelialiserte luftrørslumenoverflaten som indikert av det økte antallet celler som uttrykker CFSE over tid i både øvre og nedre halvdel av trakeallumen (figur 7D). Spesielt i kollagen hydrogel leveringsgruppen var forskjellen i tettheten av cellene mellom øvre og nedre lumen mindre enn i kontrollgruppen, noe som indikerer cellelevering via hydrogel fremmer homogen cellefordeling gjennom luftrøret lumen.

Figure 1
Figur 1: Tredimensjonal (3D) datamaskintegning av luftrørsbioreaktoren (A) (i) sidevisning, (ii) ovenifra. (B) Dimensjonene til bioreaktorkammeret. (C) Et gjennomsiktig akrylplastark kuttes og festes til toppen av hovedkammeret ved hjelp av skruer. Enhet = mm; R = radius. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Spesialbygd mikrofiberavbildning for in situ-visualisering av rotterøret. (A) (i) Skjematisk for bildebehandlingsoppsettkomponentene i lysbanen. Forkortelser: C = kamera, TL = rørlinse, F = filter, DM = dikroisk speil, OL = objektiv linse; (ii) fotografi av bildeoppsettkomponentene som viser bildebehandlingssonden (GRIN-objektivet) settes inn i Luer-kontakten til bioreaktoren. (B) Skjematisk som viser at GRIN-objektivet er integrert med bioreaktoren. (C) Et fotografi som viser bildesonden brukes til å visualisere luftrøret inne i bioreaktoren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Plattformen for de-epitelialisering av rottetrachea. (A) Fotografi som viser det eksperimentelle oppsettet for de-epitelialisering og in situ optisk fiberavbildning. (B) Diagram som viser komponenten og monteringen av den spesialbygde elektromagnetiske shakeren som brukes til å lette fjerning av epitel. ω: frekvens, a: amplitude (C) Skjematisk som viser arbeidsflyten av rotte luftrør de-epitelialisering prosedyre. PBS = fosfatbufret saltvann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Levering av eksogene celler til de-epitelialisert rotte luftrør ved hjelp av hydrogel. Skjematisk viser hydrogelløsning som brukes som leveringskjøretøy for å topisk deponere cellene på de indre lumen i de-epiteliserte rotterøret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: In situ-avbildning av de-epitelialisert luftrør. (A) Fotografi som viser fluorescerende bildebehandling av luftrørslumen mens cfse-merket epitel er begeistret med 488 nm blå laser gjennom GRIN-linsen. (B) (i) Lysfelt og (ii) fluorescensbilder av luftrørets lumen før epitelmerking. (C) Fluorescensbilder av (i) innfødte og (ii) de-epitelialiserte luftrøret (De-Epi luftrør) mens epitelet er merket med CFSE fluorescerende fargestoff. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Histologi, immunfluorescens og SEM-analyser av innfødte og de-epitelialiserte rottetracheas. (A) H&E farging. (B) Pentachrome farging der lilla er cellecytoplasma, blå er cellekjerner, grønn er proteoglykaner (f.eks. mucin), og gul er kollagenfibre. (C) Trichrome farging der rosa er cellecytoplasma, mørk blå er cellekjerner, og blå er kollagen. Fluorescensbilder av innfødte og de-epitelialiserte trakeas. (D) EpCAM og (E) kollagen I. Pilspisser viser overflaten av luftrøret lumen. (F) SEM-mikrografer av luftrørets lumen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Aktuell avsetning av de eksogene MSCene i luftrørets lumen. (A) (i) Lyse felt og (ii) fluorescensbilder av de epitelialiserte luftrøret. (B) Fluorescerende bilder av de-epitelialiserte luftrøret lumen når det er frøet med (i) PBS og (ii) kollagen I pre-gel. Den homogene fordelingen av cellene på luftrøret lumen oppnås når pre-gel kollagen brukes som leveringskjøretøy for celler. (C) (i) Fluorescerende bilder og (ii) kvantifisert levedyktighet av cellene før og etter 6 timers levering med pre-gel kollagen. n: antall prøver. Trinn 5.1 og 5.17 i protokollen ble fulgt for å vurdere levedyktigheten til cellene. (D) Cellesåingstetthet målt etter (i) 1 dag og (ii) 4 dager etter cellesåing og kultur. Celletettheten ble beregnet ved å dele cellenumrene på det undersøkte overflateområdet. Alle verdier representerer gjennomsnitt ± standardavvik. Enveisvariasjonsanalyse (ANOVA) ble brukt til å bestemme statistisk signifikante forskjeller mellom gruppene, der p < 0,05 ble ansett som signifikant. Forkortelser: CM = kulturmedium, C = kollagen. *p < 0,05. **p < 0,01. ns: ikke signifikant. Ingen signifikant forskjell (ns) mellom øvre og nedre overflater betyr ensartet cellefordeling over luftrørets omkrets. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbeidet opprettet vi en bildestyrt bioreaktor som kan tillate (i) overvåking av luftrøret lumen in situ etter cellefjerning og eksogen cellelevering og (ii) langsiktig in vitrokultur av cellefrø luftrøret vev. Ved hjelp av denne spesialbygde bioreaktoren demonstrerte vi (i) selektiv fjerning av de endogene epitelcellene fra luftrørets lumen ved hjelp av vaskemiddel og vibrasjonsassistert luftveisvask og (ii) jevn fordeling av eksogene celler på lysflaten til den denuderte luftrøret ved hjelp av cellebelastet kollagen I pre-gel. Videre bekreftet GRIN linsebasert bildemodalitet fjerning av epitel in situ. Videre, med ytterligere analyser, inkludert H&E, trichrome, pentachrome, immunfluorescensfarging og SEM, bekreftet vi fjerning av epitelet og vedlikehold av arkitekturen og komponentene i underliggende vevslag. I tillegg viste GRIN linsebasert bildebehandling av nylig implanterte eksogene MSCer den ensartede fordelingen av cellene da kollagen I pre-gel ble brukt som leveringskjøretøy. Til slutt overlevde de implanterte cellene og spredte seg på de-epitelialiserte luftrøret, og fremhevet effekten av bioreaktoren i den langsiktige kulturen i cellefrø luftveisvevet.

Det kritiske trinnet i de-epitelialiseringsprotokollen er å skape et tynt vaskemiddelløsningslag i luftrørets lumen. I dagens decellulariseringsprotokoller brukes flere sykluser av kjemikalier og enzymer over lang tid, reduserer antall kollagenfibre, glykosaminoglykaner (GAG), proteoglykaner og kondrocytter, og kompromitterer de biologiske og biomekaniske egenskapene til luftveis stillaset 19,20,21. På den annen side gir ECM biokjemiske og mekaniske signaler og egnede fysiske miljøer for overlevelse, spredning og differensiering av implanterte eksogene celler22,23. Tynnfilmavsetningsmetoden beskrevet i denne studien bruker en liten mengde vaskemiddel (mindre enn 50 μL) for epitelablasjon samtidig som den tillater bevaring av det underliggende vevslaget og subepitheliale cellulære komponenter. Mekanisk vibrasjon av det vaskemiddel-eksponerte vevet som er demonstrert i denne studien er en viktig prosedyre da det tillater løsrivelse og clearance av lysede celler. Celleavfallet og delvis forstyrrede celler som følge av eksponering av epitelet til vaskemiddelet, er utfordrende å vaske bare ved å oversvømme luftrøret med vaskeløsningen. Derfor gir mekanisk vibrering av luftrøret under vask tilstrekkelig skjærkrefter for å fjerne celleavfallet fra trakeallumen.

Generelt kan den pre-gelbaserte cellesåingsmetoden påvirkes av leveringshastighet, viskositeten til pre-gelen (som er direkte relatert til pre-gelkonsentrasjonen), overflatespenning og gelasjonstid. Spesielt under pre-gel forberedelse er det viktig å opprettholde pre-gel konsentrasjonen lav nok til å transportere celle-suspendert pre-gel i slangen og høy nok til å opprettholde cellene på den øvre overflaten av luftrøret. Derfor anbefales det sterkt å finne den optimale konsentrasjonen for hver pre-gel ved å teste ulike konsentrasjoner. I tillegg kan du øve på leveringsteknikken som leveringshastighet med mindre dyrebare celler for å sikre vellykket levering av den cellebelastede pre-gelen. Videre, mens vi brukte MSC som cellemodell for å demonstrere (i) fordelingen av cellene med pre-gel som leveringskjøretøy og (ii) bioreaktorsystemets evne til å dyrke de nylig frøcellene på denuded trachea lumen, bruk av stamceller (f.eks. basalceller) og primære epitelceller i luftveier i fremtidige studier kan gjøre det mulig å studere celledifferensiering og funksjonell epitelcelleregenerering24, 25. I tillegg kan fremtidige studier omfatte å legge til et luftvæskegrensesnitt (ALI) til den nåværende plattformen for å generere in vivo-lignende skjærspenning på frøceller for generering av funksjonell epitel. For å legge ALI til den nåværende enheten, kan en liten dyreventilator kobles til luftrøret for å ventilere luftrøret. Videre, for å oppnå ALI, kan tynnfilmavsetningsmetoden brukes til å innpode en kulturmediumvæskeplugg i cellefrørøret. Tykkelsen på væskefilmen kan moduleres ved å endre væskeplugghastigheten26,27. Pluggen kan startes etter at de nylig frøcellene fester seg og engraft fast på luftrøret lumen.

I tillegg er in situ GRIN linsebasert bildebehandlingstilnærming som brukes i denne protokollen, avgjørende for å bekrefte effekten av de-epitelaliseringen og vurdere kvaliteten på fordelingen av nylig frøceller. I motsetning til konvensjonelle vevsanalyser, som histologi og immunfluorescens, som krever dissekering av prøvene fra luftrøret vev for analyse, imaging plattformen utviklet i vår studie tillater rask og ikke-destruktiv overvåking av luftveiene lumen under de-epitelialisering og celle levering. For å holde luftrøret sterilisert under in situ-avbildning , sørg for å sterilisere GRIN-linsen ved å tørke den med 70% IPA eller etanol før du introduserer den i luftrørets lumen. Videre, for å avbilde cellene ved hjelp av GRIN-linsen, kan cellene (enten endogene trakeale epitelceller eller nylig implanterte celler) merkes med forskjellige fluorescerende fargestoffer med forskjellige eksitasjons- / utslippsbølgelengder. For å gjøre dette, sørg for å bruke riktig laserlysgenerator for å begeistre de fluorescerende merkede cellene og integrere de riktige filterlinsene til det tokantede dichroic-speilet med superoppløsning.

Til tross for nyheten og nyskapende av-epitelalisering, cellelevering og in situ imaging metoder, har denne studien flere begrensninger. De-epitelialiserings- og celleleveringsmetodene som er beskrevet i denne studien, gjelder for små luftveier (diameter: mindre enn 3-4 mm) der overflatespenningen er dominerende. Å danne en flytende plugg og lage en tynn film av av-epitelialiseringsløsningen eller cellebelastet pre-gel suspensjon i større luftveier, som svin og menneskelig luftrør, eller bronkier, kan være utfordrende ettersom overflatespenningen blir ubetydelig sammenlignet med andre krefter, spesielt tyngdekraften. Videre, ved å bruke tynnfilmavsetningsmetoden og modulere tid og konsentrasjon, var vi i stand til å fyre opp epitelet med et sterkt vaskemiddel (SDS) og bevare det underliggende vevslaget. I fremtidige studier kan imidlertid mildere decellulariseringsvaskemidler, som 3-[(3-cholamidopropyl)-dimetylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS)28, eller ikke-vaskemiddelløsning, som natriumhydroksid (NaOH)29, testes for bevaring av ECM-komponenter og støtte av nylig implanterte celler. Videre reduseres fluorescensintensiteten til CFSE-merkede celler over tid på grunn av oppdelingen av cellene. I vår studie viste de fluorescerende bildene av MSC dyrket på de epitelialiserte trakeas i 4 dager en betydelig nedgang i fluorescensintensiteten. For langvarig overvåking og sporing av eksogene celler frøet på vevstillasene, ville det være nødvendig med forskjellige cellemerkingsmetoder som kan tillate langsiktig eller permanent fluorescerende merking av cellene.

Vi ser for oss at den bildestyrte bioreaktorplattformen og cellefjernings- og leveringsprotokollene som er beskrevet i denne rapporten, kan tillate opprettelse av de-epitelialiserte luftveisvevstillaser som kan brukes til å generere bioengineered luftveisvev. Slike in vitro luftveier kan tilby high-fidelity in vitro modellering av menneskelige luftveissykdommer og narkotika screening. For eksempel, for å etablere funksjonell luftveis epitel, kan luftveis basale stamceller først implanteres på av-epitelialisert luftveisvev30. Deretter kan luftvæskegrensesnittet (ALI), som er kritisk for differensiering av basale stamceller i ulike epitelceller, genereres i luftrøret. Videre kan in situ-bildesystemet modifiseres og brukes til å fluorescerende visualisere luftveiene til pasienter med lungeluftveisforstyrrelser. For å brukes klinisk for å evaluere luftveisvev in situ, kan den stive GRIN-linsen erstattes med fleksible optiske fiberavbildningssonder for å navigere i luftveiene. Videre kan evnen til homogent å distribuere cellene inne i luftveiene ved hjelp av hydrogelbasert cellesåing gi en enestående mulighet til å erstatte skadet eller skadet epitel hos pasienter. Spesielt kan celleerstatningsmetoden utviklet og brukt i denne studien akselerere cellebasert behandling for behandling av respiratoriske lidelser, for eksempel cystisk fibrose og primær ciliary dyskinesi, og reparere donor lunger som nektes for transplantasjon på grunn av alvorlig skadet luftveisvev 31,32,33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Denne forskningen har delvis blitt støttet av American Thoracic Society Foundation Research Program, New Jersey Health Foundation og National Science Foundation (CAREER Award 2143620) til J.K.; og National Institutes of Health (P41 EB027062) til G.V.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1× PBS Gibco, Thermo Fisher Scientific 10-010-031
3-port connector World Precision Instruments 14048-20
4-port connector World Precision Instruments 14047-10
Accelerometer STMicroelectronics IIS3DWBTR
Achromatic doublet Thorlabs AC254-150-A-ML
Aluminum pin stub TED PELLA 16111
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240062
Assembly rod Thorlabs ER1
Button head screws McMaster-Carr 91255A274
Cage cube Thorlabs C4W
Carbon double-sided conductive tape TED PELLA 16073
CFSE labelling kit Abcam ab113853
Citrisolv (clearing agent) Decon 1061
C-mount adapter Thorlabs SM1A9
Collagen I Advanced BioMatrix 5153
Conductive liquid silver paint TED PELLA 16034
Dichroic mirror Semrock DI03-R488 Reflected laser wavelengths:  473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco, Thermo Fisher Scientific 11965118
Female luer bulkhead to hose barb adapter Cole-Parmer EW-45501-30
Female luer to tubing barb Cole-Parmer EW-45508-03
Female to male luer connector Cole-Parmer ZY-45508-80
Fetal bovine serum Gibco, Thermo Fisher Scientific 10082147
Filter lens Chroma Technology Corp ET535/50m
Fluorescent microscope Nikon Eclipse E1000 - D
Fusion 360 Autodesk
Hex nut McMaster-Carr 91813A160
Hexamethyldisilazane (HMDS) Fisher Scientifc AC120585000
Imaging fiber SELFOC, NSG group GRIN lens
Laser Opto Engine MDL-D-488-150mW
Lens tubes Thorlabs SM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) Thermo Fisher Scientific L3224
MACH 3 CNC Control Software Newfangled Solutions
Objective lens Olympus UCPLFLN20X
Peristaltic Pump Cole Parmer L/S standard digital pump system
Recombinant human FGF-basic PeproTech 100-18B
Retaining ring Thorlabs SM1RR
Scientific CMOS camera PCO Panda PCO Panda 4.2
Sodium dodecyl sulfate VWR 97064-472
Solidworks (2019) Dassault Systèmes
Stackable lens tube Thorlabs SM1L10
Subwoofer plate amplifier Dayton Audio SPA250DSP
Subwoofer speaker Dayton Audio RSS21OHO-4 Diaphragm diameter: 21 cm
Syringe Pump World Precision Instruments AL-4000
Threaded cage plate Thorlabs CP33
Threaded luer adapter Cole-Parmer EW-45513-81
Tube lens Thorlabs AC254-150-A-ML
Tygon Tubing Cole-Parmer 13-200-110
XY Translator Thorlabs CXY1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).
  3. Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
  4. Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).
  5. De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).
  6. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  7. Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
  8. Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
  9. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  10. Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
  11. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  12. Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).
  13. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
  14. Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
  15. Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
  16. Planchard, D. Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , SDC Publications. (2022).
  17. Coward, C. A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , No Starch Press. (2019).
  18. Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
  19. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  20. Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
  21. Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
  22. Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
  23. Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
  24. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
  25. Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
  26. Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
  27. Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).
  28. O'Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
  29. Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
  30. Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).
  31. O'Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).
  32. Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).
  33. Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
  34. Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).

Tags

Bioingeniør utgave 182
Bildestyrt bioreaktor for generering av bioingeniør luftveisvev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mir, S. M., Chen, J., Pinezich, M.… More

Mir, S. M., Chen, J., Pinezich, M. R., O’Neill, J. D., Guenthart, B. A., Vunjak-Novakovic, G., Kim, J. Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue. J. Vis. Exp. (182), e63544, doi:10.3791/63544 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter