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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Biorreactor guiado por imágenes para generar tejido biodiseñado de las vías respiratorias

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63544
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 4, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Stevens Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 3Department of Cell Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 4Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University

Summary

El protocolo describe un biorreactor habilitado para imágenes que permite la eliminación selectiva del epitelio endógeno de la tráquea de la rata y la distribución homogénea de las células exógenas en la superficie de la luz, seguido de un cultivo in vitro a largo plazo de la construcción célula-tejido.

Abstract

La lesión repetida del tejido de las vías respiratorias puede afectar la función pulmonar y causar enfermedad pulmonar crónica, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Los avances en medicina regenerativa y tecnologías de biorreactores ofrecen oportunidades para producir tejidos funcionales cultivados en laboratorio y construcciones de órganos que se pueden usar para detectar medicamentos, modelar enfermedades y diseñar reemplazos de tejidos. Aquí, se describe un biorreactor miniaturizado junto con una modalidad de imagen que permite la visualización in situ de la luz interna de la tráquea de rata explantada durante la manipulación y el cultivo de tejidos in vitro . Utilizando este biorreactor, el protocolo demuestra la eliminación selectiva guiada por imágenes de componentes celulares endógenos al tiempo que preserva las características bioquímicas intrínsecas y la ultraestructura de la matriz de tejido de las vías respiratorias. Además, se muestra la entrega, distribución uniforme y posterior cultivo prolongado de células exógenas en la luz de la vía aérea descelularizada con monitorización óptica in situ . Los resultados destacan que el biorreactor guiado por imágenes se puede utilizar potencialmente para facilitar la generación de tejidos funcionales in vitro de las vías respiratorias.

Introduction

La superficie luminal del tracto respiratorio está revestida por una capa de epitelio que consiste principalmente en células madre multiciliadas, garrote, copa ybasales 1,2. La capa epitelial sirve como un mecanismo de defensa primario del pulmón, actuando como una barrera biofísica que protege el tejido subyacente de las vías respiratorias contra patógenos inhalados, partículas o gases químicos. Protege el tejido de las vías respiratorias a través de múltiples mecanismos, incluida la formación de uniones estrechas intercelulares, el aclaramiento mucociliar y la secreción antimicrobiana y antioxidante 3,4. El epitelio defectuoso de las vías respiratorias se asocia con enfermedades respiratorias devastadoras, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)5, la discinesia ciliar primaria (PCD)6 y la fibrosis quística (FQ)7.

Los avances en la tecnología lung-on-chip (LOC) representan una oportunidad para estudiar el desarrollo pulmonar humano, modelar diversas enfermedades pulmonares y desarrollar nuevos materiales terapéuticos en entornos in vitro estrechamente regulados. Por ejemplo, el epitelio y el endotelio de las vías respiratorias se pueden cultivar en lados opuestos de una membrana delgada y porosa para imitar el tejido pulmonar que intercambia gases, lo que permite un modelado fiel de la enfermedad y pruebas de drogas8. Del mismo modo, se han creado modelos de enfermedades in vitro para modelar enfermedades de las vías respiratorias in vitro, como la EPOC9 y la fibrosis quística10. Sin embargo, un desafío importante de los dispositivos LOC es recapitular la compleja arquitectura tridimensional (3D) del tejido pulmonar y las interacciones dinámicas de la matriz célula-tejido in vitro11.

Recientemente, se han desarrollado metodologías innovadoras de ingeniería de tejidos que permiten la manipulación de tejidos pulmonares ex vivo 12. Utilizando estas metodologías, se pueden preparar injertos de tejido alogénico o xenogénico desnudo mediante la eliminación de las células endógenas del tejido pulmonar a través de tratamientos químicos, físicos y mecánicos13. Además, la matriz extracelular (ECM) de tejido nativo preservado en los andamios pulmonares descelularizados proporciona las señales estructurales, bioquímicas y biomecánicas fisio-miméticas para que las células implantadas se adhieran, proliferen y diferencien14,15.

Aquí, se informa de un sistema de biorreactor guiado por imágenes creado mediante la combinación de LOC y tecnologías de ingeniería de tejidos para permitir la manipulación y el cultivo de tejidos traqueales de ratas explantados. Utilizando este biorreactor de tejido de las vías respiratorias, el protocolo demuestra la eliminación selectiva de las células epiteliales endógenas sin interrumpir los componentes celulares y bioquímicos subepiteliales subyacentes del tejido de las vías respiratorias. A continuación, mostramos la distribución homogénea y la deposición instantánea de las células exógenas recién sembradas, como las células madre mesenquimales (MSC), en la luz de las vías respiratorias desnudas mediante la inculcación de la solución pre-gel de colágeno I cargada de células. Además, mediante el uso del dispositivo de imagen microóptica integrado en el biorreactor, también se realiza la visualización de la luz de la tráquea durante la eliminación del epitelio y la administración endógena de células. Además, se demuestra que la tráquea y las células recién implantadas se pueden cultivar en el biorreactor sin muerte celular notable y degradación tisular durante 4 días. Prevemos que la plataforma de biorreactores habilitada para imágenes, la técnica de deseptelización basada en película delgada y el método de administración celular utilizado en este estudio pueden ser útiles para generar tejidos de las vías respiratorias para el modelado de enfermedades in vitro y la detección de fármacos.

El biorreactor incluye una cámara rectangular conectada a una bomba de jeringa programable, una bomba de perfusión y un ventilador para el cultivo de tráquea de rata aislada. El biorreactor cuenta con entradas y salidas conectadas a la tráquea o a la cámara de cultivo de tejidos para suministrar por separado reactivos (por ejemplo, medios de cultivo) a los espacios internos y externos de la tráquea (Figura 1). Se puede utilizar un sistema de imágenes personalizado para visualizar el interior de la tráquea de rata cultivada in vitro a nivel celular (Figura 2). El epitelio endógeno de la tráquea se elimina mediante la instilación de una solución de descelularización a base de detergente seguida de un lavado de las vías respiratorias asistido por vibración (Figura 3). La solución de hidrogel, como el colágeno tipo I, se utiliza como vehículo de entrega para sembrar células exógenas de manera uniforme e instantánea a través de la luz de la tráquea desnuda (Figura 4). Todos los materiales utilizados para construir el biorreactor y realizar los experimentos se proporcionan en la Tabla de Materiales.

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Protocol

El protocolo de tejido animal a continuación ha sido aprobado por la guía de bienestar animal y las regulaciones del Comité del Instituto para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Instituto de Tecnología Stevens, y cumple con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para el uso de animales de experimentación.

1. Diseño y construcción de biorreactor de tráquea de rata guiado por imágenes

  1. Diseño y fabricación de biorreactor de tráquea de rata
    1. Cree un modelo de diseño asistido por computadora (CAD) de la cámara del biorreactor con un diseño relevante, como entradas, salidas y cámara de cultivo de tejidos, utilizando el software del generador CAD. Para este estudio, utilice la geometría y las dimensiones presentadas en la Figura 1A-C. El tutorial del software del generador CAD se puede encontrar en16,17.
    2. Exporte el modelo CAD generado a un software de controlador de control numérico por computadora (CNC) y corte el plástico de politetrafluoroetileno (PTFE) utilizando una máquina CNC para crear la cámara del biorreactor. El tutorial del software del controlador CNC se puede encontrar en18.
      NOTA: Además del PTFE, se pueden utilizar otros materiales plásticos, como el polietileno de ultra alto peso molecular (UHMWPE) y la polieterimida para fabricar la cámara de cultivo.
    3. Esterilizar todos los componentes del biorreactor, como los adaptadores y tornillos Luer, para evitar la contaminación de los tejidos y células cultivadas en el dispositivo. Ensamble todos los componentes del biorreactor en la cámara de cultivo de tejidos principal en un ambiente limpio (Figura 1A).
  2. Construcción de un dispositivo de imágenes basado en lentes de índice de gradiente (GRIN)
    1. Para crear el dispositivo de imágenes in situ , inserte una lente de tubo en un tubo de lente apilable y asegúrela con un anillo de retención. Monte el conjunto del tubo de lente en una cámara CMOS científica a través de un adaptador de montura C.
    2. Utilice software, como Micro-Manager, para operar la cámara y adquirir fotos y videos. Apunte un objeto ubicado a una larga distancia (por ejemplo, a 10 m de la cámara) y ajuste la distancia entre la lente del tubo y el sensor de imagen de la cámara hasta que el software de imágenes que se está utilizando forme una imagen enfocada del objeto en la pantalla de la computadora.
    3. Monte una lente de filtro en un espejo dicroico de superresolución de doble borde y un láser en el dispositivo utilizando componentes del sistema de jaula óptica, incluida la varilla de ensamblaje, la placa de jaula roscada y el cubo de jaula.
    4. Conecte la lente del objetivo (20x) al dispositivo. Monte una lente GRIN (diámetro = 500 μm) en el extremo distal del tubo de la lente a través del traductor XY. Ajuste la distancia entre la lente GRIN y la lente del objetivo para formar imágenes microscópicas enfocadas (Figura 2A, B).

2. Aislamiento de la tráquea de la rata

  1. Desinfecte el área quirúrgica y esterilice los instrumentos quirúrgicos con un autoclave a 121 ° C durante 30 minutos antes de la cirugía.
  2. Coloque una rata en la cámara de inducción y entregue un 2,5% de isoflurano durante 15 minutos utilizando un pequeño vaporizador para anestesiar al animal. Evaluar la profundidad de la anestesia por reflejo de pedal. Para hacer esto, pellizque firmemente el dedo del pie y confirme que el animal no responde al pellizco del dedo del pie.
  3. Después de la anestesia, retire el isoflurano de la cámara y administre 1 ml de 1.000 unidades/ml de heparina a través de la vena lateral de la cola para evitar la coagulación de la sangre en la vasculatura pulmonar.
  4. Para sacrificar al animal, exponga al animal al 5% de isoflurano durante 15-20 minutos adicionales. Retire al animal de la cámara de inducción y colóquelo en la tabla quirúrgica en posición supina boca arriba.
  5. Fije la rata en la tabla quirúrgica inmovilizando las patas y la cola con cinta adhesiva. A continuación, esterilice las regiones del cuello y el pecho de la rata con alcohol isopropílico al 70% (IPA). Abra la cavidad abdominal haciendo una incisión de 3-4 cm usando tijeras en la piel.
    NOTA: Tenga cuidado de no cortar la piel profundamente apuntando las puntas de las tijeras hacia arriba.
  6. Transecta la vena cava inferior (IVC) usando las tijeras y confirma la eutanasia por exsanguinación.
  7. Realice la traqueotomía haciendo una incisión usando tijeras en la línea media del cuello y exponiendo la tráquea. Realice la toracotomía de la línea media haciendo una incisión en la pared torácica y cortando entre las costillas para llegar al extremo de la tráquea conectado al pulmón. A continuación, use un bíceps y tijeras para cortar ambos extremos de la tráquea y aislar la tráquea.
  8. Después del aislamiento, enjuague la tráquea con 20 ml de solución salina tamponada con fosfato (1 pbS). Transfiera la tráquea al biorreactor utilizando bíceps esterilizados. Asegure los dos extremos de la tráquea al conector Luer con una rosca de sutura 4-0.
  9. Entregue 5 ml de medio de cultivo a la cámara del biorreactor utilizando la bomba de jeringa programable a través del tubo conectado a la cámara del biorreactor a un caudal de 5 ml/min.
    NOTA: El medio de cultivo está compuesto por el medio de eagle modificado de Dulbecco (DMEM), FGF-básico humano recombinante (0.1 ng / ml), suero fetal bovino (FBS, 10%) y antibiótico-antimicótico (1%).
  10. Cierre herméticamente la tapa del biorreactor con la tapa de plástico acrílico y los tornillos. Cierre las conexiones de los tubos de la cámara del biorreactor con los tapones Luer macho/hembra para evitar el flujo del medio de cultivo en el tubo.

3. Extracción guiada por imágenes del epitelio de la tráquea

  1. Para visualizar la luz de la tráquea, ya sea en campo brillante o fluorescente, coloque el biorreactor en la etapa de imagen (Figura 3A).
  2. Prepare la solución de éster de succinimidil de carboxifluoresceína (CFSE) (concentración: 100 μM) en el kit de etiquetado celular de CFSE diluyendo la solución de CFSE con 1x PBS.
    NOTA: La concentración de la solución original de CFSE es de 10 mM (en dimetilsulfóxido (DMSO)).
  3. Infundir 500 μL de la solución cfSE a través de la tráquea a través de la bomba de jeringa a través del tubo conectado a la cánula de la tráquea a un caudal de 5 ml/min. Detenga la bomba cuando la solución CFSE llene la tráquea. Espere 10 minutos y luego lave la luz de la tráquea mediante infusión de 10 ml de 1x PBS con la bomba de jeringa para eliminar el reactivo CFSE residual no incorporado.
  4. Inserte el extremo de imagen distal de la lente GRIN en la tráquea a través del conector Luer conectado a un extremo de la tráquea. Luego, mueva suavemente la lente GRIN dentro de la tráquea hasta que la superficie de la tráquea esté enfocada y tome fotos y videos en campo brillante o fluorescencia a un aumento de 20x.
  5. Para capturar imágenes de campo brillante en el software Micro-Manager, siga los pasos a continuación.
    1. Introduce luz blanca a través del cubo de la jaula para iluminar la luz de la tráquea. Haga clic en el icono Live para mostrar la superficie luminal de la tráquea en tiempo real. Utilice configuración de imágenes > exposición (ms) para cambiar el tiempo de exposición al valor deseado. En este estudio, el tiempo de exposición utilizado estuvo en el rango de 10 ms y 50 ms.
    2. Para ajustar el contraste y el brillo de las imágenes, utilice la ventana Histograma y Escala de intensidad para mover flechas en blanco y negro en el extremo de la pantalla del histograma interactivo. Alternativamente, use la opción Auto Stretch que permite que el software ajuste el brillo y el contraste automáticamente a niveles óptimos.
    3. Haga clic en el icono Snap para congelar la imagen. A continuación, utilice Configuración > Exportar imágenes como desplazadas para guardar las imágenes en el formato deseado. Alternativamente, use Configuración > ImageJ para exportar directamente la imagen al software ImageJ y guardarla.
  6. Para obtener fotos y videos en modo fluorescente, ilumine la luz de la tráquea con luz láser específica de CFSE (CFSE: longitud de onda de excitación: 488 nm, longitud de onda de emisión: 515 nm) a través del cubo de la jaula. Siga los pasos 3.5.2-3.5.3 para adquirir las imágenes. Después de tomar fotos y videos, retire suavemente la lente GRIN de la tráquea.
  7. Realice la desepitelización como se describe a continuación.
    1. Prepare una solución de descelularización de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 2% en agua destilada (DI). Instilar 50 μL de SDS a través de la tráquea a un caudal de 6,3 ml/min, utilizando la bomba de jeringa a través de la cánula de la tráquea para generar una película delgada de la solución detergente en la luz de la tráquea.
    2. Cierre las conexiones de los tubos del biorreactor con tapones Luer macho/hembra y transfiera el biorreactor a una incubadora. Deje que la SDS habite dentro de la tráquea durante 10 minutos a 37 °C. Inscriba otros 50 μL de solución de SDS a través de la tráquea e incube durante 10 min.
    3. Elimine el epitelio lisado y la SDS regando la luz de la tráquea con 500 μL de 1x PBS mediante una bomba de jeringa a un caudal de 10 ml / min durante 3x. Coloque el biorreactor en un agitador y haga vibrar mecánicamente el biorreactor a una frecuencia de 20 Hz y una amplitud de desplazamiento de aproximadamente 0,3 mm para promover físicamente el desprendimiento de las células epiteliales tratadas con SDS de la luz de la tráquea.
      NOTA: En este estudio, el agitador se construyó a medida mediante el ensamblaje de un altavoz de subwoofer, un amplificador de placa de subwoofer y un acelerómetro. Una forma de onda sinusoidal fue generada por una computadora y alimentada al agitador a través del amplificador, mientras que la respuesta del agitador fue monitoreada a través del acelerómetro (Figura 3B). Además, los agitadores convencionales, como los agitadores electromagnéticos y de inercia, se pueden usar para promover el desprendimiento de las células. Para hacer esto, ajuste la frecuencia y la aceleración del agitador a 20 Hz y 0.5 g, respectivamente (equivalente a una amplitud de desplazamiento de 0.3 mm).
    4. Instilar 500 μL de 1x PBS dos veces a través de la luz de la tráquea para eliminar el SDS residual y los desechos celulares mientras la tráquea vibra mecánicamente. Después del procedimiento de eliminación del epitelio, evalúe el aclaramiento de la capa epitelial midiendo la intensidad de CFSE utilizando el dispositivo de imágenes de lente GRIN como en el paso 3.6 (Figura 3C).

4. Preparación del tejido de la tráquea para análisis adicionales

  1. Para confirmar la eliminación del epitelio, realice más análisis de tejidos, como tinción de hematoxilina y eosina (H&E), tricromo, pentacromo e inmunotinción. Para hacer esto, retire la tráquea del biorreactor y fíjela en 30 ml de solución de paraformaldehído tamponado neutro al 4% en 1x PBS (pH = 7.4) a 4 ° C durante la noche.
  2. Deshidrate e incruste el tejido fijo de la tráquea siguiendo los pasos a continuación.
    1. Después de la fijación, lave el tejido de la tráquea con 10 ml de 1x PBS, transfiera la tráquea a 30 ml de alcohol al 70% y manténgala a 4 ° C durante la noche. Corte la tráquea en pequeñas secciones cilíndricas (~ 5 mm) con una cuchilla afilada e inserte las secciones de tejido en los casetes de incrustación de tejido (largo x ancho x alto: 4 cm x 2,5 cm x 0,5 cm). Mantenga dos secciones de tráquea en cada casete.
    2. Deshidratar las secciones en una serie de soluciones de alcohol isopropílico (IPA) - 85%, 90%, 95%, 100% - durante 1 h en 30 ml de cada solución. Quite la solución anterior antes de agregar la siguiente solución.
    3. Al finalizar, sumerja los casetes en 30 ml de agente de limpieza (por ejemplo, xileno) durante 2 h para desplazar completamente la solución de IPA de las secciones de tejido. Realice este paso en una campana extractora de humos con ventilación adecuada.
    4. Sumerja los casetes en parafina durante 2 h y luego intégrelos en parafina a 4 °C durante la noche. A continuación, corte los tejidos incrustados en parafina en secciones delgadas (5-8 μm) utilizando un dispositivo de microtomo para el H&E, tricromo, pentacromo e inmunotinción.
  3. Para preparar los tejidos para el análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM), fije la tráquea en 30 ml de solución de glutaraldehído al 2,5% en 1x PBS (pH = 7,4) a 4 °C durante la noche. Luego, deshidrate el tejido fijo de la tráquea para SEM siguiendo los pasos a continuación.
    1. Después de la fijación, enjuague el tejido de la tráquea con 10 ml de 1x PBS. Corte el tejido de la tráquea longitudinalmente en pequeñas secciones semicilíndricas (longitud: ~ 5 mm) con tijeras e inserte las secciones de tejido en los casetes.
    2. Deshidrate las secciones en una serie de soluciones IPA - 35%, 50%, 70%, 85%, 95% y 100% - durante 10 min en 30 mL de cada solución. Quite la solución anterior antes de agregar la siguiente solución.
    3. Realice el método de secado basado en hexametildisilazano (HMDS) sumergiendo los tejidos en las siguientes soluciones: 100% IPA: HMDS (2: 1; v / v) durante 10 min, seguido de 100% IPA: HMDS (1: 2; v / v) durante 10 min, y finalmente 100% HMDS durante la noche.
      NOTA: HMDS es tóxico. Trabaje bajo una campana de humos durante todos los pasos de secado.
    4. Retire los tejidos de la solución HMDS y déjelos secar debajo de la campana de humos durante 1 h. Monte la sección en talones de pasador de aluminio utilizando una cinta conductora de doble cara de carbono o pasta conductora de plata para imágenes SEM.

5. Distribución homogénea de células exógenas sobre la luz traqueal desnuda

  1. Prepare una tráquea de rata desepitelizada utilizando el protocolo en el paso 3. Descongele las células madre mesenquimales (MSC) congeladas durante 30 s en un baño de agua a 37 °C.
    NOTA: En este estudio, utilizamos células madre mesenquimales (MSC) como célula modelo para mostrar la distribución de células exógenas en la tráquea desepitelizada. Idealmente, las células epiteliales primarias de las vías respiratorias, las células basales o las células pluripotentes humanas inducidas (iPSC) se pueden usar para fines de regeneración del epitelio.
  2. Cuente las células con un hemocitómetro y prepare una solución celular con una concentración de 5 x 106 células / ml. Etiquete las células fluorescentemente incubando las células con 2 ml de solución de CFSE (concentración: 100 μM) a temperatura ambiente durante 15 min. Enjuague las células con 5 ml de 1x PBS durante 3x y resuspenda las células en medio de cultivo fresco a una concentración final de 3 x 107 células / ml.
  3. Prepare la solución de pre-gel de hidrogel como vehículo para la entrega de células. Para este estudio, use colágeno I como vehículo de administración para las células de las MSC y siga las instrucciones del fabricante para preparar el pre-gel. Por ejemplo, para obtener 3,6 mg/ml de colágeno pre-gel, mezcle una parte de la solución de neutralización refrigerada con nueve partes del colágeno de la cola de rata en un tubo estéril de 1,5 ml. Luego, pipetee suavemente la mezcla hacia arriba y hacia abajo para una mezcla adecuada.
    NOTA: Se pueden utilizar otros hidrogeles biocompatibles en lugar de colágeno I según el estudio y las necesidades del usuario.
  4. Una vez que la solución de hidrogel esté preparada, agregue las células rápidamente a la solución con la concentración deseada (por ejemplo, 5 x 106 células / ml). Para obtener una mezcla uniforme de célula e hidrogel, mezcle las células y la solución de gel pipeteando suavemente con una micropipeta.
  5. Conecte un extremo de la tráquea dentro del biorreactor a una bomba de jeringa programable a través de un conector Luer. Entregue 5 ml de medio de cultivo fresco a 37 °C en la cámara del biorreactor para cubrir la superficie exterior de la tráquea utilizando la bomba de jeringa a un caudal de 5 ml/min.
  6. Administrar un bolo de 10 μL de la mezcla célula-hidrogel en la tráquea desepitelizada dentro del biorreactor utilizando la bomba de jeringa a un caudal de 5 ml/min para generar una capa de célula-hidrogel en la luz de la tráquea (Figura 4).
  7. Después de la inyección celular, coloque el biorreactor en una incubadora de cultivo celular estéril a 37 °C y 5% de CO2 para la gelificación. Para el colágeno I, la gelificación se produce en 30 min.
  8. Para visualizar la distribución de las células implantadas, esterilice la lente GRIN limpiando con 70% de IPA o etanol y coloque el biorreactor en la etapa de imagen. Tome fotos y videos en los modos de campo brillante y fluorescente según sea necesario.
  9. Después de 30 min de siembra celular, infundir 1 ml de medio de cultivo en la luz de la tráquea utilizando una bomba de jeringa a un caudal de 1 ml/min.
  10. Cultive la tráquea con semilla celular dentro del biorreactor en una incubadora a 37 °C durante el tiempo deseado. Para el cultivo a largo plazo, refresque el medio de cultivo en la luz de la tráquea y la cámara del biorreactor cada 24 h. Durante el cultivo celular, mantenga los medios dentro del lumen estáticos y cámbielos cada 24 h, mientras que el medio fuera de la tráquea se perfunde continuamente a través de un flujo unidireccional a 5 ml / min.
  11. Después de cultivar las células durante un cierto período de tiempo (por ejemplo, 1 y 4 días en este estudio), retire la tráquea del biorreactor. Use tijeras para cortar la tráquea longitudinalmente en dos secciones semicilíndricas (es decir, secciones superior e inferior) en los días 1 y 4 de cultivo in vitro para exponer las superficies internas para monitorear el crecimiento celular y calcular la densidad celular. Use un microscopio fluorescente convencional para visualizar las células en las superficies internas.
  12. Para adquirir las imágenes con el software Micro-Manager, siga los pasos 3.5 y 3.6. Use un filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) para visualizar las células marcadas con CFSE en modo de fluorescencia. Analice las imágenes tomadas por el microscopio fluorescente y calcule las densidades celulares en las secciones superior e inferior utilizando el software ImageJ. Para calcular el número de celdas y la densidad celular, siga los pasos a continuación.
    1. Abra una imagen en el software ImageJ y convierta la imagen en una imagen binaria (16 bits) utilizando Image > Type > 16 bits. Establezca la escala de la imagen con la barra de escala mediante Analizar > Establecer escala.
    2. Ajuste el umbral de la imagen para resaltar las estructuras de las celdas que se van a contar. Utilice image > Ajustar > umbral. Utilice Analizar > Analizar partículas para contar el número de celdas. Calcule la densidad de las celdas dividiendo el número de celdas por el área de superficie de la imagen.
  13. Para evaluar la viabilidad después de la siembra celular, use un kit de viabilidad celular. Para este estudio, incubar el tejido de la tráquea y las células en el biorreactor a 37 °C durante 6 h y teñir las células con 4 mM de calceína-AM y 2 mM de etidio homodímero-1 en 1 mL de 1x PBS a temperatura ambiente durante 15 min.
  14. Después de enjuagar con 1x PBS, visualice las células con un microscopio fluorescente. Cuente las células vivas y muertas siguiendo los pasos descritos en el paso 5.12. Calcular la viabilidad celular como el porcentaje de células vivas (teñidas con calceína-AM) por células totales (tanto células vivas como muertas).

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Representative Results

La modalidad de imagen in situ basada en lente GRIN puede permitir la visualización de la luz interna traqueal in situ (Figura 5A). Utilizando este método de imagen, se pueden obtener imágenes de campo brillante y fluorescentes de las tráqueas nativas y desepitelizadas (Figura 5B, C). No se observó ninguna señal fluorescente de la tráquea nativa antes del etiquetado CFSE (Figura 5Bii). Sin embargo, cuando el epitelio traqueal fue marcado con colorante CFSE, se observó una señal fluorescente uniforme (verde) en todo el epitelio (Figura 5Ci). Después de la desepitelización mediante SDS y la irrigación de las vías respiratorias asistida por vibración, la intensidad de la señal fluorescente disminuyó significativamente (Figura 5Cii), lo que indica la ablación del epitelio.

Las imágenes de H&E de la tráquea desepitelizada mostraron la eliminación del epitelio pseudoestratificado de la luz de la tráquea y la preservación de las células y la microestructura ecM en las capas de tejido subyacentes (Figura 6A). Además, la tinción de pentacromo (Figura 6B) y tricrómico (Figura 6C) confirmó el mantenimiento de la arquitectura del tejido de la tráquea y los componentes de ECM, como el colágeno y los proteoglicanos. Además, la inmunofluorescencia de las células epiteliales (molécula de adhesión de células epiteliales, EpCAM; Figura 6D) y el colágeno I (Figura 6E) reveló la eliminación completa del epitelio y la preservación del colágeno I dentro del tejido subepitelial. Las imágenes SEM de la tráquea nativa mostraron que la superficie luminal de la tráquea de rata nativa estaba poblada principalmente con células multiciliadas y células caliciformes. Por otro lado, las imágenes SEM de la luz de la tráquea desepitelizada mostraron que la membrana basal estaba expuesta como lo indica una red de malla de fibras ECM y la ausencia de células epiteliales (Figura 6F).

Utilizando tráqueas de rata deseptelizadas y células marcadas fluorescentemente, investigamos si la incorporación de un hidrogel como vehículo de entrega celular podría lograr una distribución celular homogénea en la luz traqueal desepitelizada (Figura 7A, B). En este estudio, las células madre mesenquimales (MSC) se utilizaron como células modelo para la entrega celular y el estudio de cultivo. Como se describe en el protocolo (paso 5), inculcamos pre-gel de colágeno I cargado con MSC en una tráquea de rata deseptelizada y monitoreamos la distribución de las células en la luz traqueal utilizando el sistema de imágenes de lente GRIN. Como experimento de control, suspendimos las MSC en el medio de cultivo, infundimos el medio de cultivo cargado de células en la tráquea e inspeccionamos visualmente la distribución de las células. Los resultados de las imágenes in situ mostraron que las células marcadas fluorescentemente administradas a través del hidrogel permanecieron adheridas de manera más uniforme a través de la luz que las sembradas a través del medio de cultivo (Figura 7B). Luego probamos la viabilidad celular antes y después de la administración celular para evaluar el daño celular potencial y la muerte debido al estrés por cizallamiento durante la infusión celular. El resultado mostró que la viabilidad celular no se vio afectada significativamente por el procedimiento de administración celular, ya que más del 90% de las células permanecieron viables (Figura 7C).

Además, cultivamos las tráqueas con semillas celulares durante 4 días. Las células sembradas a través de colágeno y medio de cultivo (control) proliferaron en la superficie de la luz de la tráquea desepitelizada, como lo indica el aumento del número de células que expresan CFSE a lo largo del tiempo tanto en la mitad superior como en la inferior de la luz traqueal (Figura 7D). En particular, en el grupo de administración de hidrogel de colágeno, la diferencia en la densidad de las células entre los lúmenes superior e inferior fue menor que en el grupo de control, lo que indica que la entrega celular a través del hidrogel promueve la distribución celular homogénea en toda la luz de la tráquea.

Figure 1
Figura 1: Dibujo tridimensional (3D) por computadora del biorreactor de tráquea. (A) (i) vista lateral, (ii) vista superior. (B) Las dimensiones de la cámara de biorreactores. (C) Una lámina de plástico acrílico transparente se corta y se fija a la parte superior de la cámara principal con tornillos. Unidad = mm; R = radio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes de microfibras personalizadas para la visualización in situ de la tráquea de rata. (A) (i) Esquema de los componentes de configuración de imágenes de la trayectoria de la luz. Abreviaturas: C = cámara, TL = lente de tubo, F = filtro, DM = espejo dicroico, OL = lente de objetivo; ii) se inserta una fotografía de los componentes de configuración de imágenes que muestra la sonda de imagen (lente GRIN) en el conector Luer del biorreactor. (B) Esquema que muestra que la lente GRIN está integrada con el biorreactor. (C) Se utiliza una fotografía que muestra la sonda de imágenes para visualizar la tráquea dentro del biorreactor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: La plataforma para la desepitelización de la tráquea de rata. (A) Fotografía que muestra la configuración experimental para la desepitelización y la imagen de fibra óptica in situ . (B) Diagrama que muestra el componente y el ensamblaje del agitador electromagnético hecho a medida utilizado para facilitar la eliminación del epitelio. ω: frecuencia, a: amplitud (C) Esquema que muestra el flujo de trabajo del procedimiento de desepitelización de la tráquea de rata. PBS = solución salina tamponada con fosfato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Entrega de células exógenas en tráquea de rata desepitelizada utilizando hidrogel. Esquema que muestra la solución de hidrogel utilizada como vehículo de entrega para depositar tópicamente las células en la luz interna de la tráquea de rata desepitelada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Imágenes in situ de la tráquea desepitelizada. (A) Fotografía que muestra imágenes fluorescentes de la luz de la tráquea mientras el epitelio marcado con CFSE se excita con láser azul de 488 nm a través de la lente GRIN. (B) (i) Imágenes de campo brillante y (ii) de fluorescencia de la luz de la tráquea antes del etiquetado del epitelio. (C) Imágenes de fluorescencia de la (i) tráquea nativa y (ii) desepiteliada (De-Epi trachea) mientras que el epitelio está marcado con colorante fluorescente CFSE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Histología, inmunofluorescencia y análisis SEM de tráqueas de rata nativas y desepitelizadas. (A) Tinción de H&E. (B) Tinción de pentacromo donde el púrpura es el citoplasma celular, el azul es los núcleos celulares, el verde es proteoglicanos (por ejemplo, mucina) y el amarillo es las fibras de colágeno. (C) Tinción tricrómica donde el rosa es el citoplasma celular, el azul oscuro es los núcleos celulares y el azul es el colágeno. Imágenes de fluorescencia de tráqueas nativas y desepitelizadas. (D) EpCAM y (E) colágeno I. Las puntas de flecha muestran la superficie de la luz de la tráquea. (F) Micrografías SEM de la luz de la tráquea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Deposición tópica de las MSC exógenas en la luz de la tráquea. (A) (i) Campo brillante y (ii) imágenes de fluorescencia de la tráquea desepitelizada. (B) Imágenes fluorescentes de la luz de la tráquea deseptelizada cuando se siembra con (i) PBS y (ii) pre-gel de colágeno I. La distribución homogénea de las células en la luz de la tráquea se logra cuando el colágeno pre-gel se utiliza como vehículo de entrega para las células. (C) (i) Imágenes fluorescentes y (ii) viabilidad cuantificada de las células antes y después de 6 h de la administración por colágeno pre-gel. n: número de muestras. Se siguieron los pasos 5.1 y 5.17 del protocolo para evaluar la viabilidad de las células. (D) Densidad de siembra celular medida después de (i) 1 día y (ii) 4 días después de la siembra y cultivo celular. La densidad celular se calculó dividiendo el número de células por el área de superficie examinada. Todos los valores representan la media ± la desviación estándar. Se utilizó el análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) para determinar las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos, considerándose significativas las diferencias significativas de p < 0,05. Abreviaturas: CM = medio de cultivo, C = colágeno. *p < 0,05. **p < 0,01. ns: no significativo. Ninguna diferencia significativa (ns) entre las superficies superior e inferior significa una distribución celular uniforme a través de la circunferencia de la tráquea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este trabajo, creamos un biorreactor guiado por imágenes que puede permitir (i) el monitoreo de la luz de la tráquea in situ después de la eliminación celular y la entrega de células exógenas y (ii) el cultivo in vitro a largo plazo del tejido de la tráquea con semilla celular. Utilizando este biorreactor personalizado, demostramos (i) la eliminación selectiva de las células epiteliales endógenas de la luz de la tráquea utilizando detergente y lavado de las vías respiratorias asistido por vibración y (ii) distribución uniforme de células exógenas en la superficie luminal de la tráquea desnuda utilizando pre-gel de colágeno I cargado de células. Además, la modalidad de imagen basada en lente GRIN confirmó la eliminación del epitelio in situ. Además, con análisis adicionales, incluyendo H&E, tricromo, pentacromo, tinción de inmunofluorescencia y SEM, confirmamos la eliminación del epitelio y el mantenimiento de la arquitectura y los componentes de las capas de tejido subyacentes. Además, las imágenes basadas en lentes GRIN de MSC exógenas recién implantadas mostraron la distribución uniforme de las células cuando se utilizó el pre-gel de colágeno I como vehículo de entrega. Por último, las células implantadas sobrevivieron y proliferaron en la tráquea desepitelizada, destacando la eficacia del biorreactor en el cultivo a largo plazo de los tejidos de las vías respiratorias con semillas celulares.

El paso crítico en el protocolo de deseptelización es crear una capa delgada de solución de detergente en la luz de la tráquea. En los protocolos actuales de descelularización, se están utilizando múltiples ciclos de productos químicos y enzimas durante un largo período, reduciendo el número de fibras de colágeno, glicosaminoglicanos (GAG), proteoglicanos y condrocitos, comprometiendo las propiedades biológicas y biomecánicas del andamio de las vías respiratorias 19,20,21. Por otro lado, la ECM proporciona señales bioquímicas y mecánicas y entornos físicos adecuados para la supervivencia, proliferación y diferenciación de células exógenas implantadas22,23. El método de deposición de película delgada descrito en este estudio utiliza una pequeña cantidad de detergente (menos de 50 μL) para la ablación del epitelio, al tiempo que permite la preservación de la capa de tejido subyacente y los componentes celulares subepiteliales. La vibración mecánica del tejido expuesto al detergente demostrada en este estudio es un procedimiento importante, ya que permite el desprendimiento y la eliminación de las células lisadas. Los restos celulares y las células parcialmente interrumpidas resultantes de la exposición del epitelio al detergente son difíciles de lavar solo inundando la tráquea con la solución de lavado. Por lo tanto, la vibración mecánica de la tráquea durante el lavado proporciona suficientes fuerzas de cizallamiento para limpiar los restos celulares de la luz traqueal.

En general, el enfoque de siembra celular basado en pre-gel puede estar influenciado por la velocidad de entrega, la viscosidad del pre-gel (que está directamente relacionada con la concentración de pre-gel), la tensión superficial y el tiempo de gelificación. En particular, durante la preparación del pre-gel, es esencial mantener la concentración de pre-gel lo suficientemente baja como para transportar el pre-gel suspendido en células en el tubo y lo suficientemente alta como para mantener las células en la superficie superior de la tráquea. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente encontrar la concentración óptima para cada pre-gel probando varias concentraciones. Además, practique la técnica de entrega, como la velocidad de entrega con células menos preciosas para garantizar la entrega exitosa del pre-gel cargado con células. Además, si bien utilizamos MSC como modelo celular para demostrar (i) la distribución de las células con pre-gel como vehículo de entrega y (ii) la capacidad del sistema de biorreactor para cultivar las células recién sembradas en la luz de la tráquea desnuda, el uso de células madre (por ejemplo, células basales) y células epiteliales primarias de las vías respiratorias en estudios futuros podría permitir estudiar la diferenciación celular y la regeneración funcional de células epiteliales24, 25. Además, los estudios futuros pueden incluir la adición de una interfaz aire-líquido (ALI) a la plataforma actual para generar estrés cortante in vivo en las células sembradas para la generación de epitelio funcional. Para agregar ALI al dispositivo actual, se puede conectar un ventilador de animales pequeños a la entrada de la tráquea para ventilar la tráquea. Además, para lograr el ALI, se puede utilizar el método de deposición de película delgada para inculcar un tapón líquido de medio de cultivo en la tráquea con semilla celular. El espesor de la película líquida se puede modular cambiando la velocidad del tapón líquido 26,27. El tapón se puede iniciar después de que las células recién sembradas se adhieran y se injerten firmemente en la luz de la tráquea.

Además, el enfoque de imágenes in situ basado en lentes GRIN utilizado en este protocolo es fundamental para confirmar la eficacia de la desepitelización y evaluar la calidad de la distribución de las células recién sembradas. A diferencia de los métodos convencionales de análisis de tejidos, como la histología y la inmunofluorescencia, que requieren diseccionar las muestras del tejido de la tráquea para su análisis, la plataforma de imágenes desarrollada en nuestro estudio permite un monitoreo rápido y no destructivo de la luz de las vías respiratorias durante la desepitelización y la entrega celular. Para mantener la tráquea esterilizada durante las imágenes in situ , asegúrese de esterilizar la lente GRIN limpiándola con IPA al 70% o etanol antes de introducirla en la luz de la tráquea. Además, para obtener imágenes de las células utilizando la lente GRIN, las células (ya sean células epiteliales traqueales endógenas o células recién implantadas) se pueden etiquetar con varios colorantes fluorescentes con diferentes longitudes de onda de excitación / emisión. Para hacer esto, asegúrese de usar el generador de luz láser apropiado para excitar las células marcadas fluorescentemente e integrar las lentes de filtro correctas en el espejo dicroico de superresolución de doble borde.

A pesar de la novedad e innovación de la desepitelización, la administración celular y los métodos de imágenes in situ , este estudio tiene varias limitaciones. Los métodos de deseptelización y administración celular descritos en este estudio son aplicables a vías respiratorias pequeñas (diámetro: menos de 3-4 mm) donde la tensión superficial es dominante. Formar un tapón líquido y crear una película delgada de la solución de deseptelización o la suspensión de pre-gel cargada con células en vías respiratorias más grandes, como la tráquea porcina y humana, o los bronquios, puede ser un desafío ya que la tensión superficial se vuelve insignificante en comparación con otras fuerzas, la gravedad en particular. Además, mediante el uso del enfoque de deposición de película delgada y la modulación del tiempo y la concentración, pudimos extirpar el epitelio con un detergente fuerte (SDS) y preservar la capa de tejido subyacente. Sin embargo, en estudios futuros, los detergentes de descelularización más leves, como el 3-[(3-cholamidopropil)-dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS)28, o la solución no detergente, como el hidróxido de sodio (NaOH)29, se pueden probar para la preservación de los componentes de ECM y el soporte de células recién implantadas. Además, la intensidad de fluorescencia de las células marcadas con CFSE se reduce con el tiempo debido a la división de las células. En nuestro estudio, las imágenes fluorescentes de MSC cultivadas en las tráqueas desepitelizadas durante 4 días mostraron una disminución sustancial en su intensidad de fluorescencia. Para el monitoreo y seguimiento prolongados de las células exógenas sembradas en los andamios de tejido, serían necesarios diferentes métodos de etiquetado celular que puedan permitir el etiquetado fluorescente permanente o a largo plazo de las células.

Prevemos que la plataforma de biorreactores guiadas por imágenes y los protocolos de eliminación y administración de células descritos en este informe pueden permitir la creación de andamios de tejido de las vías respiratorias desepitelizados que se pueden utilizar para generar los tejidos de las vías respiratorias de bioingeniería. Tales vías respiratorias in vitro pueden ofrecer un modelado in vitro de alta fidelidad de las enfermedades de las vías respiratorias humanas y la detección de medicamentos. Por ejemplo, para establecer el epitelio funcional de las vías respiratorias, las células madre basales de las vías respiratorias se pueden implantar primero en el tejido de las vías respiratorias desepitelizado30. Luego, la interfaz aire-líquido (ALI), que es crítica para la diferenciación de las células madre basales en varias células epiteliales, se puede generar dentro de la tráquea. Además, el sistema de imágenes in situ se puede modificar y utilizar para visualizar fluorescentemente el tracto respiratorio de pacientes con trastornos de las vías respiratorias pulmonares. Para ser utilizada clínicamente para evaluar los tejidos de las vías respiratorias in situ, la lente GRIN rígida se puede reemplazar con sondas de imágenes de fibra óptica flexibles para navegar por las vías respiratorias. Además, la capacidad de distribuir homogéneamente las células dentro del tracto respiratorio utilizando la siembra de células a base de hidrogel puede proporcionar una oportunidad sin precedentes para reemplazar el epitelio dañado o lesionado en pacientes. En particular, el enfoque de reemplazo celular desarrollado y utilizado en este estudio puede acelerar el tratamiento basado en células para el tratamiento de trastornos respiratorios, como la fibrosis quística y la discinesia ciliar primaria, y la reparación de los pulmones de donantes que se rechazan para el trasplante debido a la lesión grave de los tejidos de las vías respiratorias 31,32,33,34.

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Disclosures

Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Esta investigación ha sido apoyada en parte por el Programa de Investigación de la Fundación de la Sociedad Torácica Americana, la Fundación de Salud de Nueva Jersey y la Fundación Nacional de Ciencias (Premio CAREER 2143620) a J.K.; y los Institutos Nacionales de Salud (P41 EB027062) a G.V.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1× PBS Gibco, Thermo Fisher Scientific 10-010-031
3-port connector World Precision Instruments 14048-20
4-port connector World Precision Instruments 14047-10
Accelerometer STMicroelectronics IIS3DWBTR
Achromatic doublet Thorlabs AC254-150-A-ML
Aluminum pin stub TED PELLA 16111
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240062
Assembly rod Thorlabs ER1
Button head screws McMaster-Carr 91255A274
Cage cube Thorlabs C4W
Carbon double-sided conductive tape TED PELLA 16073
CFSE labelling kit Abcam ab113853
Citrisolv (clearing agent) Decon 1061
C-mount adapter Thorlabs SM1A9
Collagen I Advanced BioMatrix 5153
Conductive liquid silver paint TED PELLA 16034
Dichroic mirror Semrock DI03-R488 Reflected laser wavelengths:  473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm
Dulbecco's modified Eagle’s medium Gibco, Thermo Fisher Scientific 11965118
Female luer bulkhead to hose barb adapter Cole-Parmer EW-45501-30
Female luer to tubing barb Cole-Parmer EW-45508-03
Female to male luer connector Cole-Parmer ZY-45508-80
Fetal bovine serum Gibco, Thermo Fisher Scientific 10082147
Filter lens Chroma Technology Corp ET535/50m
Fluorescent microscope Nikon Eclipse E1000 - D
Fusion 360 Autodesk
Hex nut McMaster-Carr 91813A160
Hexamethyldisilazane (HMDS) Fisher Scientifc AC120585000
Imaging fiber SELFOC, NSG group GRIN lens
Laser Opto Engine MDL-D-488-150mW
Lens tubes Thorlabs SM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen) Thermo Fisher Scientific L3224
MACH 3 CNC Control Software Newfangled Solutions
Objective lens Olympus UCPLFLN20X
Peristaltic Pump Cole Parmer L/S standard digital pump system
Recombinant human FGF-basic PeproTech 100-18B
Retaining ring Thorlabs SM1RR
Scientific CMOS camera PCO Panda PCO Panda 4.2
Sodium dodecyl sulfate VWR 97064-472
Solidworks (2019) Dassault Systèmes
Stackable lens tube Thorlabs SM1L10
Subwoofer plate amplifier Dayton Audio SPA250DSP
Subwoofer speaker Dayton Audio RSS21OHO-4 Diaphragm diameter: 21 cm
Syringe Pump World Precision Instruments AL-4000
Threaded cage plate Thorlabs CP33
Threaded luer adapter Cole-Parmer EW-45513-81
Tube lens Thorlabs AC254-150-A-ML
Tygon Tubing Cole-Parmer 13-200-110
XY Translator Thorlabs CXY1

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References

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Bioingeniería Número 182
Biorreactor guiado por imágenes para generar tejido biodiseñado de las vías respiratorias
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