Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Биореактор с визуальным контролем для создания биоинженерной ткани дыхательных путей

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63544
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 4, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Stevens Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 3Department of Cell Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 4Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University

Summary

Протокол описывает биореактор с поддержкой визуализации, который позволяет селективно удалять эндогенный эпителий из трахеи крыс и гомогенное распределение экзогенных клеток на поверхности просвета с последующим долгосрочным посевом in vitro клеточно-тканевой конструкции.

Abstract

Повторное повреждение тканей дыхательных путей может ухудшить функцию легких и вызвать хроническое заболевание легких, такое как хроническая обструктивная болезнь легких. Достижения в области регенеративной медицины и технологий биореакторов предлагают возможности для производства выращенных в лаборатории функциональных тканей и структур органов, которые могут быть использованы для скрининга лекарств, моделирования заболеваний и инженерных замен тканей. Здесь описан миниатюрный биореактор в сочетании с модальностью визуализации, которая позволяет in situ визуализировать внутренний просвет эксплантированной трахеи крысы во время манипуляций с тканями in vitro и культивирования. Используя этот биореактор, протокол демонстрирует селективное удаление эндогенных клеточных компонентов с помощью визуализации при сохранении внутренних биохимических особенностей и ультраструктуры тканевого матрикса дыхательных путей. Кроме того, показаны доставка, равномерное распределение и последующая длительная культивирование экзогенных клеток на децеллюляризированном просвете дыхательных путей с оптическим мониторингом in situ . Результаты подчеркивают, что биореактор под визуальным контролем потенциально может быть использован для облегчения генерации функциональных тканей дыхательных путей in vitro .

Introduction

Просветная поверхность дыхательных путей выстлана слоем эпителия, который в основном состоит из мультиреснитильных, клубных, бокаловидных и базальных стволовых клеток 1,2. Эпителиальный слой служит основным защитным механизмом легкого, действуя как биофизический барьер, который защищает подлежащую ткань дыхательных путей от вдыхаемых патогенов, частиц или химических газов. Он защищает ткань дыхательных путей с помощью нескольких механизмов, включая образование межклеточных плотных соединений, мукоцилиарный клиренс и антимикробную и антиоксидантную секрецию 3,4. Дефектный эпителий дыхательных путей связан с разрушительными респираторными заболеваниями, такими как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ)5, первичная цилиарная дискинезия (PCD)6 и муковисцидоз (CF)7.

Достижения в технологии «легкие на чипе» (LOC) представляют собой возможность изучать развитие легких человека, моделировать различные заболевания легких и разрабатывать новые терапевтические материалы в жестко регулируемых средах in vitro . Например, эпителий дыхательных путей и эндотелий могут быть культивированы на противоположных сторонах тонкой пористой мембраны, чтобы имитировать газообменную легочную ткань, что позволяет точно моделировать заболевание и тестировать лекарства8. Аналогичным образом, модели заболеваний in vitro были созданы для моделирования заболеваний дыхательных путей in vitro, таких как ХОБЛ9 и муковисцидоз10. Однако основной проблемой устройств LOC является повторение сложной трехмерной (3D) архитектуры легочной ткани и динамических матричных взаимодействий между клетками и тканями in vitro11.

В последнее время были разработаны инновационные методологии тканевой инженерии, которые позволяют манипулировать тканями легких ex vivo 12. Используя эти методологии, оголенные аллогенные или ксеногенные тканевые трансплантаты могут быть получены путем удаления эндогенных клеток из легочной ткани с помощью химической, физической и механическойобработки 13. Кроме того, сохраненный нативный тканевый внеклеточный матрикс (ECM) в децеллюляризованных каркасах легких обеспечивает физио-миметические структурные, биохимические и биомеханические сигналы для имплантированных клеток для прикрепления, пролиферации и дифференцировки14,15.

Здесь сообщается о системе биореакторов с визуальным контролем, созданной путем объединения технологий LOC и тканевой инженерии, чтобы позволить манипулировать тканями in vitro и культивировать эксплантированные ткани трахеи крыс. Используя этот биореактор тканей дыхательных путей, протокол демонстрирует селективное удаление эндогенных эпителиальных клеток без нарушения нижележащих субэпителиальных клеточных и биохимических компонентов ткани дыхательных путей. Далее мы показываем однородное распределение и мгновенное осаждение вновь посеянных экзогенных клеток, таких как мезенхимальные стволовые клетки (МСК), на оголенный просвет дыхательных путей путем закапывания клеточного раствора коллагена I. Кроме того, с помощью микрооптического устройства визуализации, интегрированного в биореактор, также выполняется визуализация просвета трахеи при удалении эпителия и доставке эндогенных клеток. Далее показано, что трахею и вновь имплантированные клетки можно культивировать в биореакторе без заметной гибели клеток и деградации тканей в течение 4 дней. Мы предполагаем, что платформа биореактора с поддержкой визуализации, метод деэпителизации на основе тонкой пленки и метод доставки клеток, используемый в этом исследовании, могут быть полезны для создания тканей дыхательных путей для моделирования заболеваний in vitro и скрининга лекарств.

Биореактор включает в себя прямоугольную камеру, соединенную с программируемым шприцевым насосом, перфузионный насос и вентилятор для культивирования изолированной трахеи крысы. Биореактор имеет входы и выходы, соединенные с трахеей или камерой культуры тканей, для отдельной подачи реагентов (например, питательных сред) во внутреннее и внешнее пространства трахеи (рисунок 1). Специально разработанная система визуализации может быть использована для визуализации внутренней части трахеи крысиной культуры in vitro на клеточном уровне (рисунок 2). Эндогенный эпителий трахеи удаляется путем закапывания раствора для децеллюляризации на основе моющего средства с последующим вибрационным промыванием дыхательных путей (рисунок 3). Раствор гидрогеля, такой как коллаген I типа, используется в качестве средства доставки для равномерного и мгновенного посева экзогенных клеток через оголенный просвет трахеи (рисунок 4). Все материалы, используемые для построения биореактора и проведения экспериментов, приведены в Таблице материалов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Приведенный ниже протокол по тканям животных был одобрен руководством по благополучию животных и правилами Комитета по уходу и использованию животных (IACUC) в Технологическом институте Стивенса и соответствует руководящим принципам Национального института здравоохранения (NIH) по использованию экспериментальных животных.

1. Проектирование и конструирование биореактора трахеи крыс с визуальным контролем

  1. Проектирование и изготовление биореактора трахеи крыс
    1. Создайте модель автоматизированного проектирования (CAD) камеры биореактора с соответствующей конструкцией, такой как входные отверстия, выпускные отверстия и камера культуры тканей, используя программное обеспечение генератора САПР. Для этого исследования используйте геометрию и размеры, представленные на рисунке 1A-C. Учебник программного обеспечения генератора САПР можно найти в16,17.
    2. Экспортируйте сгенерированную модель САПР в программное обеспечение контроллера с числовым программным управлением (ЧПУ) и вырежьте политетрафторэтилен (PTFE) пластик с помощью станка с ЧПУ для создания камеры биореактора. Учебник по программному обеспечению контроллера ЧПУ можно найти в18.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к PTFE, другие пластмассовые материалы, такие как сверхвысокомолекулярный полиэтилен (UHMWPE) и полиэфиримид, могут быть использованы для изготовления культуральной камеры.
    3. Стерилизуйте все компоненты биореактора, такие как адаптеры и винты Luer, чтобы избежать загрязнения тканей и клеток, культивируемых в устройстве. Соберите все компоненты биореактора в основную камеру культуры тканей в чистой среде (рисунок 1А).
  2. Построение устройства визуализации на основе объектива с индексом градиента (GRIN)
    1. Чтобы создать устройство визуализации in situ , вставьте линзу трубки в штабелируемую трубку линзы и закрепите ее с помощью стопорного кольца. Установите трубку объектива в сборе на научную КМОП-камеру с помощью адаптера C-mount.
    2. Используйте программное обеспечение, такое как Micro-Manager, для управления камерой и получения фотографий и видео. Направьте объект, расположенный на большом расстоянии (например, 10 м от камеры) и отрегулируйте расстояние между ламповым объективом и датчиком изображения камеры до тех пор, пока сфокусированное изображение объекта не будет сформировано на экране компьютера используемым программным обеспечением для визуализации.
    3. Установите фильтрующую линзу на двухгранное дихроичное зеркало сверхвысокого разрешения и лазер на устройство с помощью компонентов системы оптического сепаратора, включая сборочный стержень, резьбовую пластину клетки и куб клетки.
    4. Подключите объектив (20x) к устройству. Установите объектив GRIN (диаметр = 500 мкм) на дистальный конец трубки объектива с помощью транслятора XY. Отрегулируйте расстояние между объективом GRIN и объективом для формирования сфокусированных микроскопических изображений (рисунок 2A, B).

2. Выделение трахеи крысы

  1. Продезинфицируйте хирургическую область и стерилизуйте хирургические инструменты с помощью автоклава при 121 °C в течение 30 минут до операции.
  2. Поместите крысу в индукционную камеру и доставьте 2,5% изофлурана в течение 15 минут, используя небольшой испаритель для анестезии животного. Оцените глубину анестезии с помощью педального рефлекса. Для этого крепко ущипните палец ноги и подтвердите, что животное не реагирует на защемление пальца ноги.
  3. После анестезии удалите изофлуран из камеры и введите 1 мл 1000 единиц / мл гепарина через боковую хвостовую вену, чтобы предотвратить свертывание крови в легочной сосудистой системе.
  4. Чтобы усыпить животное, подвергайте животное воздействию 5% изофлурана в течение дополнительных 15-20 мин. Извлеките животное из индукционной камеры и поместите его на хирургическую доску в положении лежа на спине лицом вверх.
  5. Зафиксируйте крысу на хирургической доске, обездвижив ноги и хвост с помощью клейкой ленты. Затем стерилизуйте области шеи и грудной клетки крысы, используя 70% изопропиловый спирт (IPA). Откройте брюшную полость, сделав разрез 3-4 см ножницами в коже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не разрезать кожу глубоко, направив кончики ножниц вверх.
  6. Трансекция нижней полой вены (IVC) с помощью ножниц и подтверждение эвтаназии путем экссангинации.
  7. Выполните трахеотомию, сделав разрез с помощью ножниц в средней линии шеи и обнажив трахею. Выполните торакотомию средней линии, сделав разрез в грудной стенке и разрезав между ребрами, чтобы достичь конца трахеи, соединенного с легким. Затем используйте бицепс и ножницы, чтобы разрезать оба конца трахеи и изолировать трахею.
  8. После выделения промыть трахею, используя 20 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (1x PBS). Перенесите трахею на биореактор с помощью стерилизованных бицепсов. Закрепите два конца трахеи на разъеме Luer с помощью шовной резьбы 4-0.
  9. Подайте 5 мл питательной среды в камеру биореактора с помощью программируемого шприцевого насоса через трубку, подключенную к камере биореактора со скоростью потока 5 мл/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культуральная среда состоит из модифицированной среды Dulbecco Eagle's (DMEM), рекомбинантного человеческого FGF-основного (0,1 нг/ мл), фетальной бычьей сыворотки (FBS, 10%) и антибиотика-антимикотика (1%).
  10. Плотно закройте крышку биореактора акриловой пластиковой крышкой и винтами. Закройте соединения трубки камеры биореактора с мужскими/женскими пробками Luer, чтобы предотвратить поступление питательной среды в трубку.

3. Удаление эпителия трахеи с помощью визуализации

  1. Чтобы визуализировать просвет трахеи в ярком поле или флуоресцентном виде, поместите биореактор на стадию визуализации (рисунок 3A).
  2. Приготовьте раствор карбоксифлуоресцеина сукцинимидилового эфира (CFSE) (концентрация: 100 мкМ) в наборе для маркировки клеток CFSE, разбавив раствор CFSE 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация исходного раствора CFSE составляет 10 мМ (в диметилсульфоксиде (DMSO)).
  3. Вводят 500 мкл раствора CFSE через трахею через шприцевой насос через трубку, соединенную с канюлей трахеи со скоростью потока 5 мл/мин. Остановите насос, когда раствор CFSE заполнит трахею. Подождите 10 мин, а затем промыть просвет трахеи инфузией 10 мл 1x PBS с помощью шприцевого насоса для удаления остаточного невключенного реагента CFSE.
  4. Вставьте конец дистальной визуализации линзы GRIN в трахею через разъем Luer, прикрепленный к одному концу трахеи. Затем осторожно переместите линзу GRIN внутрь трахеи до тех пор, пока поверхность трахеи не будет сфокусирована, и делайте фотографии и видео в ярком поле или флуоресценции при 20-кратном увеличении.
  5. Для захвата изображений яркого поля в программном обеспечении Micro-Manager выполните следующие действия.
    1. Введите белый свет через куб клетки, чтобы осветить просвет трахеи. Нажмите на значок Live , чтобы отобразить светящуюся поверхность трахеи в режиме реального времени. Используйте параметр «Настройка изображения» > экспозиции (мс), чтобы изменить время экспозиции до требуемого значения. В этом исследовании используемое время воздействия было в диапазоне 10 мс и 50 мс.
    2. Чтобы настроить контрастность и яркость изображений, используйте окно «Масштабирование гистограммы и интенсивности » для перемещения черно-белых стрелок в конечную точку интерактивного дисплея гистограммы. Кроме того, можно использовать опцию Auto Stretch , которая позволяет программному обеспечению автоматически настраивать яркость и контрастность до оптимальных уровней.
    3. Нажмите на значок Snap , чтобы заморозить изображение. Затем используйте Параметр > Экспорт изображений как смещенных , чтобы сохранить изображения в нужном формате. Кроме того, можно использовать параметр «Настройка > ImageJ », чтобы напрямую экспортировать изображение в программное обеспечение ImageJ и сохранить его.
  6. Для получения фотографий и видео в флуоресцентном режиме освещайте просвет трахеи с помощью CFSE-специфического лазерного света (CFSE: длина волны возбуждения: 488 нм, длина волны излучения: 515 нм) через куб клетки. Выполните шаги 3.5.2-3.5.3 для получения изображений. После фото- и видеосъемки аккуратно снимите линзу GRIN с трахеи.
  7. Выполните деэпителизацию, как описано ниже.
    1. Приготовьте 2% раствор для децеллюляризации додецилсульфата натрия (SDS) в дистиллированной (DI) воде. Закапывают 50 мкл SDS через трахею со скоростью потока 6,3 мл/мин, используя шприцевой насос через канюлю трахеи, чтобы получить тонкую пленку раствора моющего средства на просвете трахеи.
    2. Закройте соединения трубк биореактора с помощью мужских/женских пробок Luer и перенесите биореактор в инкубатор. Дайте SDS обитать в трахее в течение 10 мин при 37 °C. Закапывают еще 50 мкл раствора SDS через трахею и инкубируют в течение 10 мин.
    3. Удаляют лизированный эпителий и SDS путем орошения просвета трахеи 500 мкл 1x PBS через шприцевой насос со скоростью потока 10 мл / мин в течение 3x. Поместите биореактор на шейкер и механически вибрируйте биореактор с частотой 20 Гц и амплитудой смещения примерно 0,3 мм, чтобы физически способствовать отсоединению эпителиальных клеток, обработанных SDS, от просвета трахеи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании шейкер был изготовлен на заказ путем сборки динамика сабвуфера, пластинчатого усилителя сабвуфера и акселерометра. Синусоидальная форма сигнала генерировалась компьютером и подавалась в шейкер через усилитель, в то время как отклик шейкера контролировался с помощью акселерометра (рисунок 3B). Кроме того, обычные шейкеры, такие как электромагнитные и инерционные шейкеры, могут быть использованы для содействия отслоению клеток. Для этого установите частоту и ускорение шейкера на 20 Гц и 0,5 g соответственно (что эквивалентно амплитуде смещения 0,3 мм).
    4. Закапывайте 500 мкл 1x PBS дважды через просвет трахеи, чтобы удалить остаточный SDS и клеточный мусор, пока трахея механически вибрирует. После процедуры удаления эпителия оцените клиренс эпителиального слоя путем измерения интенсивности CFSE с помощью устройства визуализации линзы GRIN, как на этапе 3.6 (рисунок 3C).

4. Подготовка ткани трахеи к дальнейшим анализам

  1. Чтобы подтвердить удаление эпителия, выполните дальнейшие анализы тканей, такие как окрашивание гематоксилином и эозином (H & E), трихром, пентахром и иммуноокрашивание. Для этого удаляют трахею из биореактора и фиксируют ее в 30 мл 4% нейтрального буферного раствора параформальдегида в 1x PBS (pH = 7,4) при 4 °C в течение ночи.
  2. Обезвоживайте и встраивайте фиксированную ткань трахеи, выполнив следующие шаги.
    1. После фиксации промыть ткань трахеи 10 мл 1x PBS, перевести трахею в 30 мл 70% спирта и держать при 4 °C в течение ночи. Разрежьте трахею на небольшие цилиндрические срезы (~5 мм) острым лезвием и вставьте участки ткани во встраиваемые в ткань кассеты (длина х ширина х высота: 4 см х 2,5 см х 0,5 см). Держите два участка трахеи в каждой кассете.
    2. Обезвоживать срезы в серии растворов изопропилового спирта (МПА) - 85%, 90%, 95%, 100% - в течение 1 ч в 30 мл каждого раствора. Удалите предыдущее решение перед добавлением следующего решения.
    3. По завершении погружают кассеты в 30 мл расчистного агента (например, ксилола) на 2 ч, чтобы полностью вытеснить раствор IPA из срезов ткани. Выполните этот шаг в вытяжке с надлежащей вентиляцией.
    4. Погрузите кассеты в парафин на 2 ч, а затем вставьте их в парафин при 4 °C на ночь. Затем разрезайте парафиновые ткани на тонкие участки (5-8 мкм) с помощью микротомового устройства для H&E, трихрома, пентахрома и иммуноокрашивания.
  3. Для подготовки тканей к сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) анализу зафиксируют трахею в 30 мл 2,5% раствора глутаральдегида в 1x PBS (pH = 7,4) при 4 °C в течение ночи. Затем обезвоживайте фиксированную ткань трахеи для SEM, выполнив следующие шаги.
    1. После фиксации промыть ткань трахеи 10 мл 1x PBS. Разрежьте ткань трахеи продольно на небольшие полуцилиндровые срезы (длина: ~5 мм) ножницами и вставьте участки ткани в кассеты.
    2. Обезвоживать срезы в серии растворов АПА - 35%, 50%, 70%, 85%, 95% и 100% - в течение 10 мин в 30 мл каждого раствора. Удалите предыдущее решение перед добавлением следующего решения.
    3. Выполняют метод сушки на основе гексаметилдисилазана (HMDS) путем погружения тканей в следующие растворы: 100% IPA: HMDS (2: 1; v / v) в течение 10 мин, затем 100% IPA: HMDS (1: 2; v / v) в течение 10 мин и, наконец, 100% HMDS на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: HMDS токсичен. Работайте под вытяжным кожухом на всех этапах сушки.
    4. Удалите ткани из раствора HMDS и дайте им высохнуть под вытяжкой в течение 1 ч. Установите секцию на алюминиевые заглушки с помощью углеродной двусторонней проводящей ленты или серебряной проводящей пасты для визуализации SEM.

5. Однородное распределение экзогенных клеток по оголенному просвету трахеи

  1. Подготовьте деэпителизированную трахею крысы, используя протокол на шаге 3. Оттаивайте замороженные мезенхимальные стволовые клетки (МСК) в течение 30 с на водяной бане с температурой 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании мы использовали мезенхимальные стволовые клетки (МСК) в качестве модельной клетки, чтобы показать распределение экзогенных клеток на деэпителиализованной трахее. В идеале, эпителиальные клетки первичных дыхательных путей, базальные клетки или индуцированные плюрипотентные клетки человека (iPSCs) могут использоваться для целей регенерации эпителия.
  2. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и приготовьте клеточный раствор с концентрацией 5 х 106 клеток/мл. Метят клетки флуоресцентно, инкубируя клетки с 2 мл раствора CFSE (концентрация: 100 мкМ) при комнатной температуре в течение 15 мин. Промыть клетки 5 мл 1x PBS в течение 3x и повторно суспендировать клетки в свежей питательной среде в конечной концентрации 3 x 107 клеток/мл.
  3. Готовят раствор гидрогеля предварительного геля в качестве средства для доставки клеток. Для этого исследования используйте коллаген I в качестве средства доставки для клеток МСК и следуйте инструкциям производителя по приготовлению предварительного геля. Например, для получения 3,6 мг/мл коллагенового предварительного геля смешайте одну часть охлажденного нейтрализационного раствора с девятью частями коллагена крысиного хвоста в стерильной трубке объемом 1,5 мл. Затем аккуратно пипетируйте смесь вверх и вниз для адекватного перемешивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие биосовместимые гидрогели могут быть использованы вместо коллагена I в соответствии с исследованием и потребностями пользователя.
  4. Как только раствор гидрогеля приготовлен, быстро добавьте клетки к раствору с желаемой концентрацией (например, 5 х 106 клеток/мл). Для получения однородной клеточно-гидрогелевой смеси смешайте клетки и раствор геля путем аккуратного пипетирования микропипеткой.
  5. Прикрепите один конец трахеи внутри биореактора к программируемому шприцевому насосу через разъем Luer. Подайте 5 мл свежей питательной среды при 37 °C в камеру биореактора для покрытия наружной поверхности трахеи с помощью шприцевого насоса со скоростью потока 5 мл /мин.
  6. Введите болюс 10 мкл клеточно-гидрогелевой смеси в деэпителиализованную трахею внутри биореактора с помощью шприцевого насоса со скоростью потока 5 мл/мин для создания слоя клеточного гидрогеля на просвете трахеи (рисунок 4).
  7. После инъекции клетки поместите биореактор в стерильный инкубатор клеточных культур при 37 °C и 5% CO2 для гелеобразования. Для коллагена I гелеобразование происходит через 30 мин.
  8. Чтобы визуализировать распределение имплантированных клеток, стерилизуйте линзу GRIN путем протирания 70% IPA или этанолом и поместите биореактор на стадию визуализации. Делайте фотографии и видео как в ярко-полевом, так и в флуоресцентном режимах по мере необходимости.
  9. После 30 мин посева клеток вводят 1 мл питательной среды в просвет трахеи с помощью шприцевого насоса со скоростью потока 1 мл/мин.
  10. Культивируйте клеточную трахею внутри биореактора в инкубаторе при 37 °C в течение желаемого времени. Для длительного культивирования обновляйте питательную среду в просвете трахеи и камере биореактора каждые 24 ч. Во время клеточной культуры сохраняйте среду внутри просвета статичной и изменяйте ее каждые 24 ч, в то время как среда вне трахеи непрерывно перфузится однонаправленным потоком со скоростью 5 мл/мин.
  11. После культивирования клеток в течение определенного периода времени (например, 1 и 4 дня в этом исследовании) удалите трахею из биореактора. Используйте ножницы, чтобы разрезать трахею продольно на две полуцилиндровые секции (т.е. верхнюю и нижнюю секции) на 1 и 4 день культуры in vitro , чтобы обнажить внутренние поверхности для мониторинга роста клеток и расчета плотности клеток. Используйте обычный флуоресцентный микроскоп для визуализации клеток на внутренних поверхностях.
  12. Чтобы получить изображения с помощью программного обеспечения Micro-Manager, выполните шаги 3.5 и 3.6. Используйте фильтр флуоресцеина изотиоцианата (FITC) для визуализации клеток, меченных CFSE, в режиме флуоресценции. Анализируйте изображения, полученные флуоресцентным микроскопом, и рассчитывайте плотность клеток на верхней и нижней секциях с помощью программного обеспечения ImageJ. Чтобы рассчитать количество ячеек и плотность ячеек, выполните следующие действия.
    1. Откройте изображение в программном обеспечении ImageJ и преобразуйте его в двоичное изображение (16-битное) с помощью Image > Type > 16-bit. Задайте масштаб изображения с помощью шкалы с помощью функции «Анализ > «Задать масштаб».
    2. Отрегулируйте пороговое значение изображения, чтобы выделить структуры клеток для подсчета. Используйте image > Adjust > Threshold. Используйте Анализ > Анализ частиц для подсчета количества ячеек. Рассчитайте плотность ячеек, разделив количество ячеек на площадь поверхности изображения.
  13. Чтобы оценить жизнеспособность после посева клеток, используйте набор жизнеспособности клеток. Для этого исследования инкубируют ткань трахеи и клетки в биореакторе при 37 °C в течение 6 ч и окрашивают клетки 4 мМ кальциина-AM и 2 мМ этидия гомодимера-1 в 1 мл 1x PBS при комнатной температуре в течение 15 мин.
  14. После промывки 1x PBS визуализируйте клетки с помощью флуоресцентного микроскопа. Подсчитайте живые и мертвые клетки, выполнив действия, описанные в шаге 5.12. Рассчитайте жизнеспособность клеток как процент живых клеток (окрашенных кальцеином-AM) на общее количество клеток (как живых, так и мертвых клеток).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Метод визуализации in situ на основе линзЫ GRIN может позволить визуализацию внутреннего просвета трахеи in situ (рисунок 5A). С помощью этого метода визуализации можно получить как ярко-полевые, так и флуоресцентные изображения нативной и деэпителизированной трахеи (рисунок 5B,C). Флуоресцентный сигнал не наблюдался от нативной трахеи до маркировки CFSE (рисунок 5Bii). Однако, когда эпителий трахеи был помечен красителем CFSE, во всем эпителии наблюдался однородный флуоресцентный сигнал (зеленый) (рисунок 5Ci). После деэпителизации с помощью SDS и вибрационного орошения дыхательных путей интенсивность флуоресцентного сигнала была значительно снижена (рисунок 5Cii), что указывает на абляцию эпителия.

Изображения H&E деэпителизированной трахеи показали удаление псевдостратифицированного эпителия из просвета трахеи и сохранение клеток и микроструктуры ECM в нижележащих слоях тканей (рисунок 6A). Кроме того, пентахром (рисунок 6B) и трихромное окрашивание (рисунок 6C) подтвердили сохранение архитектуры ткани трахеи и компонентов ECM, таких как коллаген и протеогликаны. Кроме того, иммунофлуоресценция эпителиальных клеток (молекула адгезии эпителиальных клеток, EpCAM; Рисунок 6D) и коллаген I (рисунок 6E) выявили полное удаление эпителия и сохранение коллагена I в субэпителиальной ткани. SEM-визуализация нативной трахеи показала, что просветная поверхность нативной трахеи крыс в основном была заселена мультиреснитчатыми клетками и бокаловидными клетками. С другой стороны, SEM-изображения деэпителизированного просвета трахеи показали, что базальная мембрана подвергалась воздействию, на что указывает сетка волокон ECM и отсутствие эпителиальных клеток (рисунок 6F).

Используя деэпителиализованные трахеи крыс и флуоресцентно меченые клетки, мы исследовали, может ли включение гидрогеля в качестве средства доставки клеток достичь однородного распределения клеток на деэпителиализованный просвет трахеи (рисунок 7A, B). В этом исследовании мезенхимальные стволовые клетки (МСК) были использованы в качестве модельных клеток для исследования доставки клеток и культуры. Как описано в протоколе (шаг 5), мы закапывали MSC-нагруженный коллаген I пре-гель в деэпителиализованную трахею крысы и контролировали распределение клеток на просвете трахеи с помощью системы визуализации линзы GRIN. В качестве контрольного эксперимента мы суспендировали МСК в питательной среде, ввели питательную среду с клеточной нагрузкой в трахею и визуально проверили распределение клеток. Результаты визуализации in situ показали, что флуоресцентно меченые клетки, доставленные через гидрогель, оставались более равномерно приклеенными к просвету, чем те, которые были засеяны через культуральную среду (рисунок 7B). Затем мы проверили жизнеспособность клеток до и после доставки клеток, чтобы оценить потенциальное повреждение и гибель клеток из-за сдвигового стресса во время инфузии клеток. Результат показал, что жизнеспособность клеток не была существенно затронута процедурой доставки клеток, поскольку более 90% клеток оставались жизнеспособными (рисунок 7C).

Кроме того, мы культивировали трахею с клеточным семенем в течение 4 дней. Клетки, посеянные как через коллаген, так и через культуральную среду (контроль), размножались на деэпителиализованной поверхности просвета трахеи, о чем свидетельствует увеличение числа клеток, экспрессирующих CFSE с течением времени как в верхней, так и в нижней половине просвета трахеи (рисунок 7D). Примечательно, что в группе доставки гидрогеля коллагена разница в плотности клеток между верхним и нижним просветами была меньше, чем в контрольной группе, что указывает на то, что доставка клеток через гидрогель способствует однородному распределению клеток по всему просвету трахеи.

Figure 1
Рисунок 1: Трехмерный (3D) компьютерный чертеж биореактора трахеи. (A) (i) вид сбоку, (ii) вид сверху. (B) Размеры камеры биореактора. (C) Прозрачный акриловый пластиковый лист разрезается и прикрепляется к верхней части основной камеры с помощью винтов. Единица измерения = мм; R = радиус. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Индивидуальная микроволокнистая визуализация для визуализации трахеи крыс in situ . (A) (i) Схема компонентов настройки изображения светового контура. Сокращения: C = камера, TL = трубчатый объектив, F = фильтр, DM = дихроичное зеркало, OL = объектив; (ii) фотография компонентов установки визуализации, показывающая зонд визуализации (объектив GRIN), вставлена в разъем Luer биореактора. (B) Схема, показывающая, что линза GRIN интегрирована с биореактором. (C) Фотография, показывающая зонд визуализации, используется для визуализации трахеи внутри биореактора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Платформа для деэпителизации трахеи крыс. (А) Фотография, показывающая экспериментальную установку для деэпителизации и визуализации оптического волокна in situ . (B) Диаграмма, показывающая компонент и сборку специально изготовленного электромагнитного шейкера, используемого для облегчения удаления эпителия. ω: частота, a: амплитуда (C) Схема, показывающая рабочий процесс процедуры деэпителизации трахеи крыс. PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Доставка экзогенных клеток в деэпителиализованную трахею крыс с помощью гидрогеля. Схема, показывающая раствор гидрогеля, используемый в качестве средства доставки для местного осаждения клеток на внутренний просвет деэпителизированной трахеи крысы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Визуализация in situ деэпителизированной трахеи. (A) Фотография, показывающая флуоресцентную визуализацию просвета трахеи, в то время как меченый CFSE эпителий возбуждается синим лазером 488 нм через объектив GRIN. (B) (i) Изображения яркого поля и (ii) флуоресцентные изображения просвета трахеи перед маркировкой эпителия. (C) Флуоресцентные изображения (i) нативной и (ii) деэпителизированной трахеи (De-Epi trachea), в то время как эпителий помечен флуоресцентным красителем CFSE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Гистология, иммунофлуоресцентный и SEM анализ нативных и деэпителизированных трахеи крыс. (A) Окрашивание H&E. (B) Окрашивание пентахромом, где фиолетовый - клеточная цитоплазма, синий - клеточные ядра, зеленый - протеогликаны (например, муцин), а желтый - коллагеновые волокна. (C) Трихромное окрашивание, где розовый - клеточная цитоплазма, темно-синий - клеточные ядра, а синий - коллаген. Флуоресцентные изображения нативных и деэпителизированных трахеи. (D) EpCAM и (E) коллаген I. Наконечники стрел показывают поверхность просвета трахеи. (F) SEM микроснимки просвета трахеи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Местное осаждение экзогенных МСК в просвете трахеи. (A) (i) Яркие полевые и (ii) флуоресцентные изображения деэпителизированной трахеи. (B) Флуоресцентные изображения деэпителизированного просвета трахеи при его заполнении (i) PBS и (ii) коллагеном I пре-гелем. Однородное распределение клеток по просвету трахеи достигается, когда прегель-коллаген используется в качестве средства доставки клеток. (C) (i) Флуоресцентные изображения и (ii) количественная жизнеспособность клеток до и после 6 ч доставки прегелевым коллагеном. n: количество образцов. Шаги 5.1 и 5.17 протокола были выполнены для оценки жизнеспособности клеток. D) Плотность посева клеток, измеренная после i) 1 дня и ii) 4 дней после посева и культивирования клеток. Плотность клеток рассчитывали путем деления чисел клеток по исследуемой площади поверхности. Все значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение. Односторонний анализ дисперсии (ANOVA) был использован для определения статистически значимых различий между группами, при этом p < 0,05 считались значимыми. Сокращения: CM = культуральная среда, C = коллаген. *p < 0,05. **p < 0,01. ns: незначимый. Отсутствие существенной разницы (ns) между верхней и нижней поверхностями означает равномерное распределение клеток по окружности трахеи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой работе мы создали биореактор с визуальным контролем, который может позволить (i) мониторинг просвета трахеи in situ после удаления клеток и доставки экзогенных клеток и (ii) долгосрочную культуру in vitro ткани трахеи, засеянной клетками. Используя этот специально разработанный биореактор, мы продемонстрировали (i) селективное удаление эндогенных эпителиальных клеток из просвета трахеи с помощью моющего средства и промывания дыхательных путей с помощью вибрации и (ii) равномерное распределение экзогенных клеток на просветной поверхности оголенной трахеи с использованием клеточного коллагена I пре-геля. Кроме того, метод визуализации на основе линз GRIN подтвердил удаление эпителия in situ. Кроме того, с помощью дальнейших анализов, включая H & E, трихром, пентахром, иммунофлуоресцентное окрашивание и SEM, мы подтвердили удаление эпителия и поддержание архитектуры и компонентов нижележащих слоев тканей. Кроме того, визуализация на основе линз GRIN недавно имплантированных экзогенных МСК показала равномерное распределение клеток, когда коллаген I пре-гель использовался в качестве средства доставки. Наконец, имплантированные клетки выжили и размножились на деэпителиализованной трахее, подчеркивая эффективность биореактора в долгосрочной культуре тканей дыхательных путей, засеянных клетками.

Критическим этапом в протоколе деэпителизации является создание тонкого слоя раствора моющего средства в просвете трахеи. В современных протоколах децеллюляризации используются множественные циклы химических веществ и ферментов в течение длительного периода, уменьшая количество коллагеновых волокон, гликозаминогликанов (GAG), протеогликанов и хондроцитов, ставя под угрозу биологические и биомеханические свойства каркаса дыхательных путей 19,20,21. С другой стороны, ECM обеспечивает биохимические и механические сигналы и подходящие физические среды для выживания, пролиферации и дифференцировки имплантированных экзогенных клеток22,23. Тонкопленочный метод осаждения, описанный в этом исследовании, использует небольшое количество моющего средства (менее 50 мкл) для абляции эпителия, обеспечивая при этом сохранение подлежащего слоя ткани и субэпителиальных клеточных компонентов. Механическая вибрация ткани, подвергающейся воздействию моющего средства, продемонстрированная в этом исследовании, является важной процедурой, поскольку она позволяет отслоить и очистить лизированные клетки. Клеточный мусор и частично разрушенные клетки, возникающие в результате воздействия моющего средства на эпителий, трудно вымыть только путем затопления трахеи моющим раствором. Поэтому механическая вибрация трахеи во время промывки обеспечивает достаточные сдвиговые силы для очистки клеточного мусора от просвета трахеи.

В целом, на подход к посеву клеток на основе прегеля могут влиять скорость доставки, вязкость предварительного геля (которая напрямую связана с концентрацией предварительного геля), поверхностное натяжение и время гелеобразования. В частности, во время предварительного приготовления геля важно поддерживать концентрацию предварительного геля достаточно низкой для транспортировки клеточно-взвешенного прегеля в трубке и достаточно высокой, чтобы поддерживать клетки на верхней поверхности трахеи. Поэтому настоятельно рекомендуется найти оптимальную концентрацию для каждого прегеля путем тестирования различных концентраций. Кроме того, практикуйте технику доставки, такую как скорость доставки с меньшим количеством драгоценных клеток, чтобы обеспечить успешную доставку предварительного геля с клеточной нагрузкой. Более того, в то время как мы использовали МСК в качестве клеточной модели для демонстрации (i) распределения клеток с прегелем в качестве средства доставки и (ii) способности системы биореактора культивировать вновь посеянные клетки на оголенном просвете трахеи, использование стволовых клеток (например, базальных клеток) и первичных эпителиальных клеток дыхательных путей в будущих исследованиях может позволить изучить дифференцировку клеток и функциональную регенерацию эпителиальных клеток24, 25. Кроме того, будущие исследования могут включать добавление воздушно-жидкостного интерфейса (ALI) к текущей платформе для создания in vivo-подобного сдвигового напряжения на семенных клетках для генерации функционального эпителия. Чтобы добавить ALI к текущему устройству, вентилятор для небольших животных может быть подключен к входному отверстию трахеи для вентиляции трахеи. Кроме того, для достижения ALI метод тонкопленочного осаждения может быть использован для закапывания жидкостной пробки культуральной среды в трахею с клеточным семенем. Толщину жидкой пленки можно модулировать, изменяя скорость жидкостной пробки26,27. Пробка может быть инициирована после того, как вновь засеянные клетки прилипнут и прочно приживутся к просвету трахеи.

Кроме того, подход к визуализации на основе линзы in situ GRIN, используемый в этом протоколе, имеет решающее значение для подтверждения эффективности деэпителизации и оценки качества распределения вновь засеянных клеток. В отличие от обычных методов анализа тканей, таких как гистология и иммунофлуоресценция, которые требуют вскрытия образцов из ткани трахеи для анализа, платформа визуализации, разработанная в нашем исследовании, позволяет быстро и неразрушающе контролировать просвет дыхательных путей во время деэпителизации и доставки клеток. Чтобы сохранить трахею стерилизованной во время визуализации in situ , обязательно стерилизуйте линзу GRIN, протирая ее 70% IPA или этанолом перед введением в просвет трахеи. Кроме того, для изображения клеток с помощью линзы GRIN клетки (либо эндогенные эпителиальные клетки трахеи, либо вновь имплантированные клетки) могут быть помечены различными флуоресцентными красителями с различными длинами волн возбуждения / излучения. Для этого обязательно используйте соответствующий лазерный генератор света для возбуждения флуоресцентно меченых ячеек и интегрируйте правильные фильтрующие линзы в двухгранное дихроичное зеркало сверхвысокого разрешения.

Несмотря на новизну и инновационность методов деэпителизации, доставки клеток и визуализации in situ , это исследование имеет несколько ограничений. Методы деэпителизации и доставки клеток, описанные в этом исследовании, применимы к небольшим дыхательным путям (диаметр: менее 3-4 мм), где доминирует поверхностное натяжение. Формирование жидкой пробки и создание тонкой пленки деэпителизационного раствора или клеточной предварительно-гелевой суспензии в более крупных дыхательных путях, таких как трахея свиней и человека, или бронхов, может быть сложной задачей, поскольку поверхностное натяжение становится незначительным по сравнению с другими силами, в частности гравитацией. Более того, используя тонкопленочный подход осаждения и модулируя время и концентрацию, мы смогли удалить эпителий сильным моющим средством (SDS) и сохранить подлежащий слой ткани. В будущих исследованиях, однако, более мягкие децеллюляризационные моющие средства, такие как 3-[(3-холамидопропил)-диметиламмонио]-1-пропансульфонат (CHAPS)28, или недетирующий раствор, такой как гидроксид натрия (NaOH)29, могут быть протестированы на сохранение компонентов ECM и поддержку вновь имплантированных клеток. Кроме того, интенсивность флуоресценции клеток, меченных CFSE, со временем снижается из-за деления клеток. В нашем исследовании флуоресцентные изображения МСК, культивируемых на деэпителизированных трахеях в течение 4 дней, показали существенное снижение интенсивности их флуоресценции. Для длительного мониторинга и отслеживания экзогенных клеток, посеянных на тканевые каркасы, потребуются различные методы маркировки клеток, которые могут обеспечить долгосрочную или постоянную флуоресцентную маркировку клеток.

Мы предполагаем, что платформа биореактора с визуальным контролем и протоколы удаления и доставки клеток, описанные в этом отчете, могут позволить создать деэпителиализованные каркасы тканей дыхательных путей, которые могут быть использованы для создания биоинженерных тканей дыхательных путей. Такие дыхательные пути in vitro могут предложить высокоточное моделирование заболеваний дыхательных путей человека in vitro и скрининг лекарств. Например, для создания функционального эпителия дыхательных путей базальные стволовые клетки дыхательных путей могут быть сначала имплантированы в деэпителиализованную ткань дыхательных путей30. Затем воздушно-жидкостный интерфейс (ALI), который имеет решающее значение для дифференцировки базальных стволовых клеток в различные эпителиальные клетки, может быть сгенерирован внутри трахеи. Кроме того, система визуализации in situ может быть модифицирована и использована для флуоресцентной визуализации дыхательных путей пациентов с нарушениями дыхательных путей легких. Для клинического использования для оценки тканей дыхательных путей in situ жесткая линза GRIN может быть заменена гибкими волоконно-оптическими зондами для навигации по дыхательным путям. Кроме того, способность гомогенно распределять клетки внутри дыхательных путей с использованием клеточного посева на основе гидрогеля может обеспечить беспрецедентную возможность заменить поврежденный или поврежденный эпителий у пациентов. В частности, подход к замене клеток, разработанный и использованный в этом исследовании, может ускорить клеточное лечение для лечения респираторных заболеваний, таких как муковисцидоз и первичная цилиарная дискинезия, а также восстановления донорских легких, которым отказано в трансплантации из-за серьезно поврежденных тканей дыхательных путей 31,32,33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Это исследование было частично поддержано Исследовательской программой Фонда Американского торакального общества, Фондом здравоохранения Нью-Джерси и Национальным научным фондом (CAREER Award 2143620). и Национальные институты здравоохранения (P41 EB027062) - G.V.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1× PBS Gibco, Thermo Fisher Scientific 10-010-031
3-port connector World Precision Instruments 14048-20
4-port connector World Precision Instruments 14047-10
Accelerometer STMicroelectronics IIS3DWBTR
Achromatic doublet Thorlabs AC254-150-A-ML
Aluminum pin stub TED PELLA 16111
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240062
Assembly rod Thorlabs ER1
Button head screws McMaster-Carr 91255A274
Cage cube Thorlabs C4W
Carbon double-sided conductive tape TED PELLA 16073
CFSE labelling kit Abcam ab113853
Citrisolv (clearing agent) Decon 1061
C-mount adapter Thorlabs SM1A9
Collagen I Advanced BioMatrix 5153
Conductive liquid silver paint TED PELLA 16034
Dichroic mirror Semrock DI03-R488 Reflected laser wavelengths:  473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco, Thermo Fisher Scientific 11965118
Female luer bulkhead to hose barb adapter Cole-Parmer EW-45501-30
Female luer to tubing barb Cole-Parmer EW-45508-03
Female to male luer connector Cole-Parmer ZY-45508-80
Fetal bovine serum Gibco, Thermo Fisher Scientific 10082147
Filter lens Chroma Technology Corp ET535/50m
Fluorescent microscope Nikon Eclipse E1000 - D
Fusion 360 Autodesk
Hex nut McMaster-Carr 91813A160
Hexamethyldisilazane (HMDS) Fisher Scientifc AC120585000
Imaging fiber SELFOC, NSG group GRIN lens
Laser Opto Engine MDL-D-488-150mW
Lens tubes Thorlabs SM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) Thermo Fisher Scientific L3224
MACH 3 CNC Control Software Newfangled Solutions
Objective lens Olympus UCPLFLN20X
Peristaltic Pump Cole Parmer L/S standard digital pump system
Recombinant human FGF-basic PeproTech 100-18B
Retaining ring Thorlabs SM1RR
Scientific CMOS camera PCO Panda PCO Panda 4.2
Sodium dodecyl sulfate VWR 97064-472
Solidworks (2019) Dassault Systèmes
Stackable lens tube Thorlabs SM1L10
Subwoofer plate amplifier Dayton Audio SPA250DSP
Subwoofer speaker Dayton Audio RSS21OHO-4 Diaphragm diameter: 21 cm
Syringe Pump World Precision Instruments AL-4000
Threaded cage plate Thorlabs CP33
Threaded luer adapter Cole-Parmer EW-45513-81
Tube lens Thorlabs AC254-150-A-ML
Tygon Tubing Cole-Parmer 13-200-110
XY Translator Thorlabs CXY1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500 (2019).
  3. Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
  4. Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997 (2013).
  5. De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746 (2018).
  6. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  7. Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
  8. Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
  9. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  10. Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
  11. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  12. Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021 (2018).
  13. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
  14. Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
  15. Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
  16. Planchard, D. Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , SDC Publications. (2022).
  17. Coward, C. A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , No Starch Press. (2019).
  18. Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
  19. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  20. Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
  21. Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
  22. Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
  23. Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
  24. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
  25. Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
  26. Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
  27. Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101 (2015).
  28. O'Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
  29. Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
  30. Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135 (2013).
  31. O'Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037 (2017).
  32. Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (2019).
  33. Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
  34. Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521 (2017).

Tags

Биоинженерия выпуск 182
Биореактор с визуальным контролем для создания биоинженерной ткани дыхательных путей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mir, S. M., Chen, J., Pinezich, M.… More

Mir, S. M., Chen, J., Pinezich, M. R., O’Neill, J. D., Guenthart, B. A., Vunjak-Novakovic, G., Kim, J. Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue. J. Vis. Exp. (182), e63544, doi:10.3791/63544 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter